Кинетика и катализ, 2021, T. 62, № 2, стр. 198-207

ВВЕДЕНИЕ

Глутатион (GSH) – природный эндогенный тиол, который содержится в биологических тканях и жидкостях в высоких концентрациях (0.1–10 мМ), на порядки превосходящих концентрации других компонентов антиоксидантной системы. Считается, что GSH регулирует функции белков и экспрессию генов, реагирует с гидроксильными и пероксильными радикалами, восстанавливает гидропероксиды, дисульфидные связи, предотвращает окисление протеинов [1–3]. В литературе отмечают существенные изменения в содержании глутатиона при развитии многих патологий, в том числе при болезнях Альцгеймера, Паркинсона, сердечно-сосудистых и онкологических заболеваниях [4–9].

Ранее мы детально исследовали механизм реакции GSH с H₂O₂ в среде бидистиллированной деионизированной воды [10–14]. Установлено, что взаимодействие GSH и H₂O₂ сопровождается образованием радикалов [10, 11]. Методом ингибиторов с использованием оригинального акцептора радикалов [10, 15] было показано, что в деионизированной воде выход радикалов в реакции с Н₂О₂ наблюдается и в случае других тиолов: цистеина, гомоцистеина, ацетилцистеина. В [10] на основе своих и литературных данных была построена кинетическая модель взаимодействия GSH с H₂O₂, включающая 13 квазиэлементарных реакций с соответствующими константами скорости, которая удовлетворительно описывала кинетические кривые расходования GSH и инициирования радикалов (расходования акцептора радикалов). В [16] методом спиновых ловушек с использованием 5,5-диметил-1-пирролин-N-оксида (DMPO) было показано, что при взаимодействии GSH с H₂O₂ действительно образуются тиильные радикалы. Выход радикалов небольшой, но даже в таком количестве они могут инициировать цепные процессы. В [13, 14] установлено, что в присутствии Н₂О₂ в водных растворах инициируются цепные тиол-ен реакции GSH с ненасыщенными фенолами ресвератролом и кофейной кислотой. Реакции тиолов с олефинами (тиол-ен реакции, гидротиолирование алкенов) с образованием тиоэфиров известны давно с 1905 г. [17]. Но в последние десятилетия им уделяется большое внимание в связи с возможностью селективного и стереоселективного синтеза разнообразных соединений в полимерной и медицинской химии [18–20]. Ресвератрол и кофейная кислота – растительные полифенолы, метаболиты биосинтеза лигнина, содержат ненасыщенную связь в боковых заместителях ароматического каркаса. В последнее время эти фенолы, в особенности ресвератрол (RVT, 3,5,4'-тригидроксистильбен), привлекают внимание медиков и биохимиков в связи с так называемым “французским парадоксом” – необычно низким уровнем сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний при высококалорийном питании с обилием жиров, наблюдаемом в некоторых регионах Франции на фоне регулярного потребления красного вина [21, 22]. Благодаря наличию ненасыщенной связи, сопряженной с двумя фенольными фрагментами (схема 1 ), RVT может существовать в транс- и цис-форме, и активно реагировать с тиильными радикалами, которые с высокими константами скорости (∼10⁵ М^–1 с^–1) обратимо присоединяются к двойным связям и катализируют цис–транс-изомеризацию олефинов [23, 24].

Схема 1 . Структурные формулы глутатиона и ресвератрола.

В настоящей работе экспериментально исследованы кинетические закономерности взаимодействия GSH с ресвератролом в присутствии Н₂О₂, методом масс-спектрометрии (MS-электроспрей положительных ионов) изучен состав продуктов, образующихся в реакциях GSH с Н₂О₂ и с RVT. C учетом полученных данных о тиол-ен реакции GSH с RVT, а также литературных сведений о реакциях GSH, H₂O₂ и тиильных радикалов предложена уточненная кинетическая модель сложного процесса взаимодействия GSH и H₂O₂ и тиол-ен реакции с RVT (в водной среде при 37°С), которая хорошо описывает особенности кинетики процесса в широком диапазоне концентраций реагентов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глутатион (GSH), реактив Эллмана (DTNB, 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойная кислота))-“Sigma-Aldrich”, пероксид водорода, Н₂О₂, “PanReac AppliChem”, транс-ресвератрол (RVT), “abcrGmbH”, использовали без очистки.

В качестве реакционной среды использовали деионизированную воду.

Базовый раствор RVT (13.3 мМ) готовили в этаноле (“Медхимпром”), который добавляли к реакционной смеси. Концентрацию H₂O₂ (в отсутствие GSH) контролировали методом йодометрии. Концентрацию GSH определяли с применением реактива Эллмана спектрофотометрически при λ_max = 412 нм и ε = 0.14 × 10⁵ М^–1 см^–1 [25, 26].

Тиол-ен реакцию GSH с RVT проводили при температуре 37°С непосредственно в термостатируемой кювете спектрофотометра СФ-2000 (ООО “ОКБ Спектр”, Россия), в которой регистрировали расходование RVT ε = 0.3 × 10⁵ М^–1 см^–1 при λ_max = 304–308 нм, а также в стеклянной термостатируемой ячейке, снабженной устройствами для отбора проб и барботажа воздухом. По ходу реакции из реакционного сосуда отбирали аликвоты по 90 мкл для анализа RVT и GSH. Аликвоты добавляли соответственно к 3 мл деионизированной воды и натрий-фосфатного буферного раствора (PBS, рН 7.4), содержащего 0.3 мМ DTNB, и записывали УФ-спектры.

GSH, содержащий две карбоксильных группы, при физиологической концентрации (0.1–10 мМ) образует кислые растворы (рН 3–4). В работе [27] нами были выявлены существенные различия в кинетике и механизме реакции GSH с Н₂О₂ в деионизированной воде и в фосфатных буферных системах с рН ≥ 7, часто применяемых в биохимических исследованиях. Поэтому в каждом опыте измеряли pH растворов рН-метром-милливольтметром рН-410 (“Аквилон”, Россия). Ошибка в измерении рН составляла ±0.02. Ошибка в измерении скоростей расходования GSH и RVT не превышала 15%.

Исследования молекулярных продуктов реакции проводили методом масс-спектрометрии в Центре коллективного пользования “Новые материалы и технологии” ИБХФ РАН на тандемном масс-спектрометре LTQ FT Ultra (“Thermo Finnigan”, Германия) методом электроспрейной ионизации в режиме измерения положительных ионов. Непосредственно перед вводом в масс-спектрометр образец разбавляли в 20 раз 50%-ным раствором ацетонитрила с добавлением 0.1% муравьиной кислоты.

Компьютерное моделирование кинетических кривых расходования реагентов в реакции GSH с RVT в присутствии H₂O₂ и оптимизацию констант скоростей 19-ти квази-элементарных реакций, составляющих кинетическую модель процесса осуществляли с использованием программы [28].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Кинетические особенности тиол-ен реакции глутатиона с ресвератролом в присутствии пероксида водорода в деионизированной воде

Выше отмечалось, что концентрация GSH в биологических тканях и жидкостях на порядки выше микромольной концентрации других компонентов антиоксидантной системы. Поэтому в экспериментах, как правило, [GSH] варьировали в диапазоне 0.1–10 мМ, а [RVT] были порядка 1–100 мкМ. На рис. 1 представлены кинетические кривые расходования RVT в отсутствие (кривая 1) и в присутствии Н₂О₂ при разных концентрациях GSH (кривые 2–5). Видно, что расходование RVT, который является эффективным акцептором радикалов, наблюдается только при совместном присутствии GSH и Н₂О₂ (кривые 3–5). Необходимо отметить, что введение GSH в реакционную среду приводит к снижению рН (табл. 1).

Рис. 1.

Кинетические кривые расходования 0.03 мМ RVT в реакции с GSH в отсутствие (1) и в присутствии 4.55 мМ Н₂О₂ (2–5); концентрация GSH (мМ): 1 – 25 (концентрация RVT – 0.033 мМ); 2 – 0; 3 –2.5; 4 – 5; 5 – 10. Точки – экспериментальные данные, сплошные линии – расчетные данные по кинетической модели (табл. 2).

Таблица 1.

  Кинетические характеристики расходования 0.03 мМ RVT при разных концентрациях GSH в присутствии 4.55 мМ Н₂О₂ в деионизированной воде при 37°С

[GSH], мM	рН	WGSH × 107, М/с	WRVT × 109, М/с	*Wi × 109, М/с
0	6.70	0	0	0
2.0	3.28	1.62	4.3	2.1
2.5	3.23	1.72	5.5	2.5
5.0	3.10	2.14	8.2	4.2
7.0	3.03	2.37	11.6	5.4
10.0	3.00	2.63	17.5	7.1

Из рис. 2 следует, что начальная скорость расходования RVT (W_RVT) линейно возрастает с ростом его начальной концентрации. Ранее в [10] нами были получены эмпирические зависимости для скорости расходования глутатиона (W_GSH) и скорости инициирования радикалов (W_i) при взаимодействии GSH и Н₂О₂, измеренной методом ингибиторов:

(1)

$\begin{gathered} {{W}_{{{\text{GSH}}}}} \cong {\text{const}}\left[ {{\text{GSH}}} \right]_{0}^{{0.3}}\left[ {{{{\text{H}}}_{{\text{2}}}}{{{\text{O}}}_{2}}} \right]_{0}^{{1.2}}, \\ {\text{где}}\,\,{\text{сonst}} = (1.7 \pm 0.2) \times {{10}^{{ - 3}}}\,\,{{{\text{М}}}^{{ - 0.5}}}\,\,{{{\text{с}}}^{{ - 1}}}. \\ \end{gathered} $

(2)

$\begin{gathered} {{W}_{{\text{i}}}} \cong {\text{const[GSH}}{{{\text{]}}}^{{0.75}}}{{[{{{\text{H}}}_{{\text{2}}}}{{{\text{O}}}_{{\text{2}}}}]}^{{0.75}}}, \\ {\text{где}}\,\,{\text{const}} = (1.3 \pm 0.2) \times {{10}^{{ - 5}}}\,\,{{{\text{М}}}^{{ - 0.5}}}\,\,{{{\text{с}}}^{{ - 1}}}. \\ \end{gathered} $

Рис. 2.

Зависимости скоростей расходования RVT (W_RVT) от концентрации RVT в реакционной смеси 4.55 мМ Н₂О₂ с разными концентрациями GSH (мМ): 1 – 10; 2 – 5; 3 – 2.5.

Скорость расходования RVT (W_RVT), как и W_GSH [10], нелинейно зависит от концентраций GSH и Н₂О₂. В табл. 1 представлены значения W_RVT, экспериментально измеренные при разных концентрациях GSH в присутствии 4.55 мМ Н₂О₂, и скорости инициирования радикалов (*W_i), рассчитанные по уравнению (2). Примечательно, что значения скоростей, отсекаемые линейными зависимостями W_RVT – [RVT] (рис. 2) на оси ординат, практически (в пределах ошибки) совпадают с расчетными значениями *W_i для соответствующих концентраций GSH. Длина цепи в расходовании ресвератрола (W_RVT/W_i), как можно видеть из табл. 1, невелика, порядка 2-х звеньев, а выход радикалов меньше 1% (W_i/W_GSH < 0.01).

Скорость расходования RVT удовлетворительно описывается уравнением (3) для цепных реакций окисления и полимеризации с квадратичным обрывом цепей на ведущих цепи радикалах [29]. В [13, 14] мы предположили, что в цепной реакции ненасыщенных фенолов с GSH в присутствии Н₂О₂ обрыв происходит на тиильных радикалах GS^•, а лимитирующей стадией является реакция радикала с RVT:

(3)

${{W}_{{{\text{RVT}}}}} = {{W}_{{\text{i}}}} + а\left[ {{\text{RVT}}} \right]W_{{\text{i}}}^{{0.5}}.$

Здесь параметр а ≅ 3.5 М^–0.5 с^–0.5. аналогичен отношению констант скорости реакций продолжения (k_p) и обрыва цепей (k_t)

$а = {{{{k}_{{\text{p}}}}} \mathord{\left/ {\vphantom {{{{k}_{{\text{p}}}}} {{{{(2{{k}_{{\text{t}}}})}}^{{0.5}}}}}} \right. \kern-0em} {{{{(2{{k}_{{\text{t}}}})}}^{{0.5}}}}}.$

Анализ продуктов

Исследования молекулярных продуктов реакции проводили методом масс-спектрометрии с применением электроспрейной ионизации в режиме измерения положительных ионов. На рис. 3а приведен масс-спектр исходного образца GSH, в котором наряду с молекулярным ионом МН⁺ 308.09 присутствуют ионы М'Н⁺ 615.17, свидетельствующие о наличии в образце достаточно устойчивых димеров GSH–GSH. В работе [30] было отмечено, что при исследовании масс-спектров GSH методом электроспрея отрицательных ионов в водном растворе наряду с ионами GSH обнаруживаются ионы димера, тогда как в фосфатном буферном растворе (0.1 М, рН ∼ 7) димер не регистрируется. Очевидно, одноименно отрицательно заряженные вследствие диссоциации карбоксильных групп ионы глутатиона не образуют димеров при рН ≥ 7.

Рис. 3.

Масс-спектры исходного глутатиона (a), продуктов реакции 10 мМ GSH с 2 мМ Н₂О₂ (б) и продуктов, образующихся в смеси 2.3 мМ GSH, 1.3 мМ RVT и 3.2 мМ Н₂О₂ (в) в деионизированной воде.

Основным продуктом окисления GSH в реакции с Н₂О₂ является соответствующий дисульфид GSSG (M''Н⁺ 613.16) (рис. 3б). Реакция происходит в соответствии с известным и многократно подтвержденным [30–34] стехиометрическим уравнением:

$2{\text{GSH}} + {{{\text{H}}}_{{\text{2}}}}{{{\text{O}}}_{2}} \to {\text{GSSG}} + 2{{{\text{H}}}_{{\text{2}}}}{\text{O}}{\text{.}}$

На рис. 3в в масс-спектре продуктов, полученных в реакционной смеси 2.3 мМ GSH, 1.3 мМ RVT и 3.2 мМ Н₂О₂ в исходно деионизированной воде видно, что основной продукт – дисульфид GSSG (MН⁺ 613.16). Наряду с GSSG образуется продукт МН⁺ 568.16 с массой, соответствующей гидропероксиду (PO₂H), который может получиться в результате последовательного присоединения тиильного радикала GS^• и кислорода к RVT:

${\text{G}}{{{\text{S}}}^{ \bullet }} + {\text{RVT}} \rightleftarrows {{{\text{P}}}^{ \bullet }},$

${{{\text{P}}}^{ \bullet }} + {{{\text{O}}}_{2}} \to {\text{PO}}_{2}^{ \bullet },$

${\text{PO}}_{2}^{ \bullet } + {\text{GSH}} \to {\text{P}}{{{\text{O}}}_{{\text{2}}}}{\text{H}} + {\text{G}}{{{\text{S}}}^{ \bullet }}.$

Кинетическая модель взаимодействия глутатиона c ресвератролом

Для анализа кинетики взаимодействия GSH с RVT в присутствии Н₂О₂ использовано компьютерное моделирование с использованием программы [28]. Ранее в [10] мы представили кинетическую модель взаимодействия GSH с Н₂О₂, которая включала 13 квазиэлементарных реакций. С учетом дополнительных экспериментальных и уточненных в литературе данных для описания взаимодействия GSH с Н₂О₂ оставлено 10 реакций (табл. 2, реакции (I)–(X)).

Таблица 2.

  Кинетическая модель взаимодействия GSH с RVT в присутствии Н₂О₂ в водной среде при 37°С

№№	Реакции	Константы скорости	Значение ki, М–1 с–1
I	GSH + H2O2 → K	k1	5
II	K → GSH + H2O2	k2	*4 × 10–3
III	K + GSH → GSSG + 2H2O	k3	6 × 10–2
IV	GSH + GSH → C	k4	1.3
V	C → GSH + GSH	k5	*9 × 10–4
VI	C + H2O2 → GSSG + 2H2O	k6	1.5 × 10–3
VII	C + H2O2 → 2GS• + 2H2O	k7	2 × 10–5
VIII	GSH + H2O2 → •OH + GS• + H2O	k8	1 × 10–3
IX	•OH + GSH → H2O + GS•	k9	1 × 106
X	GS• + GS• → GSSG	k10	1 × 109
XI	GS• + RVT → P•	k11	2.5 × 105
XII	P•→ GS• + RVT	k12	*1 × 104
XIII	P• + GSH → GS• + PH	k13	5 × 104
XIV	P• + (O2) → ${\text{PO}}_{{\text{2}}}^{\centerdot }$	k14	**1 × 106
XV	${\text{PO}}_{{\text{2}}}^{\centerdot }$ + GSH → POOH + GS•	k15	5 × 103
XVI	GS• + ${\text{PO}}_{{\text{2}}}^{\centerdot }$ → GSH + O2	k16	1 × 109
XVII	GSH + RVT → Y	k17	5
XVIII	Y → GSH + RVT	k18	2 × 10–4
XIX	Y + GS• → P• + GSH	k19	1 × 106

Примечание. К – комплекс GSH–H₂О₂; С – комплекс GSH–GSH; Y – комплекс GSH с RVT; P^• – алкильный радикал, образующийся в результате присоединения тиильного радикала GS^• к двойной связи RVT; ${\text{PO}}_{2}^{ \bullet }$ и POOH – соответствующие пероксильный радикал и гидропероксид.   * Константа скорости имеет размерность с^–1. ** k₁₄ = k [O₂] имеет размерность с^–1; [O₂] = 1 × 10^–4 M.

Поскольку в серии работ [35–38] приводятся достаточно убедительные результаты спектроскопических (УФ и ИК) исследований и теоретического анализа [36] появлению комплексов GSH–Н₂О₂ не только в буферных растворах с физиологическим рН, но и в чистой воде [37], которая при добавлении GSH имеет рН 2, мы сохранили в кинетической модели реакции (I)–(III) образования комплекса К (GSH–Н₂О₂) и окисления его в дисульфид GSSG, хотя в масс-спектрах продуктов реакции (рис. 3б) не обнаруживается соответствующий комплексу ион МН⁺ 342.

Примечательно, что измеренная в [37] методом время-разрешенной рамановской спектроскопии скорость расходования GSH при концентрациях реагентов 1 М, равная 2 × 10^–3 М/с, практически совпадает с величиной скорости W_GSH = = 1.8 × 10^–3 M/c, рассчитанной по уравнению (1).

В [27] мы показали, что в фосфатных буферных системах при рН ≥ 7 усиливается реакция окисления GSH кислородом воздуха и резко снижается скорость инициирования радикалов в реакции GSH с Н₂О₂ по сравнению с W_i в деионизованной воде. При рН ≥ 7 не образуются димеры глутатиона. Поэтому при конструировании модели было принято, что выход радикалов происходит, в основном, в реакции (VII) при взаимодействии димера GSH–GSH (С, табл. 2) с Н₂О₂. Реакции (VII) и (VIII), которые поставляют радикалы, практически не влияют на скорость расходования GSH (W_GSH). Тиоловая группа –SH в комплексах К [35] и С определяется реактивом Эллмана так же, как в свободном GSH. Величина k₁₀ = 10⁹ М^–1 с^–1 известна для быстрой рекомбинации тиильных радикалов [34].

Реакции XI–XVI имеют место при добавках RVT и вместе с остальными реакциями описывают кинетические кривые расходования RVT. Известно, что тиильные радикалы с высокими константами скорости обратимо (∼10⁵ М^–1 с^–1) присоединяются к двойным связям –С=С– [23, 40], поэтому в модель введены реакции (XI) и (XII). Образующийся в результате присоединения GS^• к RVT алкильный радикал P^• может прореагировать с GSH (k₁₃ ≈ 10⁵–10⁶ М^–1 с^–1 [23, 40]) или с кислородом, поскольку опыты проводили в аэробных условиях (k₁₄ ≈ 10⁹–10¹⁰ М^–1 с^–1 [41]). В табл. 3 приведены рассчитанные по модели значения квазистационарных концентраций радикалов, из которых видно, что в присутствии О₂ доминируют пероксильные радикалы ${\text{PO}}_{2}^{\centerdot }$ и увеличивается содержание молекулярных продуктов присоединения радикалов GS^• к RVT. Определяющая роль О₂ в кинетике присоединения тиильных радикалов к олефинам при изучении ее методом флеш-фотолиза отмечена и проанализирована в работах [41, 42].

Таблица 3.

  Влияние кислорода на тиол-ен реакцию GSH с RVT в присутствии Н₂О₂*

Условия	[GS●], М	[P●], М	[${\text{PO}}_{2}^{ \bullet }$], М	[PH], М	[POOH], М	ΔGSH, М
Без RVT, Реакции (I)–(X)	7.3 × 10–10	–	–	–	–	3.37 × 10–4
C RVT без O2 Реакции (I)–(XIII)	7.3 × 10–10	8.6 × 10–12	–	1.9 × 10–6	–	3.39 × 10–4
С RVT и О2 Реакции (I)–(XVI)	9.96 × 10–11	1.9 × 10–14	5.06 × 10–9	4.0 × 10–9	9.2 × 10–5	4.2 × 10–4
C Y (GSH–RVT) Реакции (I)–(XIX)	4.76 × 10–11	3.2 × 10–14	9.6 × 10–9	5.3 × 10–9	1.54 × 10–4	2.2 × 10–4

* Рассчитанные по модели для рис. 4 значения концентраций компонентов при t = 150 мин. Прочерки означают, что в расчете (см. Условия) не учитывались реакции с участием этих частиц.

На рис. 4 представлены экспериментально многократно повторенные и воспроизводимые кинетические кривые расходования глутатиона и ресвератрола, взятых при сопоставимых по масштабу концентрациях. Вопреки нашим ожиданиям, в присутствии RVT скорость расходования GSH не увеличивается за счет дополнительного расходования в цепной реакции с RVT, а уменьшается. Чтобы получить такой эффект, модель дополнили обратимым связыванием RVT с GSH в комплекс Y (реакции (XVII)–(XIX)).

Рис. 4.

Кинетические кривые расходования 1.9 мМ GSH (1, 2, 3) и 0.53 мМ RVT (3) в присутствии 2.1 мМ Н₂О₂: 1 – GSH (◆) с RVT; 2 – GSH (△) без RVT; водная среда, 37°С. Точки – экспериментальные данные, сплошные линии – расчетные данные по кинетической модели (табл. 2).

Представленная кинетическая модель с оптимизированными константами скоростей вполне удовлетворительно описывает экспериментальные концентрационные зависимости для W_RVT и W_GSH (рис. 2 и табл. 1), а также экспериментальные кинетические кривые расходования RVT и GSH в реакции GSH с RVT в присутствии Н₂О₂ (рис. 1 и 4).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Опираясь на экспериментально полученные кинетические кривые и концентрационные зависимости скорости расходования глутатиона и ресвератрола в присутствии H₂O₂ от концентраций реагентов (в водной среде при 37°С) и данные по составу продуктов, разработана кинетическая модель взаимодействия GSH с RVT, инициированного тиильными радикалами, образующимися в реакции GSH с H₂O₂. Скелетная модель включает 19 реакций с соответствующими оптимизированными для условий эксперимента значениями констант скоростей. Реакции образования комплексов GSH–H₂O₂ и GSH–GSH позволили описать нетривиальные концентрационные зависимости скорости расходования глутатиона и инициирования радикалов при взаимодействии GSH с H₂O₂, реакции (XIV) и (XV) отражают важную роль кислорода воздуха в радикально-цепном расходовании RVT. Дополнение модели обратимыми реакциями (XVII)–(XIX) образования комплексов RVT с компонентами процесса позволило описать нетривиальный эффект заметного уменьшения скорости расходования GSH при повышенных концентрациях RVT. Подавляющее большинство исследований по биохимии GSH проводят в условиях, близких к физиологическим в животных организмах, т.е. в буферных растворах, обеспечивающих рН 7.2–7.4. В таких условиях радикалы в реакции GSH с H₂O₂ не образуются [27], и, следовательно, нет расходования RVT. Возможно, обнаруженное нами образование радикалов при взаимодействии GSH с H₂O₂ и другими пероксидами, а также реакции GSH с ненасыщенными фенолами имеют место и играют роль в физиологии растений, в которых внутри- и межклеточные жидкости характеризуются более низкими по сравнению с фауной значениями рН, при использовании тиолов в косметике, фармацевтике, приготовлении БАДов и в виноделии.