Коллоидный журнал, 2022, T. 84, № 6, стр. 740-751

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время наночастицы (НЧ) активно используют в различных областях промышленности в качестве красителей, пищевых и косметических добавок, химических и биологических сенсоров, катализаторов и пр. [1–3]. В биомедицинской области НЧ также находят свое применение в качестве диагностических агентов [4], средств фотодинамической терапии раковых опухолей [5], систем адресной доставки различных лекарственных препаратов [6–8] и др.

НЧ обладают уникальными свойствами, которые существенно зависят от их размера, формы, поверхностного заряда и пр. Известно, что размер частиц влияет на их биосовместимость, биораспределение и способность проникать через клеточные мембраны. Например, в работе [9] авторы обнаружили, что внутрибрюшинное введение малых и крупных золотых НЧ (ЗНЧ) со средним диаметром (D) менее 5 и более 50 нм, соответственно, не оказывает негативного влияния на здоровье лабораторных мышей, тогда как введение ЗНЧ, у которых величина D варьируется от 8 до 37 нм, приводит к гибели большинства животных в течение трех недель. Sahin и др. показали, что при одинаковой весовой концентрации полимерных НЧ на основе статистического сополимера поли(лактида-со-гликолида) (ПЛГА), стабилизированных поли(виниловым) спиртом (ПВС), частицы с величиной гидродинамического диаметра (D_h), равной 160 нм, эффективнее проникают в клетки линии HEK293 по сравнению с более крупными частицами с величиной D_h = 230 нм [10]. Таким образом, аккуратное определение размера НЧ является актуальной задачей с точки зрения их применения в биомедицине и предсказания их воздействия на организм.

В настоящее время наиболее распространенными и относительно простыми методами определения размера НЧ являются просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) и динамическое рассеяние света (ДРС). В методе ПЭМ тонкий слой предварительно высушенного на сетке образца исследуют с помощью пучка электронов высокой энергии (80–300 кэВ), проходящих сквозь образец и взаимодействующих с ним [11]. Контраст на ПЭМ, возникающий из-за поглощения образцом электронов, позволяет получать изображения высокого разрешения, анализ которых дает информацию о форме и размере исследуемых частиц. Для получения достоверных и воспроизводимых результатов методом ПЭМ необходимо надлежащее количество репрезентативных изображений с равномерным распределением частиц. Количество частиц в образце, которое может быть визуализировано методом ПЭМ, так называемый лимит обнаружения, зависит от многих факторов, таких как подготовка пробы, объем образца, а также размер и состав частиц. Так, при одинаковой концентрации серебряных НЧ (СНЧ) (0.01 мас./об. %) в 1 мкм³ образца, который содержит СНЧ с D = 10 нм, может быть визуализировано 18 частиц, тогда как в 55 мкм³ образца, содержащего СНЧ с D = 100 нм, – всего одна [11]. К недостаткам метода относится необходимость удаления растворителя на этапе подготовки пробы, что может приводить к нежелательной агрегации частиц. Кроме того, анализ изображений, осуществляемый вручную или в автоматическом режиме (попиксельно) с помощью специального программного обеспечения, может приводить к неточностям и ошибкам определения размера частиц. Это связано с характерным для ПЭМ изображений шумом, который затрудняет четкое установление границ частицы.

В большей степени предварительная сушка образца затрудняет исследование методом ПЭМ биологических объектов, так как удаление растворителя может приводить к существенному изменению их структуры. Предотвратить нежелательные структурные изменения и/или агрегацию частиц позволяет использование крио просвечивающей электронной микроскопии (крио-ПЭМ), в рамках которой образцы предварительно замораживают, а не высушивают. Крио-ПЭМ успешно применяют для исследования не только биологических объектов, но и металлических НЧ [12, 13], детонационных наноалмазов [14] и пр. Однако лимит обнаружения, сложность подбора режима замораживания и постобработки изображений, а также высокая стоимость оборудования ограничивает повсеместное использование крио-ПЭМ.

Отметим, что исследование методом ПЭМ полимерных НЧ имеет ряд дополнительных сложностей. Во-первых, сверхглубокий вакуум и высокоинтенсивное ионизирующее излучение в камере электронного микроскопа может приводить к нагреву, загрязнению углеводородами и радиолизу полимеров [15]. Во-вторых, полимерные НЧ типа “ядро−корона” и “Янус” возможно исследовать методом ПЭМ лишь с помощью процедуры селективного контрастирования [15]. Так, для изучения методом ПЭМ полимерных НЧ со строением “ядро−корона”, формируемых амфифильными блок-сополимерами поли(лактид)-б-поли(этиленоксид) (ПЛА-б-ПЭО) [16, 17], а также гидрофобными сополимерами ПЛГА в присутствии гидрофильного стабилизатора ПВС [18, 19], как правило, применяют токсичный негативный контрастирующий агент ацетат уранила. Кроме того, при сушке образцов на этапе пробоподготовки происходит коллапс стабилизирующей короны частиц, и величина D НЧ, определенная методом ПЭМ, оказывается существенно ниже величины их D_h. Например, в работе [19] значение D_h частиц на основе ПЛГА (соотношение лактидных и гликолидных звеньев – 75 : 25 мол. %, средневесовая молекулярная масса – 19 кДа, индекс полидисперсности – 2.2), стабилизированных ПВС, превышало величину D на ~ 50 нм. Таким образом, для определения размера как металлических, так и полимерных НЧ и, соответственно, предсказания их поведения в организме человека необходимо привлекать дополнительные методы исследования.

В отличие от ПЭМ метод ДРС позволяет исследовать коллоидные растворы НЧ in situ. Кроме того, в методе ДРС усреднение полученных экспериментальных данных производится по существенно большему числу частиц, чем в исследовании ПЭМ. В ДРС измеряется зависимость флуктуации интенсивности рассеяния света, возникающей в результате броуновского движения частиц в растворе, от времени [20, 21]. Получаемые экспериментальные данные представляют собой автокорреляционную функцию фототока (g₂(τ)), для которой рассчитывают распределения по размерам исследуемых частиц с помощью, как правило, специального программного обеспечения, например, “Zetasizer software” [22]. Широко используемый для определения размера коллоидных НЧ метод ДРС имеет ряд ограничений и недостатков. Так, при исследовании ДРС полидисперсных образцов присутствие крупных частиц может затруднять детектирование частиц малых размеров [16, 23, 24], так как известно, что интенсивность рассеяния света (I) находится в степенной зависимости от диаметра частицы (I ~ D⁶ для частиц с D < 100 нм, I ~ D² для частиц с D > 200 нм) [25]. В работе [23] авторы установили, что при наличии в растворе всего 5 мас. % крупных СНЧ с величиной D_h, равной 55 или 80 нм, сигнал от основной фракции СНЧ малого размера (D_h = 10 нм) на распределении интенсивности рассеяния света по D_h частиц отсутствует. Кроме того, ДРС чаще используют для характеризации сферических частиц. Исследование же объектов несферической формы (эллипсоидальных частиц, стержней, дисков, ламелей и пр.) затруднено, так как классический метод ДРС не учитывает вклад вращательного движения частицы, и может приводить к артефактам, например, появлению ложного пика на распределении интенсивности рассеяния света по D_h частиц [26].

Помимо ПЭМ и ДРС для определения размера коллоидных НЧ и оценки полидисперсности по размерам применяют также атомно-силовую микроскопию, анализ траекторий частиц, рентгеновское рассеяние, аналитическое ультрацентрифугирование (АУЦ), флуоресцентную корреляционную спектроскопию и пр. [27]. Методом АУЦ исследуют седиментацию НЧ под воздействием центробежной силы, а возникающие при этом в образце градиенты концентрации детектируют в реальном времени с помощью оптической системы. Экспериментальные данные записываются в виде профилей концентрации c(r, t) в зависимости от радиального расстояния от ротора (r) и времени (t), которые можно преобразовать в распределения коэффициентов седиментации c(s) и коэффициентов диффузии c(D_f) с помощью программного обеспечения “Sedfit” [28]. В отличие от метода ДРС АУЦ подходит для исследования полидисперсных систем [29]. Кроме того, метод позволяет исследовать поверхность частиц [30], взаимодействия металлических частиц с белками [31] и пр. К недостаткам метода относятся сложность интерпретации данных, высокая стоимость оборудования и длительное время анализа.

В данной работе в качестве объектов исследования были выбраны два типа НЧ: металлические частицы (ЗНЧ и СНЧ), стабилизированные цитратом натрия, и полимерные (ПЛГА) частицы, стабилизированные ПВС. С использованием взаимодополняющих экспериментальных методов, а именно ПЭМ, ДРС и АУЦ, был определен средний размер коллоидных НЧ, а также проведена оценка полидисперсности по размерам. Показано, что величина D как металлических, так и полимерных частиц возрастает в ряду D_ПЭМ < D_АУЦ < D_ДРС, что связано с особенностями методов исследования, обсуждению которых посвящена данная статья.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для безопасного и эффективного применения как металлических, так и полимерных НЧ в биомедицине требуется аккуратное определение их размера, а также оценка полидисперсности по размерам, поскольку известно, что размер НЧ существенно влияет на их биосовместимость, биораспределение, эффективность проникновения в клетки и пр.

Для характеризации металлических и полимерных частиц в работе использовали ПЭМ, ДРС и АУЦ. Репрезентативные ПЭМ изображения ЗНЧ и СНЧ, стабилизированных цитратом натрия, и ПЛГА частиц, стабилизированных ПВС, приведены на рис. 1а, 1г и 1ж соответственно.

Рис. 1.

Репрезентативные ПЭМ изображения ЗНЧ (а), СНЧ (г) и ПЛГА НЧ (ж). Распределения ЗНЧ (б), СНЧ (д) и ПЛГА НЧ (з) по диаметрам (D, нм), полученные при анализе ПЭМ изображений. Распределения ЗНЧ (в) и СНЧ (е) по характеристическим отношениям (D_max/D_min), полученные при анализе ПЭМ изображений. Стрелками на рис. 1а и 1г обозначены металлические НЧ несферической формы. Стрелками на рис. 1ж обозначены ПЛГА ядра, окруженные слоем ПВС.

Металлические частицы обладают преимущественно сферической морфологией, однако на полученных снимках также присутствуют ЗНЧ и СНЧ несферической формы (обозначены стрелками на рис. 1а и 1г). Как видно из рис. 1б и 1д, ПЭМ распределения частиц мономодальные с хорошо выраженным максимумом, положение которого соответствует наиболее вероятному диаметру (D) ЗНЧ и СНЧ, равному 14 и 13 нм соответственно. Средняя относительная полуширина ПЭМ распределения ${{\sigma }_{{{\text{ПЭМ}}}}} = \left( {\frac{{{{\sigma }_{D}}}}{D}} \right)\,\, \times \,\,100\% ~$, где ${{\sigma }_{D}}$ – полуширина распределения на полувысоте максимума, для ЗНЧ составила 14%, тогда как для СНЧ – 29%. Из анализа ПЭМ изображений получили также распределения характеристического отношения (D_max/D_min) металлических частиц, то есть отношения максимального диаметра частицы (D_max) к минимальному (D_min) (рис. 1в, 1е). Величина D_max/D_min для ЗНЧ и СНЧ варьируется в диапазоне от 1.0 до 1.8 и от 1.0 до 1.4, тогда как наиболее вероятное значение D_max/D_min составляет 1.1 ± 0.1 и 1.2 ± 0.1 соответственно.

Как видно из рис. 1ж, полимерные частицы на основе ПЛГА также обладают сферической морфологией. Отметим, что в водной дисперсии исследуемые полимерные НЧ представляют собой гидрофобное ПЛГА ядро, покрытое стабилизирующей ПВС короной, которая препятствует агрегации частиц и выделению их в отдельную фазу (осадок) [18, 19]. При осаждении на подложку и последующей сушке образца происходит коллапс стабилизирующего ПВС слоя [18, 19]. Таким образом, метод ПЭМ позволяет оценить лишь диаметр ПЛГА ядер (обозначены стрелкой на рис. 1ж), величина которого существенно ниже значения среднего диаметра частиц в сольватированном состоянии. Полученное ПЭМ распределение мономодальное с хорошо выраженным максимумом (рис. 1з), положение которого соответствует величине D, равной 52 нм (${{\sigma }_{{{\text{ПЭМ}}}}}$ = 30%).

Водные дисперсии металлических и полимерных НЧ исследовали методом ДРС. В случае ЗНЧ обнаружили бимодальное распределение интенсивности рассеяния света по гидродинамическим диаметрам (D_h) частиц (рис. 2а). Положение максимума основного и минорного пика на распределении соответствует величине D_h, равной 35 и 2 нм соответственно. При этом автоматический пересчет в программном обеспечении “Zetasizer software” распределения интенсивности рассеяния в распределения объема и числа частиц приводит к мономодальным распределениям с максимумом ~ 2 нм (рис. 2б). Отметим, что при анализе ПЭМ изображений ЗНЧ с D менее 5 нм обнаружены не были (рис. 1б).

Рис. 2.

Распределения интенсивности рассеяния света по гидродинамическим диаметрам (D_h, нм) для ЗНЧ (а), СНЧ (в) и ПЛГА НЧ (д); распределения объема и числа частиц по D_h для ЗНЧ (б), СНЧ (г) и ПЛГА НЧ (е).

Ранее Хлебцов и др. при исследовании методом ДРС водной дисперсии ЗНЧ со средним диаметром 60 нм также обнаружили бимодальное распределение интенсивности рассеяния света по D_h частиц с основным (~59 нм) и минорным (~5–6 нм) максимумами [37]. Авторы установили, что появление ложного минорного пика малых размеров на распределении ДРС связано с вкладом вращательной диффузии в измеряемую корреляционную функцию вследствие анизотропии исследуемых ЗНЧ (по данным ПЭМ характеристическое отношение частиц составляло 1.33 ± 0.22). Вероятно, бимодальное распределение интенсивности рассеяния света, наблюдаемое для исследуемых в данной работе ЗНЧ (рис. 2а), может быть связано с присутствием в дисперсии некоторого количества анизотропных ЗНЧ с D_max/D_min > 1.1 (рис. 1в).

Отметим, что значение D_h ЗНЧ, соответствующее положению основного максимума на распределении ДРС интенсивности рассеяния (рис. 2а), в 2.5 раза превышает величину D, полученную из анализа ПЭМ изображений (табл. 1). В свою очередь величина ${{\sigma }_{{{\text{ДРС}}}}}$ основного пика ДРС распределения в ~5 раз выше относительной ширины ПЭМ гистограммы (табл. 1).

Для водной дисперсии СНЧ наблюдали мономодальное распределение интенсивности рассеяния света по D_h частиц (рис. 2в). Величина D_h, соответствующая максимуму на полученном распределении, составила 21 нм. Пересчет распределения интенсивности рассеяния в распределения объема и числа частиц приводит к мономодальным распределениям с максимумом 16 и 13 нм соответственно (рис. 2г). Мономодальность распределения, по-видимому, обусловлена более узким распределением характеристических отношений СНЧ по сравнению с ЗНЧ (рис. 1в, 1е). Относительная ширина ДРС распределения интенсивности рассеяния оказалась в ~ 1.4 раза выше относительной ширины ПЭМ распределения (табл. 1).

Для водной дисперсии ПЛГА частиц, стабилизированных ПВС, также обнаружили мономодальное распределение интенсивности рассеяния света по D_h частиц (рис. 2д). Величина D_h, соответствующая максимуму на полученном распределении, составила 141 нм. Автоматический пересчет распределения интенсивности рассеяния в распределения объема и числа частиц приводит к мономодальным распределениям с максимумом 132 и 108 нм соответственно (рис. 2е). Величина D_h ПЛГА НЧ значительно превышает (в ~2.7 раза) значение D частиц. Это может быть связано с тем, что при исследовании ПЛГА частиц методом ДРС стабилизирующая гидрофильная ПВС корона находится в набухшем состоянии из-за сольватации молекул растворителя, тогда как при изучении частиц методом ПЭМ ПВС корона, напротив, находится в сколлапсированном состоянии [18, 19]. В свою очередь, относительная ширина ДРС распределения интенсивности рассеяния в ~1.3 раза превышает относительную ширину ПЭМ гистограммы (табл. 1).

Как видно из табл. 1, величины D металлических и полимерных НЧ оказались ниже соответствующих величин D_h в 1.75–2.7 раза, причем наиболее существенная разница наблюдается для ПЛГА частиц. Таким образом, метод ПЭМ в отличие от ДРС не позволяет определить средний размер исследуемых частиц в сольватированном состоянии. Также отметим, что из-за высокой чувствительности ДРС к полидисперсности и присутствию крупных частиц в образце экспериментально определенные величины D_h НЧ могут быть завышены [38, 39]. Поэтому в данной работе в качестве дополнительного метода определения среднего размера НЧ в сольватированном состоянии, а также оценки ширины распределения по размерам был выбран метод АУЦ.

Репрезентативные экспериментальные седиментационные профили, то есть профили концентрации c(r, t) в зависимости от радиального расстояния от ротора (r) и времени (t), для водной дисперсии ЗНЧ и ПЛГА частиц, полученные в режиме поглощения и интерференции, приведены на рис. 3а и 3б соответственно.

Рис. 3.

Экспериментальные седиментационные профили ЗНЧ (а) и ПЛГА НЧ (б) в водной дисперсии, полученные в режиме поглощения и интерференции соответственно.

Рассчитанное в программе “Sedfit” распределение коэффициентов седиментации c(s) ЗНЧ, где s есть отношение скорости осаждения частиц в растворителе к приложенному ускорению, имеет хорошо выраженный максимум, положение которого соответствует величине s_max ~ 3600 Св (рис. 4а). Помимо основной фракции ЗНЧ с s_max ~ 3600 Св в дисперсии также присутствуют частицы, для которых величина s варьируется в достаточно широком диапазоне от 5000 до 13 000 Св. Распределение с(D_h), полученное автоматическим пересчетом распределения c(s) в “Sedfit”, приведено на рис. 4б. Величина D_h, соответствующая положению максимума на c(D_h), составляет 22 нм, средняя относительная полуширина распределения ${{\sigma }_{{{\text{АУЦ}}}}}$ – 14%. Сравнение ПЭМ гистограммы (рис. 1б), распределения частиц по размерам от интенсивности рассеяния света, полученного методом ДРС (рис. 2а), и распределения с(D_h) (рис. 4б) для ЗНЧ указывает на то, что минорный пик на распределении ДРС в области размеров ~2–5 нм является ложным, так как методами ПЭМ и АУЦ частиц столь малого размера обнаружено не было. Кроме того, при центрифугировании дисперсии ЗНЧ на более высоких скоростях (10 000 об./мин) седиментации частиц малого размера (D_h < 10 нм) также не наблюдали.

Рис. 4.

Рассчитанные распределения коэффициентов седиментации (s, Св) ЗНЧ (а), СНЧ (в) и ПЛГА НЧ (д) и гидродинамических диаметров (D_h, нм) ЗНЧ (б), СНЧ (г) и ПЛГА НЧ (е) в водной дисперсии.

Водную дисперсию СНЧ также исследовали методом АУЦ, рассчитанные для частиц распределения с(s) и c(D_h) приведены на рис. 4в и 4г соответственно. Согласно рассчитанному распределению с(s) основной фракцией в дисперсии являются СНЧ с величиной s_max ~ 800 Св, однако также присутствует малая доля частиц с s ~ 290 Св и частиц, для которых s варьируется в диапазоне от 1200 до 4000 Св (рис. 4в). Распределение с(D_h) частиц серебра имеет хорошо выраженный максимум, величина D_h, соответствующая его положению, составляет 16 нм. Отметим, что по сравнению с ЗНЧ (рис. 4б) доля крупных СНЧ, для которых s > s_max, оказалась ниже (рис. 4г).

Рассчитанные распределения с(s) и c(D_h) для ПЛГА частиц, стабилизированных ПВС, приведены на рис. 4д и 4е соответственно. Согласно полученному распределению с(s) основной фракцией в дисперсии являются частицы с величиной s_max ~ 430 Св, однако также присутствуют частицы, для которых s варьируется в диапазоне от 1000 до 5000 Св (рис. 4д). Распределение с(D_h) частиц характеризуется хорошо выраженным максимумом, величина D_h, соответствующая его положению, составляет 111 нм. Отметим, что ранее в работе [19] водную дисперсию стабилизированных ПВС частиц на основе ПЛГА с близким молекулярным составом (75 : 25 мол. %) исследовали методом малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР). По данным МУРР размер рассеивающего объекта (D_max), учитывающий вклад ПЛГА ядра и ПВС короны, составляет 100 нм. Таким образом, величина D_h, полученная при исследовании ДРС, оказалась завышена по сравнению с размерами ПЛГА частиц, определенными методами АУЦ и МУРР.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Водные дисперсии металлических и полимерных НЧ исследовали методами ПЭМ, ДРС и АУЦ. Показано, что диаметр (D) частиц в зависимости от метода определения возрастает в ряду D_ПЭМ < D_АУЦ < D_ДРС. Меньшие значения D_ПЭМ по сравнению с величинами D_АУЦ и D_ДРС частиц связаны с особенностью подготовки пробы, а именно с осаждением дисперсии на подложку и ее последующей сушкой, в результате чего происходит десольватация молекул гидрофильного стабилизатора, адсорбированных на поверхности частиц, и их коллапс. Таким образом, метод ПЭМ позволяет визуализировать форму ядер металлических и полимерных НЧ, а также оценить их размер и полидисперсность по размерам, однако не дает информации о размере частицы в сольватированном состоянии, необходимой для их безопасного и эффективного использования в биомедицине. Метод ДРС, напротив, подходит для определения размера НЧ непосредственно в растворе, однако величины D_ДРС частиц оказались завышены по сравнению с D_АУЦ, поскольку в случае ДРС полидисперсность по размерам НЧ, а также наличие небольшого количества крупных частиц в большей степени влияет на точность определения размера.

Таким образом, для характеризации НЧ различной природы (определения их размерoв и формы) следует использовать несколько взаимодополняющих экспериментальных методов. Применение ПЭМ в качестве базового метода не позволяет получить полное представление о размере частиц в дисперсии в виду своей локальности и невозможности учета вклада сольватной оболочки в размер частицы. Поэтому всегда следует проводить дополнительные исследования как минимум одним интегральным методом.