Известия РАН. Серия физическая, 2023, T. 87, № 2, стр. 194-200

ВВЕДЕНИЕ

Явление рамановского рассеяния, открытое в 30-х гг. 20 в., долгое время не получало широкого распространения в практике из-за низкой чувствительности метода. Однако в 70-х гг. 20 в. было обнаружено явление поверхностно-усиленного рамановского рассеяния [1]. Согласно теории, что сечения светорассеяния молекул, адсорбированных на некоторых шероховатых поверхностях металла или нано-размерных металлических частиц или рядом с ними, значительно увеличиваются при лазерном возбуждении, усиливая спектры комбинационного рассеяния (КР) в миллионы раз. Согласно общепринятой теории гигантского комбинационного рассеяния (ГКР), основной вклад в усиление сигнала рассеяния неупругих колебаний вносит электромагнитная (ЭМ) составляющая. ЭМ усиление возникает за счет значительного увеличения напряженности электрического поля (в 10³–10⁴ раз) вблизи шероховатых поверхностей [2], на границе между средами с различной диэлектрической проницаемостью [3], или горячих точек в случае коллоидных растворов [4], что соответствует значению фактора усиления КР в 10⁶–10⁸ для различных молекул, независимо от их структуры или электронного состояния [5].

Кроме того, заметное дополнительное усиление комбинационное рассеяния в 10²–10³ раза было получено для конкретных молекул и колебательных мод при химическом усилении, которое возникает в результате резонанса переноса электрона между металлом и молекулами [2]. Однако целостная картина процессов, лежащих в основе химического усиления, так и не была полностью развита. Соответственно, дальнейшее накопление эмпирической информации о механизмах электромагнитного и химического усилений имеет важное значение для установления оптимальных механизмов усиления ГКР-сигнала и создания методик обнаружения отдельных молекул, которая требует фактора усиления КР более чем 10¹⁰ раз. Обнаружение отдельных молекул с помощью спектроскопии ГКР необходимо для надежного применения в биохимическом анализе [6] и медицинской диагностике [7] с высокой спектральной специфичностью, мультиплексными возможностями и фотостабильностью [8].

Механизм химического усиления изучался многими группами, так в работе Hildebrandt и Stockburger [9], сигнал ГКР красителя R6G, адсорбированного исключительно на наночастицах серебра, дает лишь незначительное усиление (фактор G = 1.3 ⋅ 10⁴), но в присутствии галогенид-анионов фактор усиления возрастает более чем на три порядка (до G = 4.3 ⋅ 10⁷). Деринг и Ни изучали роль галогенида в спектрах ГКР, в наночастиц Ag, иммобилизованных на стеклянной подложке [10]. Они обнаружили резкую активацию сигнала КР, вызванную добавлением галогенида, и оценили коэффициент химического усиления в данной системе в 10²–10³.

В ходе этой работы был рассмотрен механизм адсорбции катионных красителей (структура красителей показана на рис. 1а–1в) в растворах серебряных наночастиц (d ~ 12–14 nm), полученных путем восстановления нитрата серебра боргидридом и гидроксиламином в присутствии цитрата натрия. Также было изучено поведение цитрат-стабилизированных гидроксиламин-восстановленных серебряных наночастиц с адсорбированными красителями в средах различного состава, а также была исследована устойчивость полученных систем с течением времени.

Рис. 1.

Структурные формулы используемых в работе красителей (а–г), их UV-Vis спектры (для 25 мкМ водных растворов) (д) и ГКР-спектры 100 нМ (для MVCl раствор коллоида разбавили в 2 раза из-за сильнейшего сигнала ГКР) растворов используемых в работе красителей, адсорбированных на AgNP-HA-Citr (e).

УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

В синтезах растворов серебряных наночастиц и в приготовлении стоковых растворов и буферов использовалась деионизированная (18 МОм/см) полученная на установке Millipore (Merck Millipore, Burlington, Massachusetts, США)

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

Основными достоинствами коллоидных растворов серебра, полученных восстановлением раствора AgNO₃ гидроксиламином, является узкое распределение по размерам серебряных наночастиц (средний размер НЧ – 23 нм) и их высокоразвитая поверхность [11]. На поверхности частиц отсутствуют какие-либо сильные стабилизаторы (двойной электрический слой на поверхности частиц образуют хлорид-анионы и продукты реакции окисления гидроксиламина), что позволяет легко модифицировать наночастицы прямо во время их синтеза (“one-pot reaction”) любыми анионными стабилизаторами [13]. С другой стороны устойчивость серебряных золей, полученных данным путем сравнительно невелика, и за достаточный промежуток времени при хранении в растворе образуется довольно заметное количество агрегатов серебряных наночастиц. Низкая устойчивость исследуемых золей особенно заметна при добавлении катионного рамановского красителя в концентрациях меньших чем 10^–7 М. Так, перемешивание гидроксиламин-восстановленных серебряных наночастиц в течение 20 мин в 50 нМ растворе малахитового зеленого изотиоцианата ведет к видимой агрегации наночастиц (постепенное обесцвечивание золя и образования серого осадка). Цитрат-стабилизированные борогидрид-восстановленные серебряные золи обладают куда большей стабильностью в присутствии того же катионного рамановского красителя, однако, при этом они же и обладают заметно более низкой ГКР-активностью (рис. 2).

Рис. 2.

Видимые спектры цитрат-стабилизированных наночастиц и спектр гидроксиламин-восстановленных цитрат-стабилизированных серебряных наночастиц с адсорбированным красителем (малахитовый зеленый изотиацианат перхлорат, MG-NCS) (а). ГКР-спектры MG-NCS, адсорбированного на цитрат-стабилизированные борогидрид-восстановленные серебряные наночастицы (спектр выделен синим), гидроксиламин-восстановленные (зеленым) и на агрегаты, полученные в 20 мМ растворе NaCl гидроксиламин-восстановленных серебряных наночастиц без стабилизатора (LL-MG) (б).

С целью получения высокоактивных плазмонных серебряных золей, обладающих при этом высокой стабильностью, нами была модифицирована их методика получения путем добавления в реакционную смесь раствора цитрата натрия. Из обзора [14] по синтезу серебряных золей известно, что 1 мМ серебряные золи достаточно устойчивы в диапазоне концентраций цитрата натрия 0.25 мМ–2.5 мМ, поэтому для удобства сравнения c цитрат-восстановленными серебряными золями (AgNP-Citr) мы выбрали концентрацию цитрата равную 1 мМ. Далее обозначение полученных НЧ – AgNP-HA-Citr.

Следует отметить, что гидродинамический диаметр полученных в данной работе серебряных коллоидов (12–14 нм) незначительно отличается от гидроксиламин-восстановленных серебряных золей, полученных без добавления цитратов (8–10 нм) [11, 13], полученные наночастицы обладают несколько меньшим коэффициентом усиления КР, чем агрегированные в 20 мМ растворе NaCl AgNP-LL (рис. 2). ζ-потенциал после адсорбции малахитового зеленого значительно повышается (с –60 мВ до –10 мВ), что указывает на практически полную компенсацию поверхностного заряда AgNP-HA-Citr катионным красителем, гидродинамический размер повышается тоже незначительно (d ~ 14–16), таким образом при адсорбции красителя не происходит образования агрегатов, но возможно образование скоплений наночастиц (т.е. комплексов из нескольких наночастиц и краски).

В следующей части работы исследовалась степень адсорбции исследуемых красителей за одинаковый промежуток времени в зависимости от противоиона и pH раствора красителя. Ранее подобные исследования по адсорбции малых количеств катионных красителей проводились группой M. Futamata. Авторы в работе обнаружили, что близко расположенные НЧ Ag образуют флокуляты в водном растворе при добавлении следовых количеств катионных ксантеновых красителей в концентрации 10^–7–10^–8 моль/л [15]. Для понимания механизма образования флокулятов серебра в коллоидных растворах эти же авторы в дальнейшем [16] изучали спектры экстинкции и SERS для нейтральных молекул и сравнивали их со спектрами для катионных форм. Действительно, катионные ксантеновые и трифенилметановые красители давали заметное красное смещение пиков флуоресценции. Последнее наблюдение предполагает возмущенное электронное состояние красителей, связанное с механизмом химического усиления. Поскольку красители адсорбируются на поверхности Ag через амино группы, авторы исследовали влияние размера и количества амино =N⁺(C₂H₅)₂, –NH₂, –N(CH₃)₂ и –N(C₂H₅)₂ в красителях на флокуляцию серебряных золей и спектры флуоресценции. Было сделано предположение, что электростатическое взаимодействие между катионными красителями и наночастицами серебра приводит к образованию близко расположенных скоплений наночастиц. Катионные красители располагались в зазорах скоплений, что приводило к огромному усилению КР и значительному сдвигу длины волны испускания флуоресценции в красную область. Объемность аммонийной или амино групп в красителях не повлияла на флокуляцию серебряных золей из-за доминирующей роли электростатического взаимодействия.

В данной работе изучалась адсорбция катионных красителей, содержащих амино группы с разной степенью замещенностью и разной симметричностью расположения в молекулах красителей. Исследовались малахитовый зеленый изотиацианат с тремя симметрично расположенными азот-содержащими группами соответственно (=N⁺(CH₃)₂ и –N=C=S), метиловый фиолетовый – 2 группы =N⁺(CH₃)₂ и одна (=⁺NH–CH₃), а также менее симметричные производные трифенилметана – бриллиантовый зеленый 2 группы =N⁺(CH₃)₂ на три ароматических кольца и производное акридина (акридиновый желтый G) с двумя незамещенными (–NH₂) амино группами и азотом в ароматическом кольце. Исследования проводились в среде с меньшей чем в работе [16] ионной силой, при этом дополнительно исследовано с помощью видимой спектроскопии и спектроскопии ГКР влияние противоиона исходной соли красителя, а также поведение комплексов НЧ-краситель с течением времени (рис. 3).

Рис. 3.

Зависимость интенсивностей полос в ГКР-спектрах акридинового желтого (ν = 1370 см^–1) (а), метилового фиолетового (ν = 1585 см^–1) (б) и бриллиантового зеленого (ν = 1615 см^–1) (в) от времени адсорбции в зависимости от противоиона. Устойчивость сигнала хлоридных солей адсорбированных красителей с течением времени (в днях выдержки) (г).

Можно заметить, что при одинаковом анионе наиболее сильная и стабильная адсорбция наблюдается у метилового фиолетового и малахитового зеленого изотиацианата, содержащего в своей структуре симметрично расположенные атомы азота, при этом интенсивность сигналов красителей не сильно зависит от противоиона. Более слабые сигналы наблюдаются либо у красителей с несимметричным расположением аминогрупп (бриллиантового зеленого и акридинового желтого). Из рис. 3 можно заметить, что максимумы ГКР-сигналов исследуемых красителей с различными анионами (кроме ${\text{N}}{{{\text{a}}}^{{\text{ + }}}}{\text{SO}}_{4}^{{2 - }}$) наблюдаются в основном после 2 ч перемешивания и 20 ч инкубации смесей. При этом особенно заметно влияние пары ${\text{N}}{{{\text{a}}}^{{\text{ + }}}}{\text{SO}}_{4}^{{2 - }}$ на ГКР-спектр этих красителей, что, по-видимому, связано со значительной степенью замещения этой ионной парой цитрат-аниона в двойном электрическом слое наночастицы. Как следствие, сульфат-анион оказывает значительное влияние на подвижность электронов проводимости в металлических нано-частицах и на изменение диэлектрической постоянной двойного электрического слоя наночастиц. Согласно выводам в обзоре Paul Mulvaney [17] подобный эффект будет наиболее выражен в случае очень мелких нано-кристаллов, где отношение величины двойного слоя к объемному заряду наиболее существенно.

Зависимость ГКР-сигнала от pH стокового раствора красителя изучалась на примере гидро-оксалатной соли бриллиантового зеленого (BGHOx, где Ox^2– = ${{{\text{C}}}_{{\text{2}}}}{\text{O}}_{4}^{{2 - }}$). Изменение pH производилось путем полного или частичного замещения (нейтрализации) аниона HOx^– 200 мкМ раствора BGHOx равным объемами 100 или 200 мкМ растворами HCl и NaOH. Для корректного сравнения с нейтральному 200 мкМ раствору BGHOx добавлялся равный объем 200 мкМ раствора NaCl. Адсорбция полученных солей на AgNP-HA-Citr производилась путем перемешивания в течение 2 ч вышеуказанных растворов с раствором AgNP-HA-Citr в соотношении 1 : 999, без дополнительной инкубации. Оказалось, что в нейтральной среде наблюдается наименьший ГКР-сигнал полосы при ν = 1615 см^–1 красителя (I_{BG-нейтр} ~ 2500), в то время как в более кислой и более щелочной средах интенсивность ГКР-спектра почти в три раза выше (I_BG-кисл ~ I_BG-щел ~ ~ 7000). Такое заметное падение интенсивности КР в нейтральной среде связано со слабой способностью Н-оксалат аниона менять диэлектрические свойства цитратного слоя наночастиц.

Для дальнейшего использования полученных комплексов (адсорбатов) в аналитических и диагностических целях изучалось поведение наиболее устойчивого из них, а именно AgNP-HA-Citr:MV в различных средах. Из рис. 3 видно, что даже в течение 3 недель интенсивность ГКР-спектра адсорбированного красителя в этом комплексе не падала, а даже, наоборот, выросла на ~10%. Интенсивность сигнала красителя с течением времени измерялась в трех средах: в растворе 1.5 мМ цитрата натрия + 15 мМ NaCl с pH ~ 8.2 (1); в растворе 1,5 мМ цитратно-фосфатного буфера + + 15 мМ NaCl с pH ~ 7.6 (2); и в растворе (1), содержащего дополнительно 0.1% BSA (3).

На рис. 4 приведена зависимость интенсивности полосы метилового фиолетового (ν = 1585 см^–1) от времени во всех трех системах. Можно заметить, что в среде смеси цитрата и хлорида наблюдается определенный рост сигнала до насыщения, связанный, по-видимому, с дополнительным образованием флокулянтов наночастиц. При внесении в систему фосфат-аниона наблюдается хаотическое изменение сигнала. В присутствии белка (BSA) наблюдается устойчивое падение сигнала с выходом на плато. Такой характер возможно связан с частичным замещением на серебряных наночастицах цитратного слоя с адсорбированным красителем отрицательно заряженной при pH ~ 8.2 молекулы BSA (изоэлектрическая точка BSA находится в диапазоне pH 4.5–4.8) с образованием белковой короны [18].

Рис. 4.

Зависимость интенсивности пика (при ν = = 1585 см^–1) в ГКР-спектре метилового фиолетового адсорбированного на AgNP-HA-Citr от времени в трех средах. 1.5 мМ три натрия цитрат + 15 мМ NaCl (синяя линия), 1.5 мМ фосфатно-цитратный буфер (pH ~ 7.6) + 15 мМ NaCl (красная линия), 1.5 мМ три натрия цитрат + 15 мМ NaCl (линия) + 0.1% BSA (желтая линия).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты экспериментов по адсорбции катионных красителей с различными анионами на цитрат-стабилизированные наночастицы с развитой поверхностью показали, что при сильном взаимодействии катиона красителя (метилового фиолетового и малахитового зеленого изотиацианата) с поверхностью наночастицы влияние природы противоиона на скорость адсорбции, образования флокулятов наночастиц и, соответственно, на ГКР-сигнал красителя незначительно. Для катионов красителей бриллиантового зеленого и акридинового желтого, слабо взаимодействующих с двойным электрическим слоем наночастицы способность противоиона воздействовать на свойства поверхности наночастиц начинает играть заметную роль, что проявляется в сильной вариации усилений сигналов ГКР красителей в зависимости от аниона.

Было отмечено, что при увеличении ионной силы с помощью цитрата и хлорида натрия может быть достигнута точка максимального сигнала ГКР для данной системы за счет максимального образования флокулятов серебряных наночастиц. Внесение же новых анионов в систему приводит к нарушению комплексов краситель–частица и, следовательно, хаотическому изменению сигнала. Присутствие в системе отрицательного заряженного высокомолекулярного соединения, способного к взаимодействию с поверхностью серебряных наночастиц приводит к постепенному понижению сигнала ГКР красителя.

Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда (проект № 19-72-30003).