Коллоидный журнал, 2021, T. 83, № 5, стр. 611-619

ВВЕДЕНИЕ

Алкилгидразины – токсичные вещества первого класса опасности, обладают нейро- и гепатотоксическими свойствами, воздействуют на иммунную систему человека и способны полностью подавлять синтез иммуноглобулинов [1]. Развитие иммунодефицитов – основная причина увеличения инфекционной патологии и паразитарных болезней у населения территорий вблизи космодромов [2, 3]. Метаболизм алкилгидразинов в организме животных и человека до конца не изучен, поэтому в рекомендациях ВОЗ, касающихся гигиенических критериев состояния окружающей среды, проблема изучения и предотвращения токсичного воздействия гидразинов и других компонентов ракетного топлива на человека и экосистему определена как приоритетная. Несмотря на достаточно большой объем исследований, проведенных с несимметричным диметилгидразином (НДМГ) и его производными, все еще остается ряд невыясненных вопросов, касающихся механизма взаимодействия гидразинов с биополимерами и взаимосвязи состава биологических жидкостей организма с их физико-химическими свойствами.

Насекомые, в частности, личинки гусениц Galleria mellonella L (GM) широко используются в качестве модельных живых организмов при исследовании иммунного ответа на воздействие токсичных соединений [4–6]. В ответ на внешний раздражитель в организме насекомых образуется целый букет разнообразных веществ, которые немедленно нейтрализуют бактерии, грибки или вирусы. Врожденная иммунная система GM производит множество пептидов бактерицидного и противогрибкового действия, которые действуют на клеточную мембрану агрессоров, вызывая ее проницаемость или даже распад благодаря сорбции на поверхностности мембраны и порообразующему действию [5–7]. Биоактивные пептидные продукты, получаемые на основе иммунных реакций насекомых, являются основой для разработки новых фармакологических средств [7].

В работах [3–6, 8] проводилось исследование иммунного ответа GM на воздействие различных грамотрицательных и грамположительных бактерий и грибов, были идентифицированы пептиды в гемолимфе гусениц. Работы авторов [9–13] посвящены оптимизации условий разделения и идентификации пептидных смесей GM. Была разработана методология хроматографического разделения индуцированных пептидов и их масс-спектрометрической идентификации, обнаружены новые антимикробные пептиды, оказывающие влияние на скорость метаболических процессов. Комбинация методов обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) и масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (МАЛДИ-МС) при исследовании пептидов существенно облегчает их поиск в сложных смесях, поскольку позволяет проводить фракционирование целенаправленно, устанавливать аминокислотные последовательности полипептидов путем интерпретации масс-спектров по базам данных и на веб-сервисах [14–17].

Целью данной работы являлось изучение влияния НДМГ, 1,1-диметилгидразина, и его гидразона с ацетоном на пептидный состав гемолимфы личинок гусеницы GM путем обнаружения и идентификации пептидных продуктов, индуцированных организмом в ответ на воздействие токсикантов. Результаты экспериментальных исследований могут внести существенный вклад в понимание механизма токсичного действия гидразинов и в разработку средств повышения иммунитета населения, проживающего в экологически неблагоприятных районах.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В качестве объекта исследования использовали личинки гусениц GM, выращенные в питомнике Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН по методике [18]. Иммунизацию личинок (38–50 особей) проводили, вводя в брюшную полость личинки по 5 мкл 1%-ного водного раствора НДМГ или его гидразона с ацетоном (группа № 1) или по 0.5 мкл 0.01%-ного раствора НДМГ или его гидразона с ацетоном (группа № 2). Через сутки после иммунизации к охлажденной гемолимфе выживших личинок GM добавили кристаллик фенилтиомочевины, ингибитор протеаз (Inducible serine protease inhibitor 1) и дистиллированную воду. Затем осадили клетки и дебрис полученных образцов гемолимфы в центрифуге (10 000 об/мин, 15 мин). Белки осаждали трифторуксусной кислотой (ТФУ) (группа № 1) или ее 0.4%-ным раствором в метаноле (группа № 2). Суспензии разделяли в центрифуге (13 000 об./мин, 15 мин) и отбирали супернатант (надосадочную жидкость) для проведения ВЭЖХ. Супернатант группы № 2 дополнительно упаривали до 100 мкл на вакуумной центрифуге. Так же была получена гемолимфа контрольной группы неиммунизированных гусениц. Супернатант гемолимфы личинок GM, обработанных аналогичным образом бактериальными иммунизирующими агентами, по данным [11–13] обогащен преимущественно антимикробными пептидами. Способы получения гемолимфы личинок, подготовки образцов к биохимическим и физико-химическим исследованиям подробно описаны в [11]. В настоящей работе в качестве образца сравнения использовали пептидную смесь, полученную из неиммунизированных или раненных стерильной иглой гусениц.

Разделение антибактериальных пептидов методом ОФ ВЭЖХ проводили на колонке Zorbax Eclipse XDB-С18 (Agilent Technologies, США) размером 150 мм × 4.6 мм, заполненной SiO₂-С18 (размер зерна 5 мкм, диаметр пор 80 Å) и упакованной в жидкостной хроматограф Agilent 1200 с диодно-матричным детектором и программным обеспечением ChemStation А.10.02. УФ-спектры регистрировали при 210–224 и 280 нм. Подвижная фаза: А – 0.04% ТФУ в воде (V/V), В – 0.04% ТФУ в ацетонитриле; режим градиентного элюирования: 10% B в диапазоне 0–5 мин, 10–80% B в диапазоне 5–40 мин, скорость потока 0.5 мл/мин, температура колонки 25°C, объем вводимой пробы 20 мкл, сбор фракций через каждые 0.5–1.5 мин.

Масс-спектрометрическое исследование фракций гемолимфы методом МАЛДИ-МС проводили с помощью масс-спектрометра UltraFlex II TOF (Bruker Daltonics, Германия) с азотным лазером (рабочая длина волны 337 нм, частота импульса 20 Гц, энергия ионизации 110 кДж), времяпролетным масс-анализатором с рефлектоном и программным обеспечением для сбора и обработки масс-спектров FlexControl 3.4 и FlexAnalysis 3.4. Ускоряющее напряжение и напряжение на рефлектроне – 25 и 26.5 кВ соответственно. Масс-спектры получали в режиме регистрации положительных ионов в массовом диапазоне 0–250 кДа. Для изучения фрагментации исходных метастабильных протонированных молекул пептидов применяли режим распада за пределами ионного источника. Масс-спектры ионов-продуктов регистрировали с помощью метода FAST (Bruker Daltonics). Точность измеренных моноизотопных масс [M + H]⁺ в режиме рефлектрона составляла 0.007%, точность измеренных усредненных масс в линейном режиме – 0.05–0.1%, точность измеренных масс фрагментов – 1–2 Да (0.02–0.1%).

Образцы для МАЛДИ готовили на мишенях AnchorChip с матрицей (2,5-дигидроксибензойной кислотой) от Bruker Daltonics (Германия). Смешивали 10 мкл пептидного раствора и 0.3 мкл раствора матрицы (10 мг/мл) в 20%-ном растворе ацетонитрила в воде с добавкой 0.5%-ного раствора ТФУ. Полученную смесь высушивали на воздухе при атмосферном давлении.

Для увеличения достоверности идентификации новых антибактериальных пептидов проводили их гидролиз трипсином. Идентификацию пептидов осуществляли при помощи программного пакета Mascot [16]. Поиск проводили по данным спектров фрагментации метастабильных протонированных молекул пептидов [M + H]⁺, полученным в работе [9], и присутствующих в базе данных NCBI [17] среди белков всех организмов без указания типа гидролиза или с указанием на трипсин. При помощи программного обеспечения Biotools 3.0 (опция rapid de-novo sequencing [15, 19]) сделана разметка спектров по возможным аминокислотным последовательностям.

Использовали коммерческие реактивы без дополнительной очистки: 1,1-диметилгидразин (98%, Merck, Германия), ацетонитрил (HPLC-gradient grad, Aldrich, США), ТФУ (99%, Alfa Aesar, Германия), метанол, ацетон (Реахим, Россия, “ч. д. а”), а также тридистиллированную воду, дополнительно очищенную на фильтрах Millipore (Milli-P QG, Waters). Фенилтиокарбамид, трипсин, низин, цекропин B от Sigma (США) имели квалификацию “для биохимических исследований”. Гидразон синтезировали по методике [20].

Антибактериальная активность пептидов по отношению к бактериям Escherichia coli (E. coli), штамм М17 определялась по размерам зон ограниченного роста тестовых микроорганизмов (наличие единичных точечных колоний или отсутствие колоний) вокруг бумажных дисков диаметром 6 мм, пропитанных фракциями гемолимфы по сравнению с контрольными фильтрами, пропитанными буферным раствором, не содержащим бактерицидных компонентов [11]. Диски (8 шт. для каждого образца) предварительно стерилизовали с помощью бактерицидных ламп, пропитывали анализируемыми фракциями и помещали на суточные посевы E. coli во влажном состоянии. Посев проводили в микробиологическом боксе на чашки Петри, которые помещали в термостат при 37°C на сутки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Аддитивная модель удерживания пептидов на сорбентах основана на предположении, что характер их взаимодействия с поверхностью сорбентов определяется суммарным эффектом всех взаимодействующих участков молекул [21].

Контакт пептидных продуктов гемолимфы GM с гидрофобной неподвижной фазой C18 протекает с преобладанием дисперсионных взаимодействий и аналогичен процессу сорбции пептидов на липофильной клеточной мембране. На рис. 1 приведены хроматограммы пептидных смесей GM до иммунизации и после иммунизации гидразоном НДМГ с ацетоном (группа № 2), полученные в условиях градиентного режима ОФ ВЭЖХ. Разделение пептидов происходит за счет взаимодействий растворенного вещества с неподвижной фазой С18 и водно-органическим элюентом. Изменение состава элюента – добавление ТФУ в ацетонитрил – оказывает значительное влияние на селективность разделения пептидов в гемолимфе (рис. 1), способствует постоянному значению pH в течение всего процесса разделения и приводит к увеличению времени удерживания пептидов. При этом порядок их элюирования из колонки не изменяется. Установлено, что антимикробные пептиды, являющиеся объектами исследования, элюируются в диапазоне концентраций ацетонитрила 45–75%.

Рис. 1.

Хроматограммы пептидных смесей гемолимфы Galleria mellonella без иммунизации (а, в) и после иммунизации 0.01%-ным водным раствором гидразона НДМГ с ацетоном (б, г) в режимах градиентного элюирования растворами, содержащими ацетонитрил (1, 3) или ацетонитрил с добавкой 0.04% ТФУ (2, 4). Детектирование при 214 нм.

В результате иммунизации GM усложняется хроматографический профиль пептидных смесей гемолимфы, появляются новые пики и увеличивается интенсивность прежних сигналов, т.е. иммунизация личинок приводит к возникновению иммунного ответа и появлению множества новых пептидных компонентов в составе гемолимфы. Это может быть обусловлено как синтезом новых соединений, так и деструктивными процессами. Оптимизация условий хроматографирования позволила получать хроматограммы гемолимфы с достаточно хорошо разделенными пиками (рис. 2).

Рис. 2.

Хроматограммы пептидных смесей гемолимфы Galleria mellonella: 1 – без иммунизации, 2 – иммунизация 1%-ным водным раствором гидразона НДМГ с ацетоном. Детектирование при 210 нм.

В контрольных и иммунизированных смесях гемолимфы детектированы известные антимикробные пептиды GM (табл. 1), которые являются, как правило, дифильными катионными молекулами с массой около 5000 Да, а также фермент лизоцим (14027 Да) и белок аполипофорин-3 (18075 Да).

Экспериментально установлено, что в диапазоне 1.7–5 мин элюируются слабоудерживаемые низкомолекулярные компоненты антикоагулянта в составе образца гемолимфы (ЭДТА и фенилтиокарбамид), имеющие максимумы поглощения в области 210–240 нм, и соединения пептидной природы, появление которых связано с прохождением хроматографического процесса по эксклюзионному механизму на макропористом сорбенте С18 [9, 10].

В диапазоне 5–40 мин появляются сигналы новых веществ пептидной природы, усиливаются или исчезают сигналы, характерные для гемолимфы контрольной группы гусениц GM (табл. 1). При разделении образцов гемолимфы иммунизированных и неиммунизированных личинок в этом диапазоне были отобраны фракции через каждые 2 мин. Далее эти фракции были сконцентрированы и протестированы на биологическую активность, а их пептидный состав охарактеризован масс-спектрометрически (табл. 2).

Обнаружено, что все фракции, полученные после обработки личинок НДМГ и его гидразоном, содержали смеси пептидов, активных против E. coli (табл. 2). Причем ширина зоны ограничения роста Е. coli была больше при использовании гемолимфы иммунизированных личинок, чем неиммунизированных.

Хроматограммы и качественный состав фракций, полученных после иммунизации гусениц GM 0.01%-ными растворами НДМГ и его гидразона с ацетоном (группа № 2), оказались практически одинаковы. В пептидных смесях преобладает пептид № 4, содержится большое количество пептидов №№ 1–3, 6, лизоцима и аполипофорина-3 (табл. 2). Наличие одноименных пептидов во фракциях может быть обусловлено близкими адсорбционными характеристиками биомолекул и степенью их гидрофобности, химическим сродством к другим молекулам, образованием пептидных ассоциатов, а также вкладом межмолекулярного взаимодействия малых и больших пептидов. Следует отметить, что после обработки GM гидразоном НДМГ с ацетоном среди пептидных продуктов была обнаружена протонированная молекула массой 5380 Да, которая может быть фрагментом ингибитора протеаз, использованного при подготовке гемолимфы к исследованиям.

Преимущество метода МАЛДИ-МС состоит в возможности анализа сложных смесей биоактивных компонентов без их разделения. В гемолимфе личинок GM обнаружены фрагменты известных пептидов и новые индуцированные пептиды с массами 3484, 4897, 4969, 6319, 9169 и 9187 Да, проявляющие антибактериальные свойства по отношению к Е. coli (рис. 3, табл. 2). Фрагменты протонированных молекул пептидов № 4 (1825 Да), № 5 (1626, 2078 Да) и № 6 (6976 Да), обнаруженные в гемолимфе после обработки гусениц НДМГ и его гидразоном, были детектированы в [9] после иммунизации личинок GM бактериями B. cereus и E. coli.

Рис. 3.

Масс-спектры МАЛДИ фрагментации индуцированных пептидов [М + Н]⁺ массой 3485 (а) и 9188 Да (б), обнаруженных в гемолимфе Galleria mellonella, иммунизированных 0.01%-ным раствором гидразона НДМГ с ацетоном.

В составе антимикробных фракций пептидных продуктов (табл. 2) присутствуют два неизвестных ранее пептида с массами 4897 и 4969 Да, отличающиеся концевым фрагментом 72 Да (аланин). Спектры фрагментации этих протонированных молекул (рис. 4) имеют сходство с фрагментацией пептида № 2 (Lebocin-like anionic peptide 1). Определяются три разрыва пептидной связи, обусловленные, по-видимому, аспарагиновыми и глутаминовыми кислотами. Однако разрывы локализованы в иных положениях первичной структуры, чем у пептида № 2, поэтому данные пептиды не являются его производными.

Рис. 4.

Масс-спектры МАЛДИ фрагментации индуцированных пептидов [М + Н]⁺ массой 4898 и 4970 Да, в гемолимфе Galleria mellonella, иммунизированных 0.01%-ным раствором гидразона НДМГ с ацетоном.

В случае иммунизации высокими концентрациями НДМГ и его гидразона с ацетоном (группа № 1) методом МАЛДИ-МС детектирована индукция известных антибактериальных пептидов (табл. 1) и их фрагментов, а также большое количество неизвестных пептидов массой до 3000 Да (табл. 3). Количество низкомолекулярных пептидов уменьшается при введении меньших количеств НДМГ и его гидразона (группа № 2). Образование большого числа неизученных пептидов, а также фрагментов известных антимикробных пептидов связано, по-видимому, с окислительно-восстановительной деструкцией пептидов и иммунным ответом гемолимфы GM на воздействие токсикантов.

Исследование процессов распада метастабильных протонированных молекул пептидов, ускоренных в ионном источнике, дает информацию об их фрагментации. Спектры фрагментации очень характерны и позволяют идентифицировать пептиды как по базам данных, так и путем применения правил фрагментации и поиска соответствия масс обнаруженных ионов различным аминокислотным остаткам и пептидным фрагментам [15–17, 22]. На этой основе можно идентифицировать последовательность аминокислот в пептиде. Результаты определения аминокислотной последовательности новых пептидов по метастабильным протонированным молекулам [М + Н]⁺ в спектрах МАЛДИ-МС после распада в ионном источнике представлены в табл. 3.

При ионизации пептидных молекул их распад происходит вдоль скелета по пептидным связям, и заряд локализуется на N- или С-конце (на амино- или карбоксильной группе). Для МАЛДИ-МС в режиме рефлектона наиболее характерным является разрыв амидной связи CO–NH в пептидах, что позволяет при анализе масс-спектров их фрагментов сделать выводы не только о молекулярной массе пептида, но и о его составе и структуре. Кислотно-индуцированные фрагменты, которые являются результатом разрыва амидной связи на С-конце аспарагиновой кислоты D (и, в меньшей степени, глутаминовой кислоты E), доминируют в МАЛДИ масс-спектрах аргининсодержащих пептидов.

Для увеличения достоверности идентификации каждая полученная аминокислотная последовательность была протестирована на соответствие экспериментально определенного времени удерживания t_R и времени удерживания, рассчитанного на основании суммарной степени их гидрофобности [23, 24]. Найденные корреляции подтвердили потенциальную возможность пептидов, указанных в табл. 3, удерживаться на сорбенте в соответствии со своей относительной гидрофобностью. Критерий гидрофобности пептидов был определяющим при оценке надежности их идентификации при проведении de novo секвенирования [19]. Аминокислотные последовательности, не соответствующие данному критерию, в табл. 3 не приводятся. Использование экспериментальной хроматографической информации (в частности, значений t_R) позволяет из нескольких кандидатов на возможные аминокислотные последовательности, полученных из спектров фрагментации метастабильных протонированных молекул пептидов, выбрать те, которые надежно описывают аминокислотный состав пептида.

Исследование методом МАЛДИ-МС первичной структуры Cecropin-D-like peptide и Anionic antimicrobial peptide 2 позволило установить, что после иммунизации GM токсикантами появляется несколько модификаций этих пептидов с разницей в молекулярной массе 14–15 Да (рис. 5), т.е. происходит метилирование первоначальных пептидов, а не их окисление, которое приводило бы к увеличению массы на 16 Да. Кроме того, в первичной структуре аминокислот №№ 5 и 6, содержащих соответственно 6 и 10 остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот, отсутствуют метионин М, гистидин Н и триптофан W, по которым возможно их окисление [17, 21].

Рис. 5.

Масс-спектры МАЛДИ модификаций антибактериальных пептидов Cecropin-D-like peptide (а) и Anionic antimicrobial peptide 2 (б).

Биотрансформация гидразина и его производных, как известно [1, 2], протекает в печени и кишечнике организмов с участием цитохрома Р450 и флавинсодержащих монооксигеназ, что сопровождается образованием диазометана, метильного радикала и ионов метилдиазония, которые могут реагировать с биомолекулами [25]. Вероятно, в результате метаболизма НДМГ в организме гусеницы метилирование пептидов ее гемолимфы протекает по остаткам глутаминовой D и аспарагиновой E кислот, а также по C-концевым аминокислотам. Это предположение связано с первичными структурами пептидов, так как наблюдается зависимость между количеством мест метилирования (D и E) и числом модификаций одного антибактериального пептида (рис. 5).

Окислительная деструкция белковых молекул в результате воздействия НДМГ хорошо известна и качественно наблюдалась в [25] спектрофотометрическими методами. Методом МАЛДИ-МС подтверждено, что воздействие НДМГ и его гидразона приводит к существенному изменению состава гемолимфы GM: появлению большого количества низкомолекулярных пептидов, фрагментов и метилированных модификаций исходно присутствующих антимикробных компонентов. Появляются также новые антибактериальные пептиды, выделение и изучение которых позволит в дальнейшем разработать способы защиты человека от воздействия НДМГ и его токсичных производных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Методами ОФ ВЭЖХ и МАЛДИ-МС охарактеризован пептидный состав гемолимфы личинок гусениц GM после воздействия НДМГ и его гидразона с ацетоном. Обнаружено большое число индуцированных пептидных продуктов массой 1–3 кДа, ранее известных для GM антибактериальных пептидов массой 5–30 кДа, их фрагментов, а также появление новых пептидных компонентов, не представленных в базах данных. Эти пептиды массой 3484, 4897, 4969, 6319, 9169 и 9187 Да проявляют антимикробную активность в отношении грамотрицательной бактерии Е. coli. Качественный состав пептидов гемолимфы после использования НДМГ и его гидразона с ацетоном практически одинаков, их количественный состав зависит от концентрации токсикантов. Предположено, что воздействие НДМГ на антибактериальные пептиды гемолимфы GM сопровождается протеканием не только деструктивных процессов, но и метилированием пептидов продуктами метаболизма НДМГ в организме гусениц по остаткам глутаминовой и аспарагиновой кислот и C-концевым аминокислотам.