Известия РАН. Серия биологическая, 2022, № 5, стр. 495-508

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования являлись свободные эмбрионы (предличинки), личинки и мальки радужной форели (Oncorhynchus mykiss). Этапы развития рыб устанавливали в соответствии с онтогенетическими взглядами. Расса (1946). Икра на стадии глазка размещалась в один слой в деревянных лотках с сетчатым дном. Лотки находились в емкостях установки замкнутого цикла водообмена (УЗВ). Их полезный объем – 200 л. Установка в своем составе имела блоки механической и биологической очистки, охлаждения и ультрафиолетового обеззараживания воды, аэрации и озонирования. Частичную подмену воды (не более трети объема) производили дважды в неделю. Температура воды при инкубации икры составляла +6°C, увеличиваясь по мере развития рыб до +16°C. Содержание растворенного в воде кислорода поддерживали в пределах 6–9 мг/л.

С момента перехода на смешанное питание и до полной резорбции желточного мешка молодь кормили живыми науплеусами артемии (Artemiasalina) и замороженным циклопом. В дальнейшем рыба потребляла промышленный гранулированный комбикорм Gouessant T-Salmo (протеин – 42%, жир – 24%).

С началом активных локомоций рыб перемещали из лотков в аквариумы. Наблюдения за поведением рыб осуществляли в течение 2 ч в утреннее и вечернее время три раза в неделю и в течение 3 ч в дневное время – два раза в неделю. Для оценки этологических особенностей молоди применяли методы свободного наблюдения и сплошного протоколирования (Попов, Ильченко, 1990).

Длину тела рыб определяли с помощью бинокулярного микроскопа МБС – 2, снабженного окуляром с измерительной шкалой с точностью до 0.1 мм, а массу – поштучно с использованием аналитических электронных весов “Sartorius” (точность до 0.1 мг).

С целью гистологического анализа из каждой возрастной группы рыб отбирали по 3 особи (в одной пробе). За период исследований отобрано 15 проб (7 – на этапе предличинки; 6 – на этапе личинки и 2 – на мальковом). Пробы фиксировали в 10%-ном формалине. После промывки образцов от фиксатора проточной водой осуществляли их проводку через растворы желатина восходящих концентраций (7, 12.5 и 25%), после чего заливали в 25%-ный желатин и после его застывания вырезали блоки. Для уплотнения среды в течение суток блоки выдерживали в 25%-ном формалине. Делали тотальные поперечные срезы тела на уровне начала спинного плавника. Гистологические образцы толщиной 15 мкм получали на замораживающем микротоме с электрическим приводом МЗП-01 Техном, оснащенном охладителем ОМТ 28-02 Е. Окраска образцов осуществляли Суданом III (“Вектон”, Россия) и гематоксилином по Карацци (Абрис+, Россия). Для исследования полученных препаратов использовали световой микроскоп Микромед С-1 с объективами 4/0.10 160/0.17; 10/0.25 160/0.17 и S40/0.65 160/0.17. На них определяли диаметр белых гликолитических(быстрых) и красных окислительных (медленных) мышечных волокон и их плотность (Аппельт, 1959). Красные и белые волокна дифференцировались по среднему диаметру, интенсивности окраски и расположению миофибрилл. Микрофотографии получали c помощью фотоаппарата Sony Cyber-shot и обработаны с использованием программы “MicrosoftPowerPoint”.

Расчет соотношения красной и белой мускулатуры на тотальном поперечном срезе осуществлялся с помощью графической программы ImageJ.

Полученный материал обработан статистически с использованием программного обеспечения Microsoft Office Excel. Рассчитывали такие показатели как среднее абсолютное значение со стандартной ошибкой средней (M ± m), коэффициент вариации (Cv, %). Достоверность различий определял b по t-критерию Стьюдента при p ≤ 0.05 (по Пирсону).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Химический состав воды на протяжении всего экспериментального периода находился в пределах допустимых норм. Рост массы и длины рыб представлены на рис. 1 и 2. Особенность роста массы рыб в раннем постнатальном онтогенезе рыб связана с наличием желточного мешка, его резорбцией и переходом молоди сначала на смешанное, а затем и экзогенное питание. После расходования запасных питательных веществ, на последних этапах личиночного периода и мальков их рост становится более интенсивным (рис. 1).

Рис. 1.

Динамика роста массы тела рыб.

Рис. 2.

Динамика линейного роста рыб.

Рост рыб в длину происходит постоянно и постепенно без резких колебаний (рис. 2).

Соматическая мускулатура, составляющая основу аппарата движения, при онтогенетическом развитии выполняет локомоторную функцию и обеспечивает индивидуальное благополучие рыб. Она определяет многие жизненные функции, связанные с развитием респираторного, пищеварительного аппаратов, ухода от хищников и др. Ранний постнатальный онтогенез включает три этапа развития: предличиночный, личиночный и мальковый (рис. 3–5). В каждом из них происходят изменения в структуре мышечной ткани, которые связаны с определенным типом поведения (табл. 1).

Рис. 3.

Развитие радужной форели в предличиночный период (1–28-е сут с момента выклева).

Рис. 4.

Развитие радужной форели в личиночный период (32–74-е сут с момента выклева).

Рис. 5.

Развитие радужной форели в мальковый период (94–115-е сут с момента выклева).

Односуточные предличинки обладают большим желточным мешкомовальной формы, плотно прижатой к нему головой, и крупными глазами. В желточном мешке хорошо видны жировые капли. Позади головы находится хорошо выраженный грудной плавник с лепидотрихиями. Относительно небольшое, слаборазвитое тело с окаймляющей плавниковой складкой, в задней части которой наметились лепидотрихии хвостового плавника.

Прогрессивное развитие предличинок заключается в уменьшении объема желточного мешка, который по мере резорбции приобретает несколько уплощенную форму, и обособлении головы. В возрасте 11 сут (71.0 градусо-день с момента начала выклева; объем желточного мешка – 73.2% от исходного) появляются зачатки спинного и анального плавников с лепидотрихиями. Плавниковая складка постепенно редуцируется. У 22-х суточной молоди желточный мешок приобретает угловатую форму, а позади него заметны зачатки брюшных плавников (155.0 градусо-дней; остаток желточного мешка – 27.2%). В конце предличиночного периода, в 28 суточном возрасте желточный мешок практически исчезает (204.5 градусо-дней; остаток – 5.3% от исходного объема), но остаются элементы плавниковой складки в области хвостового стебля и небольшого участка между брюшными и анальным плавником (рис. 3).

В предличиночный период (с 1 по 28 сутки) наблюдается постепенное увеличение диаметров белых мышечных волокон (в 2.4 раза) (P < 0.05). Коэффициент вариации достаточно высокий и, в среднем, составляет 25.6% (пределы колебания 2.3–21.0 мкм). Наиболее интенсивный рост быстрых волокон происходит вначале постнатального онтогенеза с 1 по 4 сут (на 22.7%) и с 16 до 28 сут (на 27.1%) (табл. 2).

Белые мышечные волокна, угловатые по форме, находятся на достаточно большом расстоянии друг от друга. Наименьшая их плотность (менее 40%) у односуточной молоди. Соединительно-тканные прослойки (эндомизий) широкие, разделяют одно волокно от другого. По мере развития рыб плотность быстрых мышечных волокон повышается и достигает в конце периода 74.5% (P < 0.05). При этом прослойки эндомизия сужаются и волокна сближаются (рис. 6а, 6б).

Рис. 6.

Мускулатура радужной форели. (а): белая мускулатура предличинки (4-е сут после выклева), (б) – белая мускулатура поздней предличинки (28 сут), (в) – белая мускулатура личинки (43 сут), (г) – красная мускулатура малька (94 сут). 1 – зрелые белые волокна; 2 – молодые белые волокна; 3 – эндомизий; 4 – эпидермис; 5 – блуждающий нерв; 6 – зрелые красные волокна; 7 – липоциты. Увеличение: 600×.

Размеры красных мышечных волокон существенно меньше, чем белых (в среднем, в 5.1 раза) (P < 0.05). Медленные волокна по размерам еще более неоднородны (CV = 37.5%), чем быстрые. Среди них встречаются в различные возрастные периоды очень мелкие волокна в 8–10 раз меньше, чем самые крупные. Диаметр медленных волокон с 1 по 28 суток увеличивается в 2.8 раза, особенно интенсивно в последнюю декаду (на 78.9%) (P < 0.05). В целом, у предличинок форели рост белых и красных мышц связан с процессами гипертрофии. Площадь красной мускулатуры мала, поэтому не представляется возможным оценить объективно плотность волокон, ее образующих.

На рис. 7а показано распределение быстрых волокон в соответствии с их диаметрами. Основной группой у предличинок с 1 по 11 сут являются волокна с классовым промежутком 5–10 мкм (70–77%). В дальнейшем с 16 до 28 суточного возраста модальным классом становятся волокна размером 10–15 мкм (45–73%). Появляются также более крупные волокна с диаметром 15–22 мкм (8–23%). Доля самых мелких волокон (2–3 мкм) уменьшается от 25% (1 сут) до 0 (16 сут).

Рис. 7.

Распределение диаметров зрелых белых (а) и красных (б) волокон в предличиночный период.

Миогенез быстрых волокон происходит постепенно и в каждой возрастной стадии развития соответствует определенным структурным и морфометрическим изменениям. В первые сутки, когда предличинки лежат неподвижно, быстрые волокна тонкие, их плотность незначительна (35.5%). В процессе метаморфоза происходят хорошо выраженное (4 сут), затем менее заметное (4–11 сут) увеличение диаметров и плотности мышечных волокон, которые используются для кратковременных быстрых движений. При подготовке рыб к более активной локомоции (16–28 сут) интенсивность роста мышечных волокон существенно повышается (роение, свечки и переход на плав). Таким образом, наблюдается характерная гипертрофия быстрых волокон, обеспечивающая молоди быстрые и резкие движения.

В красных мышцах явной гипертрофии не наблюдается, поскольку в середине предличиночного периода, с 8 до 11 сут, отмечена хорошо выраженная гиперплазия. Количество самых мелких волокон существенно увеличивается (с 16 до 50%), что характерно для начала постнатального развития (44%). В конце этого периода (22 сут) мелкие полностью исчезают и появляются крупные волокна (4.0–5.5 мкм), доля которых составляет ~30% (рис. 7б). Рост медленных мышц можно определить как неравномерный, чередующихся гипертрофии и гиперплазии. В период с 1 до 8 сут при пропульсивных движениях диаметр медленных мышечных волокон фактически не изменяется. Из-за слаборазвитой красной мышцы выполнение основной ее функции продолжительного плавания проблематично. Ее доля от поперечного среза тела в области спинного плавника невелика и в среднем составляет 2.4% (рис. 8). Продолжением предличиночного периода до его окончания является рост красной мышцы за счет гипертрофии волокон. Это связано с процессом формирования красных мышц во время роения и поднятия на плав молоди для продолжительного медленного плавания при невысоких скоростях.

Рис. 8.

Доля красных мышц (в % от поперечного среза тела рыб).

Во время личиночного периода, на поздних стадиях развития молодь приобретают форму, подобную взрослым рыбам. Она имеет хорошо развитые парные и непарные плавники, респираторные органы и ротовой аппарат. Наблюдается полное отсутствие желточного мешка и переход личинок на экзогенное питание. На теле появляется специфическая пигментация, характерная для радужной форели, однако чешуйный покров еще отсутствует. Аппарат движения функционально относительно хорошо развит. У личинок осевая соматическая мускулатура, как и у предличинок, представлена в основном белыми мышцами. На протяжении двух декад (возраст 32–52 сут; 247.5–483.5 градусо-дней с момента выклева) наблюдается постепенное увеличение размеров быстрых волокон (P < 0.05). В последующие 10 сут размеры волокон существенно уменьшаются (на 9.5%) (P < 0.05). Однако личиночный период (74 сут; 815.5 градусо-дней) заканчивается хорошо выраженной гипертрофией белых волокон и их высокой плотностью по сравнению с предыдущими возрастными группами рыб. Плотность волокон повышается до 88% особенно на 74 сутки постнатального развития (в среднем за период 77.8%). Аналогичная динамика роста волокон характерна также для красных мышц личинок. Вариабельность морфометрических показателей мышечной ткани у личинок ниже по сравнению с предличинками (табл. 3).

На протяжении большей части личиночного периода (32–63 сут) модальным классом являются волокна с диаметром 15–20 мкм (52–58%), определяющие их средние размерные показатели. В возрасте 63 сут существенно возрастает доля более мелких волокон (10–15 мкм) и их средний диаметр несколько уменьшается. В финальную стадию в белых мышцах молоди увеличивается количество крупных волокон с классовыми промежутками 20–25 мкм (35%) и 25–30% (4%), что приводит к гипертрофии мышечной ткани (рис. 9а).

Рис. 9.

Распределение диаметров зрелых белых (а) и красных (б) волокон в личиночный период.

Для красных мышц характерно чередование гипертрофии и гиперплазии мышечных волокон. Наибольшая доля мелких волокон (1.5–3.0 мкм) отмечено у 32-х суточных рыб (26%). Очередное пополнение мелкими волокнами наблюдается у личинок в возрасте 63 сут. В конце личиночного периода доля этих волокон снижается до 6% и на смену им приходят более крупные 7–10 мкм и 10–13 мкм, доля которых возрастает до 30 и 20% соответственно (рис. 9б).

Вторая половина личиночного периода связана с ростом мышечной системы. Радужная форель является плотоядным по своей природе видом. Ее молодь уже на стадии личинки отличается наклонностью к хищничеству посредством каннибализма. Для этого рыбы совершают резкие рывки в сторону своих сверстников, нанося им не только повреждения спинных и хвостовых плавников, но и практически полностью их заглатывая. В соответствии с подобным поведением, для схватывания жертвы необходима хорошо развитая белая мускулатура с большим количеством сократительных элементов в виде миофибрилл, что обеспечивает увеличение размера волокон. Для постоянных продолжительных локомоций, которыми также обладают личинки форели, красные мышцы играют важную роль. Их рост связан непосредственно с чередующимися процессами гипертрофии и гиперплазии. Доля красных мышц у личинок по сравнению с предличинками увеличивается и в среднем составляет от поперечного среза тела 5.6% (рис. 8). Конечным итогом личиночного периода является повышение роли гипертрофии мышечных волокон.

В мальковый период продолжается увеличение размеров как белых, так и красных волокон (табл. 4). Гипертрофический рост в белых мышцах обусловлен повышением доли быстрых волокон классов 25–30 мкм (20%) и 30–36 мкм (~4%) (рис. 10а). Плотность белых волокон у мальков несколько ниже (79.9–80.4%), чем у старшей возрастной группы личинок (88.3%). В красных мышцах гипертрофия связана с возрастанием роли крупных медленных волокон класса 13–15 мкм (17 мкм) (рис. 10б). Доля красных мышц по сравнению с личинками несколько уменьшается (рис. 8). У мальков снижается уровень агрессивности, появляется чешуйный покров, осуществляется переход на питание искусственными кормами. В аквариумах рыбы равномерно распределяются по всей толще воды против течения. Мальки стараются удержаться в потоке воды, используя продолжительные усилия, и при необходимости осуществляют броски для схватывания корма. Подобному поведению соответствует, по нашему мнению, степень развития обеих мышечных систем молоди.

Рис. 10.

Распределение диаметров белых (а) и красных (б) волокон в мальковый период.

Наряду со зрелыми, относительно крупными, в мышцах обоих типов наблюдаются мелкие, вновь образовавшиеся молодые волокна. Молодые волокна имеют округлую форму. На ранних стадиях онтогенеза они имеют темно-синий цвет, т. к. из-за малого размера заметны в основном за счет окрашивания ядер гематоксилином. В белых мышцах это волокна, имеющие диаметр, в среднем. равный 1.6 ± 0.06 мкм, (n = 150) достигают у мальков не более 3 мкм. Они располагаются между крупными быстрыми волокнами. Как правило, каждое молодое окружено тремя и более зрелыми волокнами. Достигая диаметра 3 мкм и более, они приобретают вид зрелых быстрых волокон. Такое сочетание этих структур формирует мозаичную структуру мышечной ткани (рис. 6в). Соотношение зрелых и молодых волокон в период постнатального роста увеличивается в среднем с 1.3 до 2.6. Это свидетельствует о затухании процесса гиперплазии в быстрых мышцах мальков форели. Аналогичные волокна присутствуют в красных мышцах, однако они очень мелкие (<0.1 мкм) и не поддаются точному измерению при помощи светового микроскопа (рис. 6г).

Морфологическим особенностям и функциональному значению соматических мышц различных видов рыб, в том числе и на ранних стадиях онтогенеза, посвящено большое количество исследований (Boddeke et al., 1959; Лобынцев, 1961; Bone, 1966; Лав, 1976; Van Raamsdonk et al., 1982; Akster, 1985; Наследов и др., 1989. Kilarski, 1990; Mascarello et al., 1995; Rowlerson et al., 1995; Панов, Смирнов, 1996).

Наиболее критическими для выживания рыб являются ранние стадии постнатального онтогенеза. Предличиночный период характеризуется подготовкой всей мышечной системы к выполнению тех функций, которые должны быть обеспечены на более поздних этапах развития рыб. В это время мышцы недостаточно готовы в полной мере выполнить возложенные на них функции комплекса быстрых и медленных движений в виде свечек, роения и перехода на постоянное плавание. Раннее развитие структур, связанных с плаванием и питанием являются приоритетным, поскольку не только важны при добычи пищевых объектов, но и для избегания хищников (Osse et al., 1997).

Только, что вылупившиеся предличинки опускаются на дно, лежат и могут делать достаточно резкие движения хвостом при стимуляции. Это связано с тем, что на поздних стадиях эмбрионального развития и у только что вылупившихся предличинок мышечные волокна мало содержат сократительных элементов виде миофибрилл. Однако вскоре их объем увеличивается и волокна заполняются тесно упакованным миофибриллярным материалом (Nag, Nursall, 1972; Proctor et al., 1980; Veggetti et al., 1990; Brooks et al., 1995; Ayala et al., 1999). По этой причине, вероятно, и наблюдается четкая пауза гиперплазии непосредственно после вылупления рыб (Gibson, Johnston, 1995; Galloway et al., 1999a, 1999b; Veggetti et al., 1999).

У радужной форели оптомоторный ответ появляется на 10 сут после выклева, что демонстрируется увеличением чувствительности к низкой освещенности, а также появлением двигательных особенностей в это же самое время (Carvalho et al., 2004). По мнению некоторых исследователей, отмечается тесная связь красных мышц с развитием жабр. Это наталкивает на мысль, что красные волокна выполняют не только локомоторную функцию (EI-Fiky et al., 1987).

В личиночный период рыбы переходят полностью на экзогенное питание. Личинки располагаются по всей толще воды и держатся против течения, активно ему сопротивляясь. Продолжительное плавание у молоди данио рерио не происходит до тех пор, пока молодые красные волокна не приобретают метаболические свойства дефинитивных структур, что происходит в течение 7 суток (Van Raamdonk et al., 1982). Кроме того, красные волокна не становятся различимой популяцией до достижения форелью свободно плавающей стадии (Nag, Nursal, 1972).

Мышечная система обеспечивает необходимые функции жизнедеятельности личинок, в том числе каннибализм, который в этом возрасте (63–74 сут) сильно развит (табл. 1). Охота на соплеменников также требует определенных энергетических затрат, прежде всего, связанных с белыми мышцами.

Характерными поведенческими и морфофункциональными особенностями мальков является тесная связь с последующим периодом развития рыб – ювенальным. Агрессия по отношению к другим особям у мальков уменьшается. Рыбы равномерно распределены по всей толще воды в направлении против течения. Мышечный рост в возрасте 115 сут, по нашим данным, определяется в основном гипертрофией. В дальнейшем, по данным других исследователей, наблюдаются видовые различия по вкладу гиперплазии и гипертрофии в процессы роста рыб (Stickland et al., 1988; Vieira, Johnston, 1992; Johnston, 1994). Гипертрофический рост происходит в различные периоды постнатального онтогенеза, в том числе и на ранних стадиях развития рыб (Nathanailides et al., 1995; Alami-Durante et al., 1997).

Гиперплазия характерна для быстрорастущих рыб, особенно у личинок и ювенальных особей (Weatherley, Gill, 1984; Higgins, 1990).

Процессы роста красной мускулатуры у мальков несколько замедляются, что обусловлено рядом причин: а) разрастанием мышц спинного плавника, которые не учитывались при расчетах; б) ростом тела рыб в высоту, в результате чего увеличивается доля эпаксиальных и гипаксиальных порций быстрых мышц. Аналогичные данные получены и по другим видам рыб. Относительная редукция поверхностных боковых мышц имеет место в связи постнатальным развитием карпа (EI-Fiky et al., 1987) и нототении (Johnston, Camm, 1987).

***

Развитие в раннем постнатальном онтогенезе соматической мышечной системы находится в непосредственной связи с локомоторными поведенческими актами рыб. В предличиночный период при слаборазвитых мышцах происходит подготовка для совершения таких важных актов как “свечки” для захвата воздуха и заполнения плавательного пузыря, роения и поднятия на плав при участии быстрых и медленных мышечных волокон. В личиночный период при установлении хорошо выраженных плавательных движений повышается роль чередующихся процессов гиперплазии и гипертрофии. Мальки, как переходная стадия, приобретают локомоционные свойства, присущие ювенальным особям с хорошо функционально развитыми белыми гипертрофированными мышцами.