Химическая физика, 2021, T. 40, № 12, стр. 48-55

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время установлено, что биологические эффекты в клетках после действия ионизирующего излучения (ИИ) обусловлены не только повреждением ядерной ДНК. У клеток, которые находятся рядом с облученными или в культуральной среде, полученной от облученных клеток, также могут наблюдаться изменения, схожие с радиационно-индуцированными. Так называемые “немишенные эффекты” ИИ, включая “эффект свидетеля” (ЭС) достаточно хорошо изучены in vitro и in vivo [1, 2]. Показано, что ЭС характеризуется не только переносом повреждений от облученных клеток к необлученным в виде хромосомных аберраций, генных мутаций, изменения экспрессии генов, но и апоптозом, неопластической трансформацией клеток-“свидетелей”. Необходимо отметить, что наряду с цитотоксическим эффектом в клетках-“свидетелях” регистрируются и цитопротективные эффекты, например, повышение их радиорезистентности.

Ранее считалось, что “эффект свидетеля” может реализовываться только в пределах одного органа или системы. Недавно было показано, что “эффект свидетеля” может быть зарегистрирован не только в клеточных культурах или in vivo в одном организме, но и на межорганизменном уровне – облученный организм может индуцировать изменения у необлученного организма. Такие эффекты были выявлены у беспозвоночных (Daphnia magna) [3] и высших позвоночных животных – рыб [4, 5] и крыс [6] и получили название “межорганизменные радиационно-индуцированные эффекты свидетеля” (radiation-induced inter-organism level bystander effects) [3]. Для объяснения этого явления предлагается несколько механизмов: 1) непосредственный контакт и передача “повреждающих” факторов; 2) выделение соединений, которые могут вызывать изменения у необлученных животных на расстоянии [7]; 3) действие биофотонов [8]; 4) действие внеклеточной ДНК [9].

Дистанционный “эффект свидетеля” – наименее изученный с точки зрения проявлений и механизмов феномен, относящийся к “немишенным эффектам”. В работах авторов [10, 11] приведены первые результаты исследований и наблюдения в рамках комплексного проекта по оценке радиационно-индуцированных “немишенных эффектов”. В нашем предыдущем эксперименте у необлученных мышей, находившихся на протяжении 3 мес в контакте с облученными (3 Гр) особями, выявлены признаки патологий, сходных с радиационно-индуцированными, а именно: изменение поведенческих реакций, статистически значимая тенденция к уменьшению веса селезенки (r = –0.416; p = 0.048), увеличению площади алопеции (r = –0.631; p = = 0.001) и иные аномалии.

Под воздействием ИИ облученные клетки млекопитающих способны передавать внеклеточные сигналы необлученным соседним клеткам. В работе [12] описано также явление, названное “эффект спасения”, при котором клетки-“свидетели” снижали радиационно-индуцированные изменения в облученных клетках с помощью сигнала межклеточной обратной связи.

Данная тематика может быть применима при экологической оценке влияния радиоактивности на человека и природные ресурсы [13–15]. Цель нашего эксперимента – изучение радиационных “эффектов свидетеля” на межорганизменном уровне у облученных и необлученных животных (мыши) при их совместном содержании.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование выполнено на 60 беспородных мышах-самках. В опыте использовали здоровых животных, не подвергавшихся ранее другим экспериментальным воздействиям. Группы формировали методом сплошной выборки. При проведении экспериментальных процедур соблюдались соответствующие международные правила работы с лабораторными животными [16, 17]. Животные (n = 20) были облучены в дозе 3 Гр на исследовательской радиобиологической гамма-установке ИГУР-1М с четырьмя источниками изотопов ¹³⁷Cs, мощность дозы гамма-излучения – 0.79 Гр/мин, неравномерность γ-поля в рабочем пространстве – не более 5%. Поглощенная доза для мышей составила 3.0 Гр.

После обучения мыши были рассажены группами в четыре клетки, в каждой из которых находилось по пять облученных мышей и по пять необлученных (мыши-“свидетели”, n = 20). В двух из четырех клеток облученные и необлученные мыши могли свободно контактировать друг с другом. В двух других клетках мыши облученной и необлученной групп были разделены металлической сеткой, что исключало их тактильный контакт. Для контроля были использованы еще две группы: группа биоконтроля (n = 10) и группа гамма-контроля облученные в дозе 3 Гр животные, (n = 10), каждая из которых содержалась в отдельной клетке. Всего сформировано шесть экспериментальных групп. Эксперимент продолжался три месяца.

Для решения поставленных задач был применен анализ частоты микроядерных (МЯ) эритроцитов. Микроядерный тест – эффективный инструмент оценки генотоксического действия различных факторов, нарушений, связанных с нестабильностью генома, а также других клеточных патологических процессов, связанных с повреждением ДНК, хроматина и нарушением деления клеток [18]. Кровь из хвостовой вены мышей отбирали на 3-и, 7-, 14-, 30-, 60-, 90-е сут после начала эксперимента. Готовили мазки крови для определения частоты эритроцитов с микроядрами и клеточного состава периферической крови. Мазки фиксировали метанолом в течение 3 мин, высушивали, окрашивали по методу Романовского–Гимза. Препараты для анализа кодировали и затем анализировали с помощью микроскопов “Axio Scope A1” и “Axio Imager M2” (Carl Ziess, Германия). Максимальный разовый объем кровопотери для каждого животного не превышал 3% от объема циркулирующей крови (для мышей данной возрастной группы). Для определения частоты эритроцитов с микроядрами анализировали 1000 полихроматофильных эритроцитов (ПХЭ) и не менее 2000 нормальных (оксифильных) эритроцитов (НХЭ).

Статистический анализ проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Различия принимали статистически значимыми при вероятности нулевой гипотезы р < 0.05. Для сравнительного анализа полученных данных выделили следующие воздействующие факторы: гамма-облучение; время после начала эксперимента; “фактор контакта” – вид контакта между облученными и необлученными животными (0 – отсутствие контакта между облученными и необлученными животными; 1 – обонятельный контакт (клетка с перегородкой); 2 – тактильный и обонятельный контакт (клетка без перегородки). Проводили многофакторный дисперсионный анализ признаков сопряженности с применением обобщенной линейной модели.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В исследованиях оценивали частоту ПХЭ с микроядрами, НХЭ с микроядрами, суммарного количества эритроцитов в периферической крови у мышей на 3-и, 7-, 14-, 30-, 60- и 90-е сут после начала эксперимента. Средняя частота ПХЭ с микроядрами в периферической крови мышей из группы биологического контроля составила 0.2–0.6‰. Гамма-облучение животных приводило к статистически значимому (t = 2.95; p = 0.01) повышению частоты ПХЭ с микроядрами, начиная с седьмых суток после облучения, когда этот показатель превышал значение в группе биологического контроля почти в 5 раз. Такой высокий уровень цитогенетических повреждений сохранялся до 14 дней, далее происходило снижение частоты хромосомных повреждений (рис. 1).

Рис. 1.

Изменения частоты микроядерных полихроматофильных эритроцитов (ПХЭ) в крови двух групп животных: 1 – биологический контроль и 2 – гамма-контроль в зависимости от времени после облучения.

В группах необлученных мышей-“свидетелей” не было выявлено статистически значимых изменений частоты ПХЭ с микроядрами. На 7-е сут в группе “свидетелей”, содержавшихся с облученными мышами в клетке с перегородкой, выявлена тенденция к повышению частоты микроядерных эритроцитов (t₁ = 0.88; p = 0.39; рис. 2). В группе облученных животных, которых содержали в одной клетке с перегородкой с необлученными мышами-“свидетелями” на 14-е сут после начала эксперимента было зарегистрировано достоверное (t = 2.32; p = 0.03) снижение частоты ПХЭ с микроядрами по сравнению со значением показателя в группе гамма-контроля (рис. 3). При сравнении частоты ПХЭ с микроядрами в группах облученных животных, которых содержали вместе с необлученными “свидетелями”, не выявлено других достоверных изменений.

Рис. 2.

Частота микроядерных полихроматофильных эритроцитов (ПХЭ) в зависимости от времени после облучения для групп животных: 1 – биоконтроль; 2 – “свидетели”, контактировавшие с облученными животными тактильно; 3 – “свидетели”, контактировавшие с облученными мышами через перегородку; 4 – суммарные значения (контроль). На 7-е сут в группе “свидетелей”, содержавшихся с облученными мышами в клетке с перегородкой, выявлена тенденция к повышению частоты микроядерных эритроцитов (t₁ = 0.88; p = 0.39).

Рис. 3.

Частота микроядерных полихроматофильных эритроцитов (ПХЭ) в зависимости от времени после облучения для групп животных: 1 – гамма-контроль; 2 – облученные животные, контактировавшие со “свидетелями” тактильно; 3 – облученные мыши, контактировавшие со “свидетелями” через перегородку; 4 – суммарное количество микроядерных эритроцитов в гамма-контроле (полихроматофильные + нормохроматофильные). На 14-е сут выявлено статистически значимое (t = 2.32; p = 0.03) снижение частоты МЯ эритроцитов у облученных мышей, контактировавших со “свидетелями” через перегородку.

При проведении многофакторного дисперсионного анализа в главной обобщенной модели выявлено достоверное влияние на частоту ПХЭ с микроядрами фактора “Облучение” (F = 59.45; p = 1.3 · 10^–13) и времени после начала эксперимента (F = 4.58; p = 0.033; табл. 1, 2). При этом гамма-облучение приводило к повышению частоты ПХЭ с микроядрами в среднем на 0.97‰, и показатель снижался на 0.0042‰ в сутки.

При анализе частоты НХЭ с микроядрами в группе биологического контроля выявлено, что этот показатель в начале эксперимента составлял (1.09 ± 0.18)‰. В дальнейшем происходило его снижение, и на 90-е сут после начала эксперимента в группе биологического контроля частота НХЭ с микроядрами составила 0.26 ± 0.12‰. Гамма-облучение животных в дозе 3 Гр приводило к статистически значимому повышению частоты хромосомных аберраций во все сроки обследования. На 14-е сут после начала эксперимента значение этого показателя в 3.7 раз превышало его уровень в группе биологического контроля. Далее с 30-х по 90-е сут после начала эксперимента в группе гамма-контроля частота НХЭ эритроцитов с микроядрами существенно не менялась и составляла около 1‰, что превышало значения в группе биологического контроля в 2–3 раз (рис. 4).

Рис. 4.

Изменения частоты микроядерных нормохроматофильных эритроцитов (НХЭ) в крови двух групп животных в зависимости от времени после начала эксперимента: 1 – биологический контроль и 2 – гамма-контроль.

В группах необлученных животных-“свидетелей” не выявлено статистически значимых изменений частоты НХЭ с микроядрами по сравнению со значениями показателя в группе биологического контроля (рис. 5). В группах, где облученных мышей содержали с необлученными “свидетелями”, у облученных животных выявлено статистически значимое снижение частоты НХЭ с микроядрами при сравнении с гамма-контролем t₂ (рис. 6). Приведен также показатель сравнения с биоконтролем t₁, где р – уровень значимости.

Рис. 5.

Зависимость частоты микроядерных нормохроматофильных эритроцитов (НХЭ) от времени, прошедшего после облучения для групп животных: 1 – биоконтроль; 2 – “свидетели”, контактировавшие с облученными животными тактильно; 3 – “свидетели”, контактировавшие с облученными мышами через перегородку.

Рис. 6.

Зависимость частоты микроядерных нормохроматофильных эритроцитов (НХЭ) от времени, прошедшего после облучения для групп животных: 1 – гамма-контроль; 2 – облученные мыши, контактировавшие со “свидетелями” тактильно; 3 – облученные мыши, контактировавшие со “свидетелями” через перегородку.

У облученных мышей отмечалось значимое снижение частоты НХЭ с микроядрами:

1) на 3-и сут после начала эксперимента при содержании в одной клетке без перегородки t₁ = = 0.39; p = 0.701; t₂ = 2.35; p = 0.03;

2) на 14-е сут как в группе животных, содержавшихся в клетках без перегородки, t₁ = 1.72; p = 0.1; t₂ = 6.03; p = 0.000011, так и в группе, находившихся в клетках с перегородкой, t₁ = 4.28; p = 0.0005; t₂ = 3.29; p = 0.004.

В тот же момент времени (на 14-е сут) у необлученных мышей-“свидетелей”, содержавшихся с облученными мышами в клетке с перегородкой, выявлена тенденция к превышению частоты микроядерных эритроцитов показателей в биоконтроле (t₁ = 1.79; p = 0.09; рис. 5);

3) на 60-е сут в группе, где животных содержали в клетках без перегородки, t₁ = 0.75; p = 0.46; t₂ = 2.8; p = 0.01;

Также на 60-е сут у необлученных мышей-“свидетелей”, находившихся с облученными мышами в клетке без перегородки, выявлена тенденция к превышению частоты микроядерных эритроцитов показателей в биоконтроле (t₁ = 1.39; p = 0.18; рис. 5).

Было выявлено также повышение частоты НХЭ с микроядрами в периферической крови у облученных животных, которых содержали с необлученными “свидетелями” в одной клетке с перегородкой (группа “3”) на 30-е сут после начала эксперимента (рис. 6).

Проведение многофакторного анализа выявило достоверное влияние факторов: “облучение”, времени после начала эксперимента и фактора контакта (табл. 3, 4).

Частота всех эритроцитов с микроядрами фактически представляет собой объединение данных для частоты ПХЭ и НХЭ с микроядрами, однако в связи с увеличением числа проанализированных эритроцитов в этом случае повышается статистическая сила анализа (табл. 5, 6). При содержании облученных и необлученных мышей в одной клетке без перегородки у облученных мышей регистрируется снижение частоты эритроцитов с микроядрами в среднем на 0.43‰.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, воздействие ионизирующего излучения приводило к повышению частоты эритроцитов с микроядрами в периферической крови мышей, показатель снижался в зависимости от времени после начала эксперимента. Тактильный и обонятельный контакт приводил к снижению частоты НХЭ с микроядрами у облученных мышей, которых содержали в клетках с необлученными животными-“свидетелями”. У облученных животных было выявлено статистически значимое снижение частоты НХЭ с микроядрами при сравнении с гамма-контролем t₂: 1) на 3-и сут после начала эксперимента при содержании мышей в одной клетке без перегородки t₂ = 2.35; p = 0.03; 2) на 14-й день как в группе, где животных содержали в клетках без перегородки, t₂ = 6.03; p = 0.000011, так и в группе животных, находящихся в клетках с перегородкой t₂ = 3.29; p = 0.004; 3) на 60-е сут в группе, где животных содержали в клетках без перегородки t₂ = 2.8; p = = 0.01.

В те же сроки отмечалась тенденция к повышению частоты микроядерных НХЭ у необлученных мышей-“свидетелей”. У таких “свидетелей”, содержавшихся с облученными мышами в клетке с перегородкой, на 14-е сут выявлена тенденция к превышению частоты микроядерных эритроцитов показателей в биоконтроле (t₁ = 1.79; p = 0.09).

Анализ литературных данных при изучении “эффекта свидетеля” на уровне клетки [9], показал роль внеклеточной ДНК в формировании радиационных эффектов в необлученных клетках. По мнению А.В. Ермакова и соавт., цепочка последовательных событий в сигнальной системе состоит в следующем: облучение → первичный окислительный стресс → модификация ДНК → → апоптоз поврежденных клеток → свободная модифицированная внеклеточная ДНК → прием сигнала необлученными клетками → вторичный окислительный стресс → модификация ДНК и т.д. Индуцированный радиацией ЭС с участием “ДНК-сигнального” пути наблюдали в недифференцированных и дифференцированных клетках человека, образующих суспензионные или монослойные культуры.

Обсуждение возможных механизмов радиационного “эффекта свидетеля” на уровне организма с точки зрения биохимии связывалось авторами с теорией радиотоксинов А.М. Кузина [19, 20]. Нами высказывалось предположение о важной роли производных липоперекисей в формировании изучаемого эффекта. Липоперекиси, образующиеся в результате воздействия ионизирующего излучения на организм, являются высокотоксичными летучими соединениями [21]. Продукты липоперекисного окисления, появление летучих метаболитов могут стать причиной возникновения молекулярного сигнала, приводящего к изменению в клетках необлученных организмов-“свидетелей” [10, 11].

В серии экспериментов, проводимых группой канадских исследователей университета г. Макмастера [4–6] в качестве объяснения механизмов “эффекта свидетеля” проверяется гипотеза о роли биофотонов ультрафиолетового спектра в передаче сигнала “свидетеля” между организмами, и некоторые положения данной теории уже находят свое подтверждение. Предполагается, что использование указанных принципов квантовой биофизики выведет обсуждение механизма феномена на принципиально новый уровень [5, 6].

Из данных зарубежных источников известен также феномен “эффекта спасения”. Эффект наблюдался как в первичном фибробласте человека (NHLF), так и в раковых клетках (HeLa) с использованием двуклеточных систем совместной культуры. После совместного культивирования облученных клеток с необлученными клетками-“свидетелями” в течение 24 ч число очагов p53-связывающего белка 1, соответствующих количеству разрывов двойной нити ДНК в облученных клетках, было меньше, чем в облученных клетках, которые не культивировались совместно с клетками-“свидетелями” (0.78 ± 0.04 очагов/клетку против 0.90 ± 0.04 очагов/клетку) на статистически значимом уровне. Аналогичным образом, образование микроядер и степень апоптоза в облученных клетках отличались на статистически значимых уровнях, если они были “со-культивированы” с клетками-“свидетелями” [12].

На основании полученных в настоящем эксперименте данных и результатов исследований других авторов “эффекта свидетеля” при воздействии облучения, можно сделать предположение, что необлученные организмы способны снижать радиационные эффекты у облученных особей. На организменном (системном) уровне сочетание эффектов модификации ДНК с последующим апоптозом, другими клеточными явлениями и образование летучих метаболитов, воздействующих на клетки крови, индуцируют “эффект свидетеля”, обратной стороной которого является “эффект спасения”. Результаты говорят о необходимости проведения дальнейших исследований радиационно-индуцированного “эффекта свидетеля” с использованием молекулярно-клеточных методических подходов.

Авторы выражают благодарность к. б. н. Е.И. Селивановой и к. м. н. Н.С. Кузьминой за участие в подготовке статьи.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России за счет субсидии, выделенной ФИЦ ХФ РАН, тема 0082-2019-0015 “Изучение принципов структурно-функциональной организации биомолекулярных систем, разработка методов дизайна их физико-химических аналогов и создание на этой основе биологически активных препаратов нового поколения”, № государственной регистрации AAAA-A20-120031490003-7; частично работа поддержана грантом РФФИ 16-04-00963/18.