Химическая физика, 2021, T. 40, № 2, стр. 61-65

ВВЕДЕНИЕ

Оксид азота (NO) – универсальная молекула-регулятор многочисленных функций в организме и физиологический мессенджер в центральной нервной системе [1], участвующий в важных процессах, таких как регуляция кровообращения головного мозга [2]. Оксид азота синтезируется NO-синтазой (NOS) путем превращения L-аргинина в L-цитруллин в реакции, идущей с участием кислорода с образованием промежуточного продукта N-ω-гидрокси-L-аргинина.

Существуют три изоформы NOS: нейрональная (nNOS), эндотелиальная (еNOS) и индуцибельная (iNOS). Первые две изоформы являются Ca²⁺-зависимыми и локализованы в нервных тканях и в эндотелиальных клетках кровеносных сосудов, соответственно [3, 4], а третья – Ca²⁺-независима и локализуется в глиальных клетках мозга.

Значительное количество исследований подтвердили участие NO в патогенезе ишемического повреждения мозга [5, 6]. В моделях центральной и тотальной ишемии мозга все три изоформы NOS индуцируются в постишемический период, приводя к непрерывному производству NO. Активности ферментов nNOS и eNOS возрастают вскоре после начала ишемии, по-видимому, из-за повышения внутриклеточной концентрации Ca²⁺ [7–9], в то время как индукция iNOS задерживается на несколько часов. Предположительно, активация nNOS и iNOS приводит к гибели нервных клеток, а активация eNOS, напротив, защищает нейроны [10, 11]. Нейропротекция может происходить вследствие того, что NO, образующийся в эндотелиальных клетках, вызывает расслабление гладкой мускулатуры, что приводит к вазодилатации и увеличению мозгового кровотока в ишемизированной области мозга [5].

Ишемия – распространенное патологическое состояние, возникающее вследствие уменьшения кровоснабжения тканей. При снижении подачи крови к ткани снижается ее обеспечение кислородом и метаболическими субстратами, нарушается удаление продуктов обмена. Именно в тех случаях, когда циркуляция крови не может удовлетворить метаболические потребности тканей, происходят патологические изменения. Продолжительное нарушение кровоснабжения может привести к необратимым повреждениям ткани и ее гибели.

Существуют различные экспериментальные модели ишемии. При исследовании ишемических процессов в разных органах в качестве модели используется метод тромбирования сосудов с помощью лазерного воздействия. Для создания тромба в кровоток вводят фоточувствительный краситель (бенгальский розовый или эритрозин Б). После освещения краситель активируется и вырабатывает синглетный кислород, который повреждает мембрану эндотелиальных клеток с последующей агрегацией тромбоцитов и образованием тромбов, что в конечном итоге приводит к локальному прерыванию кровотока. В настоящей работе мы применили этот метод для исследования ишемии мозга. Его важным преимуществом является способность осуществлять целенаправленное дозированное неинвазивное повреждение с достижением избирательной окклюзии сосудов за счет фотохимического воздействия на клетки сосудистого эндотелия. Это приводит к прекращению кровотока и агрегации клеток крови с последующим тромбообразованием и окклюзией сосуда с сохранением гомеостаза тканей мозга [12].

Целью настоящей работы было определение изменений относительного содержания оксида азота in vivo в условиях острой ишемии и последующего частичного восстановления тканей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали крыс-самцов линии Wistar весом 150 г, содержавшихся в виварии при естественном освещении и свободном доступе к воде и пище по пять особей в клетке. Основные правила содержания и ухода за экспериментальными животными соответствовали нормативам, данным в Приказе Минздрава России № 708н от 23.08.10 “Об утверждении Правил лабораторной практики”, и были согласованы с этическим комитетом Минздравсоцразвития России.

Фототромбоз сосудов проводили по методике, разработанной Ватсоном [13] (рис. 1) и основанной на том, что при действии света с длиной волны 560 нм на введенный в кровоток фоточувствительный краситель бенгальский розовый (Bengal Rose) в области его взаимодействия с фокусированным светом выделяется синглетный молекулярный кислород [14]. Это приводит к повреждению эндотелия сосудов, агрегации, адгезии форменных элементов крови и в конечном итоге – к тромботической окклюзии поврежденных кровеносных сосудов с последующей ишемизацией снабжаемых ими тканей [15, 16].

Рис. 1.

Схема формирования тромба в просвете сосуда под воздействием пучка света с длиной волны 560 нм на введенный в кровоток фотосенсибилизируемый краситель бенгальский розовый.

Для индукции фототромбоза животным, наркотизированным хлоралгидратом (250 мг/кг, внутрибрюшинно), в яремную вену (v. jugularis) вводили 3%-ный раствор фотосенсибилизируемого красителя бенгальского розового в дозе 40 мг/кг. Для воспроизведения коркового инфаркта голову животного фиксировали в стереотаксисе и после продольного разреза кожи устанавливали лазер (длина волны – 560 нм). Облучение коры височно-теменных долей проводили в течение 15 мин, после чего операционную рану ушивали. Постишемические периоды составляли 24 ч и 3 сут, после чего животным, отобранным для гистологического исследования, под глубоким хлоралгидратным наркозом проводили суправитальную транскардиальную перфузию фиксирующим раствором: 40%-ный формалин, 96%-ный спирт, ледяная уксусная кислота в соотношении 2 : 7 : 1. После перфузии мозг животных извлекали и помещали в 70%-ный спирт для последующей гистологической обработки. Гистологический материал – ткань коры головного мозга из очага поражения обрабатывали по методикам, общепринятым при приготовлении парафиновых срезов [17].

Для исследования радикальных процессов, в том числе и в биологических системах, широко используется метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) [18–20]. В нашей работе относительное содержание оксида азота в коре головного мозга крыс определяли стандартным методом спиновой ловушки и ЭПР [21, 22]. В качестве ловушки использовали диэтилдитиокарбамат натрия (ДЭТК), который вводили крысе внутрибрюшинно из расчета 500 мг/кг веса. Сразу после введения ДЭТК животному внутримышечно вводили водный раствор смеси 29 мМ FeSO₄ и 116 мМ цитрата натрия (2.0 мл/кг веса). Образующиеся in vivo комплексы ДЭТК и Fe равномерно распределялись в органах и тканях и связывали оксид азота, образуя парамагнитные комплексы, которые находятся в равновесии с концентрацией NO в ткани. Через 30 мин животных декапитировали, образцы коры головного мозга замораживали в жидком азоте и регистрировали сигнал ЭПР комплекса NO–Fe–ДЭТК при температуре жидкого азота на ЭПР-спектрометре фирмы “Bruker EMX-8”. Репрезентативные сигналы ЭПР спиновой ловушки в мозге крысы представлены на рис. 2. Сигнал ЭПР представляет собой суперпозицию сигнала комплекса NO–Fe–ДЭТК, а также других парамагнитных центров, которые обнаруживаются в тканях. Однако крайняя низкополевая компонента не перекрывается другими сигналами. Это позволяет оценивать относительную концентрацию оксида азота по этой компоненте триплетной сверхтонкой структуры этого комплекса [21].

Рис. 2.

Спектры ЭПР: а – кора головного мозга интактной крысы; б – кора головного мозга крысы через 24 ч после фототромбоза сосудов; в – кора головного мозга на третьи сутки после фототромбоза сосудов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В течение 24 ч после фототромбоза в коре происходило формирование фокального ишемического очага. На гистологических срезах головного мозга, взятых у экспериментальной группы животных, при сравнении с контролем (рис. 3а), которым служил интактный мозг, в ишемическом очаге выявлялась зона формирования тотального некроза, содержавшая нейроны с признаками повреждения, характерными для данной стадии постишемического периода (рис. 3б): перицеллюлярный отек, сморщивание тел нейронов, гомогенизация цитоплазмы, исчезновение глыбок хроматина, изменение конфигурации ядра. Окончательное формирование зоны некроза, содержащей погибшие нейроны и глию, заканчивалось на третьи сутки постишемического периода (рис. 3в), после чего начинается процесс заживления. Таким образом, для определения вероятности участия оксида азота в процессах развития ишемии и постишемического восстановления мозга регистрировалось относительное содержание оксида азота в контроле через сутки (острый период) и через трое суток (начало ремиссии). На рис. 2 представлены спектры ЭПР комплексов NO–Fe–ДЭТК коры головного мозга крысы. Стрелкой отмечена компонента, по величине которой оценивалось относительное содержание оксида азота.

Рис. 3.

Гистологические срезы коры головного мозга крысы: а – контроль, кора интактного мозга; б – состояние сосудистого русла, постишемический период – 24 ч (слева – интактный сосуд, справа – измененный сосуд в зоне ишемизации с последующим формированием зоны некроза (стрелки)); в – состояние сосудистого русла, постишемический период – 3 сут, сосуд после реперфузии в зоне ишемизации (стрелка) и сформировавшаяся зона некроза (внизу). Окрашивание: гематоксилин-ванадиево-кислый фуксин. Увеличение ×40.

Изменение относительного содержания оксида азота представлено в табл. 1. Через сутки после тромбирования сосуда содержание оксида азота в коре головного мозга изменяется незначительно. Существенные изменения наблюдаются через трое суток после проведения операции. По времени это увеличение совпадает с началом процесса заживления после окончания острого периода (см. рис. 3в). Можно предположить, что оно обусловлено двумя факторами. С одной стороны, активируется эндотелиальная NO-синтаза, что приводит к расширению сосуда и частичной компенсации снижения кровотока вследствие тромбирования [11]. С другой стороны, начинается процесс как некротической, так и апоптотической гибели поврежденных нервных тканей. Как известно, при этом активируются нейрональная и индуцибельная NO-синтазы [23] и увеличивается содержание оксида азота в тканях мозга. Оксид азота реагирует с активными формами кислорода, при этом наиболее важным аспектом является его взаимодействие с супероксидным анион-радикалом с образованием пероксинитрита – сильного проапоптотического фактора [24–26].

Изменение содержания оксида азота в условиях острой ишемии изучалось ранее [23–25]. При обсуждении результатов необходимо отметить два принципиальных момента.

1. Примененная в работе [25] методика инициации острой ишемии принципиально отличается от нашего метода. В этой и более ранних работах других авторов [23, 24] ишемия инициировалась путем кратковременного пережатия сонной артерии, что вызывало тотальное повреждение мозга. Процесс же восстановления (реперфузии) вызывали путем прекращения пережатия артерии и восстановления кровотока. При использовании лазерной окклюзии тромбируется относительно небольшая сеть сосудов. Восстановление носит естественный характер за счет компенсаторного эффекта: поврежденный участок дополнительно снабжается кислородом при помощи неповрежденных сосудов. Такой подход значительно ближе к реально наблюдаемому ишемическому инсульту.

2. В работе [25] наблюдалось увеличение содержания оксида азота в первые 30 мин после инициации ишемии. Авторы справедливо связывают это с активацией эндотелиальной NO-синтазы и релаксацией сосудов. В нашей работе мы наблюдаем существенные изменения содержания NO на третьи сутки после тромбирования, т.е. в условиях, когда начинается развитие апоптоза, обусловленного активацией индуцибельной NO-синтазы и образованием пероксинитрита. Полученные результаты еще раз свидетельствуют о том, что на разных этапах развития физико-химических процессов, вызванных гипоксией, оксид азота может играть как нейропротекторную, так и нейротоксическую роль.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в работе показано, что на третьи сутки в условиях ишемии, инициированной гипоксией, в очаге ишемического повреждения происходит увеличение содержания оксида азота – универсальной молекулы, запускающей многочисленные химические и биохимические процессы в клетках. В гистологических экспериментах установлено, что острый ишемический процесс заканчивается через сутки после лазерной операции, а через трое суток начинается процесс активной ремиссии с соответствующими морфологическими изменениями очага поражения. Важно отметить, что увеличение относительного содержания оксида азота происходит не в острой фазе ишемического процесса, а по времени совпадает с началом ремиссии. Можно предположить, что оксид азота играет важную роль в процессе восстановления тканей после ишемического поражения.