1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Известия РАН. Серия физическая
  4. T. 85, № 8, 2021

Известия РАН. Серия физическая, 2021, T. 85, № 8, стр. 1070-1073

Изучение биогибридных материалов на основе биополимеров и карбоната кальция методами растровой электронной микроскопии

А. А. Мельникова 1, *, Р. А. Камышинский 1, 2, А. В. Комова 1, А. П. Руденко 1, З. Б. Намсараев 1

1 Федеральное государственное бюджетное учреждение “Национальный исследовательский центр “Курчатовский институт”
Москва, Россия

2 Федеральное государственное учреждение “Федеральный научно-исследовательский центр “Кристаллография и фотоника” Российской академии наук, Институт кристаллографии имени А.В. Шубникова
Москва, Россия

* E-mail: annfairstar@mail.ru

Поступила в редакцию 12.03.2021
После доработки 05.04.2021
Принята к публикации 28.04.2021

Полный текст (PDF)

Аннотация

Получены новые типы биогибридных материалов, изготовленные с использованием карбонат-образующих бактерий Sporosarcina pasteurii и органического матрикса. В качестве органического матрикса использовалась бактериальная целлюлоза, полученная с помощью бактерий Komagateibacter xylinus, нити зеленых водорослей Aegagropila linnaei и различные виды биополимеров. Морфология полученных материалов охарактеризована методами растровой электронной микроскопии.

ВВЕДЕНИЕ

Биогибридные материалы – композиты, состоящие из различных биологических компонентов, таких как биополимеры, клетки и ткани; а также минералов, керамики, металлов и их оксидов [1]. Примерами природных биогибридных материалов являются известковые и кремниевые образования микроводорослей, раковины моллюсков, зубы и кости животных. Например, зубы морских улиток, представляющие собой сложный композит органического матрикса и гётита, обладают наибольшей прочностью среди всех материалов биологического происхождения [2]. Также в последние годы стала широко использоваться способность микроорганизмов к образованию минералов карбоната кальция для получения таких биогибридных материалов, как биоцемент и самовосстанавливающийся бетон [3].

Изучение природных биогибридных материалов, состоящих из органических соединений и карбоната кальция, показывает, что по своей прочности они превосходят чистый карбонат кальция на 2–3 порядка [4]. Такая прочность достигается благодаря особому расположению органического матрикса относительно минеральной фазы и иерархической организацией биокомпозита от нано- до макроуровня. Материалы подобного уровня организации пока не удается создать искусственно, поэтому разработка таких природоподобных технологий представляет значительный интерес [5, 6].

Одним из способов получения биогибридных материалов является использование комбинаций из различных видов микроорганизмов, способных к образованию минералов и биополимеров. Очевидным, но ранее не использовавшимся способом получения биогибридных материалов, является комбинация бактерий, способных к образованию бактериальной целлюлозы, и бактерий, способных к образованию минералов карбоната кальция. Продукция бактериальной целлюлозы хорошо изучена у бактерий Komagataebacter xylinus, ранее известных под устаревшими названиями Acetobacter xylinum и Gluconacetobacter xylinus [8]. Эта бактерия способна образовывать нити целлюлозы диаметром около 50 нм, при этом в состав нитей не входит лигнин, что обуславливает отличия получающегося материала от лигноцеллюлозы древесного происхождения. Способность к образованию минералов карбоната кальция известна у бактерий Sporosarcina pasteurii, которые способны разлагать мочевину при помощи фермента уреазы, при этом в ходе реакции происходит образование углекислоты, реагирующей с присутствующими в среде ионами кальция [3]. Еще одним новым способом получения органического матрикса для образования биогибридных материалов является использование нитчатых водорослей рода Aegagropila, ранее известного как Cladophora. Эти водоросли образуют ветвящиеся нити диаметром 50–200 мкм с высоким содержанием наноцеллюлозы [9].

Целью данной работы являлось получение различных видов биогибридных материалов с использованием карбонат-образующих бактерий Sporosarcina pasteurii и различных типов органического матрикса: бактериальной целлюлозы, нитей зеленых водорослей и биополимеров альгината и агара, и их исследование методами растровой электронной микроскопии.

МЕТОДЫ

Используемые организмы и условия их культивирования

Для получения кристаллов карбоната кальция во всех экспериментах использовался штамм бактерии Sporosarcina pasteurii ВКПМ-11089, способный разлагать мочевину с использованием уреазы. Клетки Sporosarcina pasteurii ВКПМ-11089 культивировали на модифицированной среде ATTC 1376 следующего состава: дрожжевой экстракт – 20 г, трис(гидроксиметил)аминометан – 15.75 г, дистиллированная вода – 1 л, pH 9. Штамм культивировали при температуре 33°С и перемешивании на шейкере Thermo Scientific MaxQ 2000 с частотой колебаний 125 об./мин.

Для получения матрикса биогибридного материала №1 был использован штамм бактерии Komagataebacter xylinus ВКПМ В-12431, способный продуцировать бактериальную целлюлозу. Komagataebacter xylinus ВКПМ В-12431 культивировали на среде Hestrin-Shramm следующего состава: глюкоза – 20 г, пептон – 5 г, дрожжевой экстракт – 5 г, лимонная кислота – 1.15 г, гидрофосфат натрия – 5 г, дистиллированная вода – 1 л. Штамм культивировали при температуре 33°С и перемешивании на шейкере Thermo Scientific MaxQ 2000 с частотой колебаний 125 об./мин.

Для получения матрикса биогибридного материала № 2 использовалась биомасса нитчатой зеленой водоросли Aegagropila linnaei. Aegagropila linnaei культивировали на среде следующего состава: NaNO3 – 0.091 г, KH2PO4 – 0.0083 г, MgSO4‧7H2O – 0.015 г, NaCl – 0.05 г, CaCO3 – 0.184 г, Na2CO3 – 0.02 г, дистиллированная вода – 1 л, pH 8.3. Водоросль культивировали в люминостате при температуре 18°С и постоянном освещении 2000 люкс.

МЕТОДИКИ ПОЛУЧЕНИЯ БИОГИБРИДНЫХ МАТЕРИАЛОВ

Материал № 1

Культуру Komagataebacter xylinus высевали на жидкую питательную среду Hestrin-Shramm в чашке Петри и оставляли на 4 дня при температуре 33°С до полного заполнения чашки бактериальной целлюлозой. Далее бактериальную целлюлозу промывали дистиллированной водой, чтобы избавиться от остатков среды Hestrin-Shramm, после чего заливали суспензией культуры Sporosarcina pasteurii с концентрацией клеток 6.1 ‧ 108 мл–1 и давали клеткам время закрепиться на нитях матрикса. Через 30 мин остатки суспензии сливали, промывали бактериальную целлюлозу дистиллированной водой и заливали цементирующим раствором следующего состава: 3.9 г/л мочевины и 7.215 г/л хлорида кальция. Через час инкубацию с культурой Sporosarcina pasteurii и цементирующим раствором повторяли.

Материал получали в течение 3 дней, по 4 цикла каждый день.

Материал № 2

Биомассу водоросли Aegagropila linnaei промывали дистиллированной водой, чтобы избавиться от остатков питательной среды. Далее водоросли заливали суспензией культуры Sporosarcina pasteurii с концентрацией клеток 6.1 ∙ 108 мл–1 и давали клеткам время закрепиться на биомассе. Через полчаса остатки суспензии сливали, промывали биомассу водорослей водой и заливали цементирующим раствором следующего состава: 3.9 г/л мочевины и 7.215 г/л хлорида кальция. Через час повторяли инкубацию с культурой Sporosarcina pasteurii и цементирующим раствором.

Материал получали в течение 5 дней, по 4 цикла каждый день.

Материал № 3

1.5% раствором альгината в среде ATTC 1376 разбавляли культуру Sporosarcina pasteurii так, чтобы концентрация клеток составила 6.1 ‧ 108 мл–1. Тонкий слой промытого дистиллированной водой речного песка (2 мм) заливали приготовленной суспензией клеток и заливали 2% раствором нитрата кальция. Материал на час помещали в цементирующий раствор следующего состава: 18 г/л мочевины и 33.4 г/л хлорида кальция, после чего инкубировали в сушильном шкафу 48 ч при температуре 180°С.

Материал № 4

2.5% раствором агар-агара в среде ATTC 1376 разбавляли культуру Sporosarcina pasteurii так, чтобы концентрация клеток составила 6.1 ‧ 108 мл–1. В нагретую форму с промытым дистиллированной водой речным песком заливали приготовленную суспензию, хорошо перемешивали и ждали полного застывания агара. Далее материал на час помещали в цементирующий раствор следующего состава: 18 г/л мочевины и 33.4 г/л хлорида кальция, после чего инкубировали в сушильном шкафу 48 ч при температуре 180°С.

ИЗУЧЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ МАТЕРИАЛОВ

Морфология образцов была изучена методом растровой электронной микроскопии (РЭМ). Исследование проводилось с помощью растрового электронно-ионного микроскопа Versa 3D Dual Beam (Thermo Fisher Scientific, США), оснащенного системой энергодисперсионного рентгеновского микроанализа EDXS (EDAX, США).

Изображения были получены в режиме высокого вакуума с использованием детектора вторичных электронов ETD при ускоряющих напряжениях 1 и 10 кВ без напыления дополнительного проводящего слоя. Во избежание накопления заряда на поверхности образца, часть изображений были получены в режиме низкого вакуума с помощью высокочувствительного детектора вторичных электронов LVSED (Low Vacuum Secondary Electron Detector) и детектора вторичных электронов для получения изображений в газообразной среде GSED (Gaseous Secondary Electron Detector) при ускоряющих напряжениях 5 и 10 кВ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В природных условиях бактерии способны инициировать минералообразование посредством смены рН или окислительно-восстановительного потенциала на своей поверхности [3]. Вначале ионы кальция накапливаются на носителе внутри клетки (органический матрикс кокколитов у кокколитофорид или аморфный карбонат кальция у цианобактерий) или вне клетки (белковый S-слой или внеклеточные полисахариды). Формирование сайтов нуклеации минералов карбоната кальция, как правило, обеспечивается наличием отрицательно заряженных групп органических соединений, связывающихся с катионами кальция. После нуклеации образовавшиеся минералы увеличиваются в размерах и срастаются, образуя чехол, или отрываются от поверхности, на которой сформировались. Различные биополимеры могут выступать в роли подложки для формирования кристаллов и служить основой для закрепления клеток, способных инициировать минералообразование.

В ходе работы было получено 4 биогибридных материала. На матриксах материалов находились бактерии Sporosarcina pasteurii, которые под воздействием цементирующего раствора образовали вокруг себя кристаллы карбоната кальция.

Материал № 1 был создан с помощью бактерий Komagataebacter xylinus и представлял собой матрикс из нитей бактериальной целлюлозы и клеток бактерий. На рис. 1 показаны биогенные минералы карбоната кальция, армированные нитями бактериальной целлюлозы толщиной 30–100 нм. Нити целлюлозы образовали сетку, в которой часть ячеек превышала по размеру клетки бактерий Sporosarcina pasteurii. Таким образом, клетки бактерий могут проникать внутрь целлюлозного матрикса и закрепляться внутри него.

Рис. 1.

Биогенные кристаллы карбоната кальция, армированные тонкими нитями бактериальной целлюлозы (материал № 1).

Материал № 2 представлял собой матрикс из биомассы зеленых водорослей Aegagropila linnaei. На рис. 2 продемонстрировано формирование карбоната кальция на поверхности нитей водорослей в материале № 2, а также визуализированы клетки бактерий Sporosarcina pasteurii, инкрустированные минералами карбоната кальция.

Рис. 2.

Кристаллы карбоната кальция на поверхности водоросли Aegagropila linnaei (материал № 2).

Материалы №№ 3 и 4 представляли собой биоцемент на основе речного песка с иммобилизованными клетками Sporosarcina pasteurii с кристаллами карбоната кальция на них. В материале № 3 иммобилизующим материалом являлся альгинатный гель, в материале № 4 – агаровый гель. Данные материалы удобны тем, что во время их изготовления можно задать любую форму изделия.

С использованием растровой электронной микроскопии мы показали образование минералов карбоната кальция вокруг клеток микроорганизмов, находящихся в органическом матриксе различного происхождения (рис. 3). Единичные бактерии выступают в качестве центров зарождения кристаллов, постепенно полностью покрываясь кальцитом. Затем мелкие агрегаты прилипают друг к другу, образуя сложные кристаллические сети, постепенно увеличивающие свой объем.

Рис. 3.

Клетки Sporosarcina pasteurii с образованными вокруг них кристаллами карбоната кальция (материал № 3). Стрелками показаны округлые клетки бактерий, находящихся в углублениях в кристаллах карбоната кальция.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Приведенное нами исследование показывает принципиальную возможность совместного использования различных типов организмов, способных к образованию карбоната кальция и биополимеров (бактериальной целлюлозы, нитей зеленых водорослей, альгината и агара) для получения биогибридных материалов.

Работа выполнена при поддержке НИЦ Курчатовский институт (приказ № 1056 от 02.07.2020).

Список литературы

  1. Gao J., Maruyama A. In: Encyclopedia of polymeric nanomaterials. Berlin, Heidelberg: Springer, 2014.

  2. Barber A.H., Lu D., Pugno N.M. // J. Royal Soc. Interface. 2015. V. 12. Art. No. 20141326.

  3. Намсараев З.Б., Мельникова А.А., Руденко А.П., Комова А.В. // Росс. нанотехнол. 2020. Т. 15. № 1. С. 20; Namsaraev Z.B., Melnikova A.A., Rudenko A.P., Komova A.V. // Nanotechnol. Russ. 2020. V. 15. No. 1. P. 20.

  4. Kamat S., Su X., Ballarini R., Heuer A.H. // Nature. 2000. V. 405. P. 1036.

  5. Finnemore A., Cunha P., Shean T. et al. // Nature Commun. 2012. V. 3. Art. No. 966.

  6. Walsh P.J., Fee K., Clarke S.A. et al. // Marine Drugs. 2018. V. 16. No. 8. Art. No. 288.

  7. Gao H.L., Chen S.M., Mao L.B. et al. // Nature Commun. 2017. V. 8. No. 1. Art. No. 287.

  8. Portela R., Leal C.R., Almeida P.L. et al. // Microbiol. Biotechnol. 2019. V. 12. No. 4. P. 586.

  9. Mihranyan A. // J. Appl. Polym. Sci. 2011. V. 119. No. 4. P. 2449.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска содержание выпуска

Известия РАН. Серия физическая

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал