Известия РАН. Серия физическая, 2020, T. 84, № 11, стр. 1597-1600

ВВЕДЕНИЕ

Молекулярно-генетические исследования клеток крови играют очень важную роль с современной медицине, и в частности, гематологии. Выявление генетических нарушений или изменений в реализации генетической информации является важным диагностическим и прогностическим фактором при лечении заболеваний крови. Так, хронический миелолейкоз в 95% случаев диагностируется по присутствию в опухолевых клетках особой химерной молекулы РНК BCR-ABL1, количество которых позволяет судить о степени прогрессии заболевания и выраженности ответа на лечение [1]. Большое количество различных генетических модификаций являются определяющими при исследованиях острых лейкозов, миелопролиферативных заболеваний и др. [2]. Кроме того, выявление мутаций в ДНК злокачественных клеток крови позволяет подобрать индивидуальную схему лечения для каждого случая заболевания [3, 4].

Выделение нуклеиновых кислот – ДНК или РНК – первый и очень важный этап большинства молекулярно-генетических исследований. От количества и качества очищенной молекулы зависит валидность результата исследования и правильность сделанных выводов. На сегодняшний день, описано несколько способов выделения нуклеиновых кислот из крови, как внутриклеточных молекул, так и нуклеопротеиновых комплексов, циркулирующих вне клеток [5]. Они учитывают особенности материала, но каждый имеет свои достоинства и недостатки [6]. Одним из перспективных среди них является использование магнитных частиц с особыми покрытиями, позволяющими захватывать молекулы нуклеиновых кислот. Этот метод обладает преимуществами меньших затрат времени (в сравнении с осаждением), меньшей токсичностью реагентов (в сравнении с фенол-хлороформной экстракцией), меньшими требованиями к лабораторному оборудованию (отсутствие необходимости центрифугирования). При этом использование магнитных частиц позволяет добиваться получения нуклеиновых кислот высокой чистоты для исследований высокопроизводительными и требовательными методами (микрочипирование, секвенирование нового поколения). Наконец, использование магнитов открывает возможности для автоматизации процессов выделения нуклеиновых кислот. Однако, несмотря на преимущества и активные исследования [7], на сегодняшний день в России реагенты для выделения нуклеиновых кислот на магнитных частицах разрабатываются недостаточно, оставаясь недооцененными, подобно методу безлинзовой микроскопии крови [8], и многие наборы приобретаются из зарубежных стран, что повышает их стоимость. Основными трудностями, которые необходимо преодолевать при использовании данного метода, являются способность магнитных наночастиц к агломерации [9], что снижает их функционально активную площадь для захвата молекул нуклеиновых кислот, а также способность соединений железа влиять на протекание последующих реакций с очищенной молекулой.

Целью настоящей работы являлась разработка доступной технологии синтеза магнитных наночастиц железа для выделения ДНК из клеток крови для проведения молекулярно-генетических исследований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для получения частиц магнетита были использованы хлориды железа FeCl₃ и FeCl₂ ∙ 6H₂O в молярном соотношении 2 : 1, в соответствии с методикой, описанной Пертаковой А.В. с коллегами [10]. Осаждение частиц магнетита происходило при защелачивании раствора аммиачной водой (25%) до pH 10 при помощи быстрого введения щелочи тонкой струей через иглу шприца. После внесения аммиачной воды емкость с реакционной смесью герметично закрывали и инкубировали при непрерывном перемешивании 30 мин.

Для сепарации полученного осадка использовали неодимовый магнит. Частицы стабилизировали 5 мМ цитратом натрия (pH 6–7) и отмывали деионизованной водой до получения чистой промывной жидкости.

В качестве доступного покрытия для магнитных наночастиц был выбран оксид кремния в виде тетраэтоксисилана (ТЭОС, TEOS). Для покрытия частицы магнетита суспендировали в смеси этанол : вода (9 : 1) в концентрации 20, 10 мг/мл и перемешивали в течение 10 мин. Затем вносили TEOS из расчета 70 мкл на 200 мг наночастиц.

При нанесении покрытия использовалось два режима обработки: разбиение ультразвуком в режиме кавитации (в течение 1 ч) и механическое перемешивание. Все варианты магнитных наночастиц с покрытием оксидом кремния отмывали дистиллированной водой с сепарацией на неодимовом магните и хранили в ультрачистой воде (18 мОм/см³) в концентрации 400 мг/мл.

Полученные образцы исследовались с помощью просвечивающего электронного микроскопа Hitachi HТ7700 и вакуумного Фурье-спектрометра VERTEX 80V (BRUKER) в средней ИК области 380–4000 см^–1 центра коллективного пользования Красноярского научного центра СО РАН.

Для выделения ДНК при помощи разработанных магнитных наночастиц использовали набор реагентов “ДНК-собр-В” (AmpliSens, Москва, Россия) в соответствии с протоколом производителя, но используя магнитные наночастицы вместо поставляемого в наборе силикатного сорбента. Выделение ДНК производили из лейкоцитов, полученных из 130 мкл крови человека. Количество и качество геномной ДНК оценивали при помощи электрофореза в 1.5% агарозном геле.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты исследования методом просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения наночастиц Fe₃O₄@SiO₂ полученных при механическом перемешивании представлены на рис. 1. В процессе покрытия оксидом кремния при механическом перемешивании произошло образование конгломератов наночастиц железа с общей силикатной оболочкой. Средний размер частиц при использовании механического перемешивания составляет ~10 нм, однако, за счет агрегации, общий размер частицы с покрытием увеличился до сотен нм. Согласно дифракционному изображению наночастицы представляют собой магнетит со структурой шпинели.

Рис. 1.

Изображения, полученные с помощью просвечивающего электронного микроскопа высокого разрешения наночастиц Fe₃O₄@SiO₂ синтезированных при механическом перемешивании: (а) внешний вид частиц; (б) картина микродифракции.

На рис. 2 представлен ИК–Фурье спектр наночастиц Fe₃O₄@SiO₂, полученных при механическом перемешивании, в сравнении со спектром Fe₃O₄. В спектре образцов наночастиц Fe₃O₄@SiO₂ мы наблюдаем появление очень сильного колебания с максимумом 1091 см^–1, которое относится к валентным ассиметричным колебаниям силаксановых групп (ν_as Si–O–Si) [11]. В спектрах, исследуемых образцов валентное колебание ν–ОН образует интенсивную полосу в области 3200–3600 см^–1. Положение и характер этой полосы зависит от участия гидроксильной группы в водородной связи, в нашем случае широкая и слабоструктурированная полоса свидетельствует о большом разнообразии состояний молекул воды в образцах. Полоса деформационных колебаний воды δ–ОН расположена в области 1600–1650 см^–1. Слабые колебания 950 и 800 см^–1 в спектре наночастиц Fe₃O₄@SiO₂ относится к деформационным и валентным колебаниям силанольных групп Si–OН соответственно рис. 2а. Для полос с частотами менее 600 см^–1 довольно трудно провести соотнесение с конкретными колебаниями, но они так или иначе связаны с колебаниями связей Fe–O. Также известно, что колебания связей Fe–O и Si–O в их оксидных соединениях различаются незначительно. Отсутствие полосы поглощения ~3700 см^–1 свидетельствует об успешном модифицировании по свободным силанольным группам. Анализ инфракрасных спектров, позволяет утверждать, что силоксановые группы принимают участие в процессах связи между магнитными частицами Fe₃O₄ и слоем кремнезема, а силанольные группы наиболее активны на поверхности и являются химически активными для образования ковалентной связи.

Рис. 2.

ИК-Фурье спектры при комнатной температуре наночастиц Fe₃O₄@SiO₂ (а) и Fe₃O₄ (б).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При выделении ДНК частицами для изготовления покрытия которых использовалось механическое перемешивание было получено количество ДНК, сравнимое таковым при использовании коммерческого набора с силикатным сорбентом (рис. 3а). Однако на начальных этапах апробации при оценке качества полученной ДНК на электрофорезе отмечалось изменение свойств очищенной молекулы, отражаемое в виде неполного вхождения ДНК в агарозный гель (рис. 3). Это может быть связано с дозозависимым влиянием магнитных наночастиц железа на молекулы ДНК, способными взаимодействовать с основаниями молекулы и вызывать изменения ее структуры [12], либо с наличием посторонних примесей в растворе. Преодоление повреждающего действия магнетита на молекулы живого организма описано в литературе, и для его преодоления предлагаются химические модификации наночастиц при синтезе [13, 14], однако в настоящей работе при работе с отдельными молекулами была предпринята попытка избегания дополнительных компонентов. И уже при уменьшении количества вносимых при выделении магнитных частиц с 18 до 15 мг в образец эффект влияния магнитных частиц был заметно снижен: на электрофорезе отмечалось равномерное вхождение очищенной ДНК в агарозный гель (рис. 3). Количество ДНК, выделенной наночастицами, при изготовлении покрытия которых, использовался ультразвук, было значительно меньше (рис. 3) и в отдельных экспериментах приравнивалось к следовому, несмотря на ожидаемое уменьшение агрегации и увеличение отношения площади поверхности силикатного покрытия к объему частиц. Причины такого эффекта требуют более тщательного изучения, однако, в силу отсутствия желаемого результата при выделении ДНК, в настоящей работе более подробное исследование этих частиц не производилось. Однако описанное ранее влияние акустической кавитации на структуру частиц ферригидрита позволяет предполагать подобные процессы и в данном случае [15].

Рис. 3.

Электрофорез в агарозном геле очищенной геномной ДНК, выделенной при помощи набора реагентов ДНК-сорб В с использованием различных сорбентов: коммерческий силикатный сорбент (с1-3), магнитные наночастицы, покрытые оксидом кремния при механическом перемешивании при внесении в пробу 18 мг (мп1) и 15 мг (мп2, мп3) наночастиц; магнитные наночастицы, покрытые оксидом кремния при участии ультразвука (му1). гДНК – геномная ДНК. 50kb – ДНК маркер.

Таким образом, получение магнитных наночастиц оксида железа для эффективного выделения ДНК в лабораторных условиях возможно без использования ультразвуковой дезагрегации частиц, при помощи простого механического перемешивания. При этом, снижение влияния наночастиц железа на ДНК возможно контролировать при помощи изменения количества частиц.