Известия РАН. Серия физическая, 2020, T. 84, № 2, стр. 188-191

Биологические барьеры (кожа, эпителий кишечника, гематоэнцефалический барьер и т.д.) играют колоссальную роль в поддержании целостности и жизнеспособности живых организмов. Моделирование таких барьеров in vitro чрезвычайно важно для разработки новых лекарственных препаратов и поиска способов их эффективной доставки.

Чаще всего моделирование осуществляется с помощью специальных мембранных вставок, на которых выращивается один или несколько слоев клеток. Для воссоздания параметров микроокружения ткани используются различные микрофлюидные устройства, моделирующие кровоток с помощью циркулирующего течения питательной среды. При этом на всех этапах культивирования клеток необходимо иметь возможность неинвазивным образом контролировать их жизнеспособность и барьерную функцию [1].

Классическим методом контроля целостности клеточного монослоя является измерение трансэпителиального сопротивления (transendothelial electrical resistance, TEER) [2]. Интактный монослой, как правило, имеет сопротивление порядка нескольких кОм [2], что существенно превосходит сопротивление культуральной среды между электродами. Резкое падение TEER обычно свидетельствует о нарушении целостности барьера. В большинстве существующих коммерческих решений измерения осуществляются на частоте порядка 12.5 Гц, для того чтобы избежать экранировки электродов при постоянном токе [3]. Для измерений в них обычно используется внешний электрод, который погружается в ячейку для культивирования клеток. Такой подход оказывается малопригодным для микрофлюидных устройств, так как требует извлечения мембранной вставки, что нарушает стерильность и микроокружение клеток. Кроме того, измерение импеданса в некотором диапазоне частот и последующий анализ полученных спектров позволяет получить более точные результаты по сравнению с классическим способом измерения TEER на одной частоте [4].

В данной работе решалась задача поиска оптимальной геометрии электродов, встроенных в измерительную ячейку микрофлюидного чипа (рис. 1). Требовалось подобрать такую геометрию, которая была бы максимально простой в изготовлении, обеспечила бы необходимую точность измерений, не влияя при этом на стерильность, объем циркулирующей среды и доступность клеточного монослоя для оптических методов исследования.

Микрофлюидный чип был разработан на базе устройств, совместимых с микробиореактором “Homunculus”, созданных ранее нашей научной группой [5] (рис. 1). Он содержит замкнутый микроканал и три лунки, в две из которых могут быть вставлены мембранные вставки HTS Transwell (Corning, США), предназначенные для культивирования барьерных тканей. Центральная лунка предназначена для проведения сопутствующих измерений. Питательная среда приводится в движение встроенным перистальтическим микронасосом (рис. 1) [6]. Контроль целостности монослоя предполагалось проводить с помощью разработанного нашей научной группой прибора для импедансной спектроскопии.

Для повышения точности измерений было решено использовать четырехэлектродную измерительную схему [7]. Рабочий (WE) и один из сенсорных электродов (SE2) помещаются в пробку, закрывающую ячейку. Для положения противоэлектрода (CE) и еще одного сенсорного электрода (SE1) возможны различные варианты, однако для обеспечения приемлемой точности измерений измеренное сопротивление среды между электродами и емкость системы электродов не должны превосходить сопротивление и емкость клеточного монослоя (единицы кОм и единицы мкФ [8]).

При расчете измеряемого сопротивления среды и емкости системы электродов предполагалось, что среда электронейтральна и изотропна. Распределение потенциала в системе в этом случае описывается уравнением Лапласа с граничными условиями, соответствующими ненулевому постоянному потенциалу на рабочем электроде и нулевому потенциалу на противоэлектроде (заземление). На сенсорных электродах было задано условие плавающего потенциала [9]. Точные аналитические решения подобных задач известны только для ограниченного числа геометрий [10], поэтому поставленная задача была решена численно. Плавающий потенциал на сенсорных электродах задавался так, как это описано в работе [9]: при численном решении электрод заменялся диэлектриком с очень большой (бесконечной) по сравнению со средой диэлектрической проницаемостью. Окончательно, решаемая краевая задача имеет следующий вид:

где Ω_m – область, занятая средой, рассматриваемая область; Ω_el – область сенсорных электродов; Γ_WE, Γ_CE, Γ_SE1, Γ_SE2 – границы между средой и соответствующим электродом; $\vec {n}$– внешняя нормаль к поверхности; ε – диэлектрическая проницаемость среды, ${{\varepsilon }_{{el}}} \to \infty $ − “диэлектрическая проницаемость” сенсорных электродов; φ_WE и φ_CE – потенциалы рабочего и противоэлектрода соответственно; φ_el – потенциал в области, занятой сенсорными электродами. В результате численного решения были получены значения потенциала u_iв узлах сетки. Пример численного решения этой задачи для двух из рассматриваемых конфигураций электродов представлен на рис. 2. Приведены распределения потенциала с эквипотенциальными линиями и электрическое поле (длина векторов на рисунке не пропорциональна напряженности поля) в поперечном сечении измерительной ячейки.

Компоненты вектора напряженности электрического поля определялись численным дифференцированием потенциала, после чего суммарный ток, текущий через рабочий электрод, вычислялся в соответствии с дифференциальным законом Ома. Измеряемое сопротивление среды затем определялось как отношение разности потенциалов между сенсорными электродами к суммарному току через рабочий электрод.

При расчете емкости суммарный заряд на рабочем электроде определялся из теоремы Остроградского–Гаусса, а соответствующая емкость затем вычислялась как отношение этого заряда к разности потенциалов между рабочим и противоэлектродом.

Во всех расчетах предполагалось, что на рабочий электрод подается напряжение 100 мВ. Электрические характеристики были взяты для натрий-фосфатного буфера, проводимость которого составляет 1.5 См ∙ м^–1, а диэлектрическая проницаемость – 80 [11]. Значения проводимости варьируются у разных производителей в диапазоне 1.1–2.2 См · м^–1, поэтому расчет дает возможность оценить порядок величины, но не ее точное значение.

Наиболее удобной для изготовления и практического использования является конфигурация, при которой все четыре электрода стержневые и располагаются в соседних лунках микрофлюидного устройства.

Расчетное сопротивление среды и емкость электродов в этом случае составили 150 кОм и 0.003 пФ соответственно. Столь высокое значение сопротивления делает невозможным применение такой конфигурации электродов. Существенно уменьшить вклад среды в импеданс можно, отказавшись от вставки электродов сверху устройства и нанося их на стекло так, чтобы один из сенсорных электродов и противоэлектрод были расположены в ячейке непосредственно под рабочим электродом. Были рассмотрены два варианта геометрии: в одной из них оба электрода представляют собой одинаковые параллельные полоски (рис. 2а), в другой – имеют форму, близкую к концентрическим окружностям (рис. 2г). Для обоих этих вариантов дополнительно была исследована зависимость сопротивления и емкости от угла поворота верхних стержневых электродов. Было показано, что в обоих случаях сопротивление среды не превышает 150 Ом, а емкость − единиц пФ, что существенно меньше ожидаемых значений для клеточного монослоя. При этом было показано, что геометрия с круговыми электродами в силу своей симметрии приводит к существенно меньшим вариациям измеряемых значений емкости и сопротивления, а электрическое поле внутри измерительной ячейки оказывается более однородным, чем в случае одинаковых параллельных электродов.

На основе проведенного анализа было принято решение использовать концентрические электроды. Экспериментальные измерения импеданс-спектров в пустой ячейке, проведенные в растворе PBS pH 7.2 (Gibco) при комнатной температуре в диапазонах частот от 10 Гц до 1 кГц с шагом 10 Гц и от 1 до 100 кГц с шагом 1 кГц, дали результаты порядка сотен Ом для сопротивления и единицы пФ для емкости в зависимости от угла поворота верхних стержневых электродов, что согласуется с теоретическими оценками. Дальнейшие эксперименты с клетками [12] показали, что предложенная геометрия электродов позволяет с достаточной точностью измерять импеданс-спектры клеточного монослоя.

Проведено математическое моделирование распределения потенциала и напряженности электрического поля в ячейках для культивирования монослоя клеток с различными геометриями встроенных электродов. Исходя из анализа полученных данных была выбрана геометрия электродов для измерительной ячейки, которая хорошо подходит для интеграции в микрофлюидное устройство и позволяет исследовать целостность клеточного монослоя неинвазивными методами. Теоретические оценки были подтверждены экспериментально. Разработанное в результате микрофлюидное устройство впоследствии успешно применялось для измерений импеданс-спектров клеточного монослоя.

Исследование выполнено при поддержке РНФ (грант № 16-19-10597).