Известия РАН. Серия биологическая, 2022, № 5, стр. 509-521

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследованы серии срезов головного мозга 152 видов из 13 отрядов насекомых с неполным и полным превращением из коллекции препаратов автора (табл. 1). Насекомые были собраны в течение длительного срока экспедиционных и лабораторных работ автором и сотрудниками-энтомологами ИПЭЭ РАН. Надрезанные насекомые были зафиксированы в жидкости Буэна, вычлененные надглоточные ганглии залиты в парапласт, а серии срезов толщиной 7–10 мкм окрашены железным гематоксилином Гейденгайна (Ромейс, 1953), после которого хорошо видны ядра глиальных клеток. Именно по их положению и была проведена идентификация различных типов глиальных клеток.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

У исследованных поденок, тараканов, прямокрылых, палочников, уховерток и цикад (табл. 1) в слое тел нейронов головного мозга кортикальная глия была представлена только мелкими угловатыми клетками с округлыми или эллипсоидными ядрами, содержавшими хроматин в виде интенсивно окрашивавшихся зерен. Поперечник ядер был сопоставим с диаметром ядер соседних нейронов или был даже меньше него (рис. 1а, табл. 2). При использованном способе окраски препаратов цитоплазму либо вообще не выявляли, либо она была видна в виде тонких темно-окрашенных тяжиков, отходящих от околоядерной области и идущих между телами нейронов. Таким образом, клетки кортикальной глии видов насекомых указанных групп были подобны таковым, описанным ранее у американского таракана (Scharrer, 1939).

Рис. 1.

Клетки кортикальной глии в головном мозге насекомых. (а) – Acheta domesticus, (б) – Rhodnius prolixus; (в) – Triatoma maculatа; (г) – Triatoma infestans; (д) – Coreus marginatus; (е) – Chrysopa perla. CG – ядра кортикальной глии, GCG – “гигантские” ядра кортикальной глии, GCGc – цитоплазма “гигантских” клеток кортикальной глии, KC – клетки Кеньона грибовидных тел, TR – ядро трахеобласта: для рис. 1–3. Масштаб (рис. 1–3) – 10 мкм.

Поскольку у клопа R. prolixus было отмечено существование гигантской кортикальной глии, представители отряда Heteroptera были исследованы подробнее. Всего в нашем распоряжении были срезы надглоточного ганглия клопов 17 видов из 10 семейств (табл. 1). Из этого состава только у 3 видов семейства Reduviidae в слое тел нейронов мозга были найдены гигантские глиальные ядра. Во-первых, они были найдены у R. prolixus, что подтверждает их существование в центральной нервной системе (цнс) этого клопа (Wigglesworth, 1959). Однако в их мозге, по-видимому, меньше, чем в исследованном Уигглсуорсом туловищном синганглии. Так, они были обнаружены только в дорсальном протоцеребруме, где их ядро, заполненное зернистым хроматином, окружало в виде шапочки собрание клеток Кеньона грибовидного тела (рис. 1б). Во-вторых, характерные гигантские ядра, были также найдены в мозге Triatoma infestans и Triatoma maculata. Помимо ядер, отделявших клетки Кеньона от соседних нейронов, в клеточном слое мозга обоих видов Triatoma имелись и другие гигантские ядра. Распределение и структура хроматина внутри гигантских ядер у указанных видов оказалось различным. У родниуса хроматиновые зерна были более мелкими (рис. 1б), а у видов Triatoma хроматин был собран в глыбки, более мелкие у T. maculata (рис. 1в) и более крупные у T. infestans (рис. 1г).

У клопов 14 других исследованных видов, представлявших 8 семейств, гигантские ядра в кортикальном слое головного мозга обнаружены не были. Только у 3 видов (Dicranocephalus agilis из сем. Stenocephalidae и Enoplops scapha и Coreus marginatus – оба из сем. Coreidae) размер некоторых ядер клеток кортикальной глии был несколько увеличенным, но не превосходил условную границу, разделяющую “мелкие” и “гигантские” клетки кортикальной глии (рис. 1д).

В крайне таксономически разнообразном отряде сетчатокрылых был обследован только мозг имаго Chrysopa perla. В клеточной коре среди тел нейронов были обнаружены только угловатые ядра с зернистым хроматином, сопоставимые по величине с ядрами соседних нейронов (рис. 1е).

У жуков размеры ядер клеток кортикальной глии оказались очень разными. Так, было подтверждено существование у большого водолюба “гигантских” ядер кортикальной глии, впервые описанных де Лермой (De Lerma, 1949). Однако у Hydrobius fuscipes и Sphaeridium scarabaeoides из того же семейства водолюбов, равно как и у Nicrophorus vespilloides из семейства Silphidae клетки кортикальной глии были мелкими. Также небольшими размерами характеризовались клетки кортикальной глии у изученных представителей жужелиц, чернотелок и усачей.

Чтобы выяснить, имеется ли связь размера клеток кортикальной глии с таксономическим положением вида, были исследованы надглоточные ганглии жуков 34 видов из 5 семейств надсемейства Scarabaeoidea (табл. 1). В целом, за некоторыми исключениями, “низшие” скарабеоиды имеют клетки кортикальной глии малого размера (рис. 2а). Исключениями являются представители Passalidae (табл. 2) и Glaphyridae. У неопределенного представителя пассалид из южного Вьетнама среди тел нейронов клеточной коры встречались крупные ядра глиальных клеток, сечения которых достигали в длину ~40 мкм (рис. 2б). У Amphicoma vulpes сечения ядер кортикальных глиальных клеток существенно различались по величине: среди тел нейронов можно было увидеть как мелкие ядра, так и ядра с поперечником, равным приблизительно трем диаметрам соседних нейронов.

Рис. 2.

Клетки кортикальной глии в головном мозге насекомых (продолжение). (а) – Geotrupes stercorarius; (б) – не определенный жук из сем. Passalidae; (в) – Amphimallon volgensis; (г) – Polyphylla fullo; (д) – Apis mellifera; (е) – Lymantria dispar.

Среди представителей сем. Scarabaeidae исследованные виды п/сем. Aphodiinae и Scarabaeinae характеризуются мелкими клетками кортикальной глии. Также и у значительной части растительноядных скарабеид кортикальные клетки были мелкими (Serica brunnea, Miltotrogus aequinoctialis, Amphimallon volgensis, Hoplia parvula, Adoretus nigrifrons, Pentodon algerinum bispinifrons, Trichius fasciatus, Oxythyrea funesta, Tropinota hirta) (рис. 2в), а у меньшей части (Melolontha hippocastani, Polyphylla fullo, Anoxia pilosa, Phylopertha horticola, Anisoplia agricola, Pentodon algerinum bispinifrons, Cetonia aurata, Protaetia metallica) – средними по величине Наиболее крупные ядра были найдены у P. fullo и A. pilosa (рис. 2г, табл. 2). Однако ни в одном случае не были обнаружены “настоящие” гигантские клетки, которые будут далее описаны у чешуекрылых.

Для исследованных перепончатокрылых, в основном, характерными оказались мелкие клетки кортикальной глии. Исключение представляет лишь медоносная пчела, у которой в клеточной коре мозга некоторых экземпляров были обнаружены более крупные глиальные ядра (рис. 2д).

У единственного обследованного представителя скорпионниц, Panorpa communis, кортикальная глия оказалась мелкоклеточной.

Чешуекрылые – отряд насекомых, у представителей которого, как уже отмечалось, наличие гигантских полиморфных ядер в слое тел нейронов мозга и туловищных ганглиев было продемонстрировано наиболее убедительно. Чтобы проверить предположения о гигантизме клеток кортикальной глии как о черте, характерной по крайней мере для высших чешуекрылых в целом, в настоящей работе были исследованы срезы головного мозга чешуекрылых 15 видов из 9 семейств (табл. 1). У всех экземпляров были встречены типичные для чешуекрылых гигантские ядра клеток кортикальной глии. Как и у ранее исследованных видов, они частично располагались под слоем субперинейральной глии, а частично – в глубине клеточной коры. Хроматин имел зернистую структуру и равномерно заполнял ядро, либо был собран в его середине. Имелись крупные ядрышки, но их, по-видимому, в ядрах было немного, поскольку они встречались не во всех сечениях ядер (рис. 2е).

Ближайшими родственниками чешуекрылых являются ручейники, которые вместе с ними образуют надотряд Amphiesmenoptera (Kiriakoff, 1948). Поэтому в связи с широким распространением у чешуекрылых гигантизма клеток кортикальной глии было интересно узнать характеристики кортикальной глии и у ручейников. В нашем распоряжении было три вида ручейников (табл. 1). У всех них в слое тел нейронов были обнаружены гигантские ядра, которые как бы отграничивали клеточную кору от оболочки мозга или внедрялись между телами нейронов, ничем не отличаясь по форме и структуре от гигантских ядер кортикальной глии чешуекрылых (рис. 3а, табл. 2).

Рис. 3.

Клетки кортикальной глии в головном мозге насекомых (продолжение). (а) – Limnephilus flavicornis; (б) – Hydrotaea ignava; (в) – Muscina stabulans; (г, д) – Muscina levida; (е) – Limonia quadrimaculata.

Для двукрылых в настоящее время известны два размерных типа клеток кортикальной глии: Drosophila-тип, характеризующийся малой величиной клеток и Musca-тип с крупными (“гигантскими”) глиальными клетками (Grandori et al., 1951). Мы также нашли в головном мозге комнатной мухи крупные округлые ядра с хроматиновыми глыбками, часто прилегающим к ядерной оболочке, и большим ядрышком. Эти ядра располагались в толще клеточной коры и около перинейриума. Вокруг них имелся слой волокнистой цитоплазмы, либо ядра были вплотную окружены телами соседних нейронов.

Помимо комнатной мухи, такие же ядра клеток кортикальной глии были нами найдены только у других представителей сем. Muscidae (табл. 1) (рис. 3б), а также у Fannia scalaris (Fanniidae) и Scatophaga stercoraria (Scatophagidae), т.е. у представителей семейств, входящих в надсемейство Muscoidea.

Наиболее подробно структура и расположение гигантских ядер кортикальной глии были изучены у трех видов Muscina. Как и у комнатной мухи, ядра встречались как на периферии слоя клеточной коры, так и внутри нее. У периферических ядер хорошо прослеживалась окружавшая их цитоплазма (рис. 3в). Ранее была отмечена пространственная связь гигантских ядер с вторичными нейробластами грибовидных тел (Панов, 2020).

У личинки 3-го возраста ядра кортикальной глии имели очень крупные ядрышки (рис. 3д), а средний поперечник ядер равнялся ~20 мкм. У предкуколок и куколок размер ядер увеличивался, а у имаго мог достигать почти 30 мкм. На всех стадиях развития ядра были округлыми и содержали одно ядрышко, размер которого был максимальным у личинок и уменьшался у куколок и имаго. На экваториальных сечениях ядер хроматин имел вид интенсивно окрашивавшихся, четко очерченных крупных глыбок, которые прилегали к оболочке ядра (рис. 3в). На тангенциальных срезах ядер, проходящих через их “горбушки”, было видно, что эти глыбки хроматина представляют собой фрагменты четковидных структур – политенных хромосом, (рис. 3г). У всех трех видов Muscina ни у личинок, ни в ходе метаморфоза не было найдено делений ядер клеток кортикальной глии.

У всех остальных 40 видов, относящихся к 27 семействам длинноусых и короткоусых двукрылых (табл. 1), кортикальная глия была мелкоклеточной (рис. 3е), а гигантские ядра кортикальной глии обнаружены не были.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Проведенное исследование головного мозга 152 видов, представляющих 13 наиболее многочисленных по видовому составу отрядов класса насекомых, показало, что основным размерным типом кортикальной глии является мелкоклеточная глия, морфологические, функциональные и молекулярно-генетические характеристики которой исследованы в последние годы у дрозофилы (Hartenstein, 2011). В туловищном синганглии дрозофилы в эмбриональное время клетки кортикальной глии, 6–8 на нейромер, образуются в результате делений четырех нейроглиобластов (Altenhain, 2015). Такое же число клеток кортикальной глии сохраняется у поздних эмбрионов и новорожденных личинок, но потом клетки начинают митотически делиться, и их число существенно возрастает. У домового сверчка Acheta domesticus, также имеющего мелкоклеточную кортикальную глию, в нимфальное время ее клетки митотически делятся, как и клетки нейропилярной глии, в ритме линек. При этом пик митотической активности приходится на конец третьей – начало четвертой четверти межлиночного периода (Панов, 1962), когда у насекомых достигает пика титр линочного гормона.

Как показало настоящее исследование широкого круга насекомых, “гигантизм” кортикальной глии – явление, достаточно редко встречающееся либо у отдельных видов, либо характерное для систематических групп различного ранга. При этом можно выделить два типа гигантизма. Первый тип, который характеризуется очень большими ядрами сложной формы, заполненными многочисленными мелкими зернами хроматина, наиболее полно представлен у чешуекрылых. Впервые такие гигантские ядра были описаны у мельничной огневки (Schrader, 1938), однако автор посчитал их ядрами трахеолярных клеток. Позже у китайского дубового шелкопряда Antheraea pernyi в клеточном слое туловищных ганглиев и мозга были найдены гигантские ядра двух категорий, различавшихся по структуре. Одни из них, действительно, были ядрами трахеолярных клеток, тогда как другие – ядрами гигантских кортикальных глиальных клеток (Панов, 1963).

У эмбрионов дубового шелкопряда в момент образования нейрилеммы непосредственно под ней, а также среди тел нейронов, были обнаружены немногочисленные эллипсовидные ядра, которые на более поздних этапах эмбриогенеза начинали отличаться от ядер нервных клеток неправильными очертаниями и равномерным распределением в ядре зерен хроматина. Ни у эмбрионов, ни у гусениц не встречались деления этих ядер. Вместе с тем, они интенсивно росли, становясь у взрослых гусениц самыми крупными клеточными ядрами как в мозге, так и в туловищных ганглиях.

Удалось установить лишь один период деления гигантских глиальных клеток, приходившийся на первые дни куколочного развития. В это время в поверхностном слое ганглиев в довольно большом числе встречались фигуры огромных митозов на стадии метафазы (Панов, 1963).

Существование гигантских клеток кортикальной глии у чешуекрылых было затем подтверждено при изучении постэмбрионального развития нервной системы у бабочки-монарха Danaus plexippus plexippus. У него также было найдено, что гигантские кортикальные глиальные клетки растут, не делясь, в течение личиночного периода развития, но вступают в митоз в начале метаморфоза (Nordlander, Edwards, 1969). При этом, как у китайского дубового шелкопряда, так и у бабочки-монарха были встречены гигантские митозы только в метафазе. Поэтому дальнейшая судьба вступивших в митоз гигантских кортикальных глиальных клеток осталась неизвестной.

В переднегрудном ганглии табачного бражника были также обнаружены гигантские клетки кортикальной глии, которые в период метаморфоза вступали в митоз, причем наблюдались даже мультиполярные митозы. Одновременное увеличение числа гигантских ядер, сопровождавшееся уменьшением их размеров, позволило предположить, что кариокинез завершается формированием дочерних ядер (Cantera, 1993).

Существует большая литература по проблеме связи размеров ядер со степенью их плоидности, которая содержит свидетельства как наличия такой связи, так и ее отсутствия (Бродский, Урываева, 1981). В современных обзорах говорится о существовании такой связи (Edgar, Orr-Weaver, 2001). Большие размеры ядер гигантской кортикальной глии и обилие хроматинового материала в них позволили предположить их полиплоидную природу (Johansson, 1957; Панов, 1963; Nordlander, Edwards, 1969). Это предположение было подтверждено Нордлендер и Эдвардсом, наблюдавшими в личиночное время многократные циклы включения H³-тимидина в гигантские ядра кортикальной глии бабочки-монарха без их последующих делений.

Случаи инструментально доказанной полиплоидности клеток глии цнс насекомых единичны. Так, относительно недавно было обнаружено, что клетки субперинейральной глии D. melanogaster, входящей в состав гематоэнцефалического барьера, являются полиплоидными, и увеличение размера клеток субперинейральной глии в результате полиплоидизации необходимо для поддержания в целостности межклеточных соединений, образующих гематоэнцефалический барьер. (Unhavaithaya, Orr-Weaver, 2012). В цнс имаго дрозофилы было обнаружено увеличение числа клеток с содержанием ДНК от 4С до более чем 16С по мере старения насекомого. При идентификации типа клеток в препаратах диссоциированной центральной нервной системы с помощью молекулярных маркеров было обнаружено, что за 2 нед. имагинальной жизни 6–7% глиальных клеток в целом начинают содержать более 2С ДНК (Nandakumar et al., 2020).

Деления полиплоидных клеток были найдены в кишечнике личинок двукрылых. Фокс с сотр. (Fox et al., 2010) обнаружили митотические деления октоплоидных клеток в задней кишке метаморфизирующей личинки дрозофилы, и на этом основании они сделали вывод, что вступление клеток в эндоцикл не является необратимым и не исключает возможности их последующего размножения с помощью митоза. По-видимому, это справедливо и для предположительно высокополиплоидных клеток кортикальной глии чешуекрылых, описанных в данной работе.

Вторым, особым видом полиплоидии является политения. В этом случае возникающие в ходе повторяющихся эндоциклов хромонемы не расходятся, а остаются тесно связанными, в результате чего формируются гигантские политенные хромосомы (Stormo, Fox, 2017). Политенными являются клетки ряда внутренних органов некоторых видов двукрылых и других насекомых (Бродский, Урываева, 1981).

На гистологических срезах политенные хромосомы обычно выглядят как крупные интенсивно окрашенные глыбки хроматина, плотно прилегающие к ядерной оболочке. Только на поверхностных сечениях ядер бывает видно, что эти глыбки объединены в четковидные цепочки – политенные хромосомы. До сих пор имелось только одно свидетельство присутствия политенных клеток в нервной системе насекомых. У Drosophila virilis политенные ядра были найдены в давленых препаратах туловищного синганглия личинки, однако их принадлежность к какому-либо определенному типу клеток установлена не была (Makino, 1938). Фактически политенные хромосомы у глиальных клеток комнатной мухи было впервые описаны Грандори с соавт. (Grandori et al., 1951), однако как таковые они квалифицированы не были. В высшей степени вероятное их присутствие в ядрах клеток кортикальной глии у нескольких видов мускоидных двукрылых – третий случай обнаружения политенных клеток в центральной нервной системе насекомых.

У насекомых большинство органов, содержащих клетки с политенными хромосомами, являются “личиночными”, дегенерирующими в ходе метаморфоза. Исключение составляют только мальпигиевы сосуды и трофоциты яичников (Бродский, Урываева, 1981). К таким переживающим метаморфоз структурам с политенными хромсомами относятся, очевидно, и клетки кортикальной глии, описанные у мускоидных двукрылых в настоящей работе. При этом ни в одном случае у них не было отмечено митозов в ходе постэмбрионального развития. Невозможность или большая редкость вхождения клеток с политенными хромосомами в митотический цикл объясняется особенностями структуры политенных хромосом и ошибками при редупликации генома в клетках этого типа (Edgar, Orr-Weaver, 2001)

Проведенная работа лишь обрисовывает общую картину распространения в кортикальной глии насекомых гигантизма клеток и, вероятнее всего, лежащей в ее основе их полиплоидности. Остается неизвестным, почему в отдельных группах насекомых разного таксономического ранга (от подсемейственного и до надотрядного) происходит переход от пролиферации исходных клеточных элементов к значительному росту клеток кортикальной глии без их умножения. Обычно считается, что при полиплоидизации, ведущей к росту клеток и увеличению их синтетических потенций, происходит экономия времени и средств по сравнению с ростом за счет пролиферации (Бродский, Урываева, 1981). По сравнению с митотическими циклами, сопровождающимися разрушением ядерной оболочки, формированием веретена, цитокинезом, восстановлением ядерной оболочки и проч., при эндорепликации сохраняются структура и специфическое функционирование полиплоидизирующихся клеток. Так, необходимостью непрерывного специфического функционировнния объясняется, например, полиплоидизация у дрозофилы клеток субперинейральной глии, формирующей гематоэнцефалический барьер (Unhavaithava, Orr-Weaver, 2012).

Что же касается кортикальной глии, то функциональные и морфогенетические причины случаев ее гигантизма и предполагаемой полиплоидной природы остаются неизвестными. Интересно отметить, что нейропилярная глия всегда бывает мелкоядерной. Остается неясным, связан ли гигантизм кортикальной глии с общей тенденцией морфогенетических процессов в нервной системе насекомых той или иной группы. О возможности существования такой связи говорят лишь единичные находки. Например, при исследовании состава мозговых нейросекреторных клеток были выделены 2 группы насекомых. У насекомых первой группы число нейросекреторных клеток росло в течение постэмбрионального развития за счет деятельности нейробластов. У насекомых второй группы медиальные нейросекреторные клетки головного мозга были относительно малочисленны, и их число, в основном, стабилизировалось уже к началу постэмбриогенеза. Интересно отметить, что у исследованных насекомых первой группы нейросекреторные клетки оставались диплоидными, а у имаго одного из насекомых второй группы они оказались тетраплоидными (Панов, Маршак, 1968). Именно насекомые с гигантскими клетками кортикальной глии входят в состав насекомых со стабильным составом медиальных нейросекреторных клеток головного мозга.