Кристаллография, 2019, T. 64, № 6, стр. 906-911

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что индекс кристалличности целлюлозы и соотношение кристаллических фаз Іα и Іβ в природной целлюлозе зависят от ее происхождения, видов последующей обработки, степени полимеризации, а также от молекулярных водородных связей внутри и между цепями биополимера [1–3]. Бактериальная наноцеллюлоза (БНЦ), секретируемая различными бактериями родов Acetobacter, Acanthamoeba и Achromobacter spp., отличается от растительной целлюлозы высокой степенью чистоты, ультратонкой структурой микрофибрилл с высокой степенью кристалличности и в то же время содержит в своей структуре равномерно распределенную воду, образуя устойчивый гидрогель в процессе биосинтеза. Как и растительная целлюлоза, БНЦ относится к целлюлозе І, в которой два целлобиозных фрагмента расположены параллельно (или антипараллельно) в элементарной ячейке, но в отличие от растительной она преимущественно содержит алломорф Іα [1, 4].

В связи с повышением спроса на БНЦ в различных отраслях промышленности [5] исследователи в мировых научных центрах ищут подходы к удешевлению стоимости питательной среды за счет замены синтетической среды для биосинтеза БНЦ гидролизатами дешевого целлюлозосодержащего сырья [6, 7]. Результаты исследования методом рентгеноструктурного анализа показывают, что замена среды для биосинтеза приводит к изменению структурных характеристик БНЦ [8–12], так что в каждом конкретном случае необходим контроль структурного состояния получаемого объекта. Целью настоящей работы было определение структурных характеристик БНЦ, синтезированной продуцентом Мedusomyces gisevii Sa-12 на ферментативных гидролизатах энергетического растения – мискантуса.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Мискантус сорта Сорановский, выращенный на экспериментальной плантации ИПХЭТ СО РАН (Бийск), подвергался химической обработке в стандартном емкостном оборудовании объемом 250 л при атмосферном давлении в опытном производстве ИПХЭТ СО РАН по авторским методикам [13–17]. В качестве химических реактивов использовали разбавленные 4%-ные растворы азотной кислоты и гидроксида натрия. Химическую обработку осуществляли четырьмя способами. Применяли: одностадийную обработку азотной кислотой с получением продукта азотнокислой обработки (ПАО) [13, 14]; дальнейшую обработку ПАО гидроксидом натрия с получением технической целлюлозы азотнокислым способом (ТЦ АС) [15]; одностадийную обработку гидроксидом натрия с получением продукта щелочной делигнификации (ПЩД) [16, 17]; дальнейшую обработку ПЩД азотной кислотой с получением технической целлюлозы комбинированным способом (ТЦ КС) [17].

Продукты, полученные после химической обработки мискантуса, подвергались ферментативному гидролизу, условия которого были одинаковы для четырех видов субстратов и подробно описаны в [18]. Полученные ферментативные гидролизаты стандартизировали по глюкозе путем разбавления их водой до содержания глюкозы 20–25 г/л, обеспечивающей наибольший выход БНЦ. Гидролизаты, отфильтрованные от остатков субстратов, были использованы в качестве экстрагентов черного байхового чая. Черный байховый чай вносили при 100°С в количестве 10 г/л для получения готовых питательных сред с концентрацией экстрактивных веществ чая 3.2 г/л [19]. Готовые питательные среды отфильтровывали от остатков чая и использовали для биосинтеза БНЦ.

Биосинтез БНЦ на полученных питательных средах проводился в оптимальных условиях, установленных в [19]: температура 27°С, продолжительность 7 сут, стационарные условия. В качестве продуцента использовали симбиотическую культуру Мedusomyces gisevii Sa-12, доза инокулята составила 10%.

Промывку образцов БНЦ от компонентов питательной среды и клеток осуществляли поэтапно, обрабатывая раствором 2%-ного гидроксида натрия и 0.1%-ным раствором разбавленной соляной кислоты с последующей промывкой дистиллированной водой. Гель-пленки БНЦ высушивали в развернутом состоянии при комнатной температуре.

Таким образом, были синтезированы образцы БНЦ четырех типов: ферментативный гидролизат ПАО мискантуса (образец 1), ферментативный гидролизат ТЦ АС мискантуса (образец 2), ферментативный гидролизат ПЩД мискантуса (образец 3), ферментативный гидролизат ТЦ КС мискантуса (образец 4).

Дифрактограммы образцов БНЦ получены в геометрии на отражение и прохождение (просвет) на дифрактометре ДРОН-6 в интервале углов рассеяния 3°–145° (монохроматическое FeK_α-излучение, монохроматор – кристалл пиролитического графита, установленный на пути первичного пучка).

Подробно методика расчета размеров областей кристалличности (блоков мозаики, областей когерентного рассеяния (ОКР)), индекса кристалличности и методика полнопрофильного анализа описаны в [3, 20].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На рис. 1 представлены дифрактограммы образцов БНЦ, синтезированных на средах ферментативных гидролизатов мискантуса, полученные в геометрии на отражение и просвет. Зарегистрированные в геометрии на отражение дифрактограммы характерны для БНЦ [21, 22]. В геометрии на просвет наиболее типичными являются дифрактограммы образцов 1 и 4 (рис. 1д, 1з) [23].

Рис. 1.

Дифрактограммы образцов БНЦ 1 (а, д), 2 (б, е), 3 (в, ж), 4 (г, з), снятые в геометрии на отражение (а–г) и просвет (д–з).

Различие дифрактограмм, полученных в геометрии на отражение и просвет, объясняется анизотропией структуры БНЦ. Анизотропия структуры характерна для пленочных объектов и наблюдалась ранее для образцов, полученных на средах ферментативных гидролизатов плодовых оболочек овса [3].

На рис. 2 сравниваются дифрактограммы образца 1, снятые в геометрии на отражение и на просвет, с дифрактограммами, рассчитанными по данным для двух моделей – целлюлозы Iα [24–26] и Iβ [24, 25, 27] с параллельным расположением целлобиозных остатков в элементарной ячейке. Как следует из рис. 2, расстояния между тремя основными отражениями на дифрактограмме образца БНЦ ближе к данным, рассчитанным по характеристикам целлюлозы Iα: a = 6.74, b = 5.93, c = 10.36 Å, α = 117.0°, β = 113.0°, γ = 81.0° [24]. Результаты расчета полученных в геометрии на отражение дифрактограмм методом полнопрофильного анализа показали, что структура всех исследованных образцов соответствует алломорфу Iα.

Рис. 2.

Дифрактограмма образца 1 (1), снятая в геометрии на отражение (а, б) и на просвет (в, г) в сравнении с рентгенограммами, рассчитанными для моделей целлюлозы Iα (2) и целлюлозы Iβ (3).

В табл. 1 представлены уточненные значения периодов (a, b, c) и объема (V) элементарной ячейки, значения весового профильного (R_wp) и профильного (R_p) факторов недостоверности, фактора надежности (Goff), а также параметр текстуры T и индексы оси текстуры (преимущественной ориентации кристаллитов) 〈uvw〉.

Рассчитанные для образцов БНЦ, синтезированных на средах ферментативных гидролизатов мискантуса, размеры элементарных ячеек соответствуют ранее опубликованным результатам для образцов БНЦ, синтезированных на синтетической питательной среде и на средах ферментативных гидролизатов плодовых оболочек овса [3], а также данным, приведенным в [24, 25, 28, 29] для целлюлозы Iα. Отметим, что в образце 1 текстура отсутствует, а для всех остальных образцов ось текстуры одна и та же: 〈100〉.

Преобладание в образцах БНЦ триклинной модификации целлюлозы Iα хорошо согласуется с литературными данными, свидетельствующими о том, что в отличие от растительной целлюлоза примитивных организмов характеризуется высоким содержанием триклинной модификации [1, 30].

Результаты расчета размеров областей и индексов кристалличности по дифрактограммам, снятым на отражение и просвет, приведены в табл. 2. Индексы hkl указаны для целлюлозы Iα.

На рис. 3а показана связь между моноклинной и триклинной элементарными ячейками целлюлозы Iβ и Iα соответственно [22, 31], а на рис. 3б – расположение цепочек целлюлозы I в плоскости, перпендикулярной оси с, т.е. оси фибриллы. С направлением оси фибриллы совпадают направления [$11\bar {4}$] в триклинной и [001] в моноклинной решетках целлюлозы I. Из рис. 3 следует, что линейные размеры и форма поперечного сечения элементарных фибрилл определяются по размерам кристаллитов в направлениях [100], [010] и [110] кристаллической решетки целлюлозы Iα, размер ОКР вдоль элементарной фибриллы – по размеру кристаллитов в направлении [$11\bar {4}$]. В решетке целлюлозы Iβ этим направлениям, как указано на рис. 3 и в [31], соответствуют оси [$11\bar {0}$], [110], [100] и [001].

Рис. 3.

Взаимная ориентация в решетке целлюлозы I: а – моноклинной (m) и триклинной (t) элементарных ячеек; б – цепочек, перпендикулярных плоскости рисунка. Указаны межплоскостные расстояния и плоскости.

На рис. 4 схематически изображены формы поперечного сечения элементарных фибрилл, построенные на основе данных табл. 2 с учетом размеров и проекции элементарной ячейки целлюлозы Iα на плоскость ab. Использована программа Mercury. Поперечное сечение элементарных фибрилл БНЦ из мискантуса – искаженный шестиугольник. Все фибриллы имеют разную форму и размеры. Предположительно, это связано с разным составом питательных сред, используемых для биосинтеза БНЦ.

Рис. 4.

Схемы поперечного сечения элементарных фибрилл образцов: 1 (а, д), 2 (б, е), 3 (в), 4 (г, ж), исследованных в геометрии на отражение (а–г) и просвет (д–е). Масштаб в ангстремах соответствует данным табл. 2. На схеме поперечного сечения образца 1 показана базисная плоскость элементарной ячейки целлюлозы Iα.

Сравнение полученных и литературных данных показало, что поперечные размеры элементарных фибрилл, определенные в настоящей работе, согласуются с моделями, предложенными в [32] на основе рентгеновского и нейтронографического экспериментов, и данными атомно-силовой спектроскопии для целлюлозы Валония со структурой Iα [33] и для волокон кукурузы [34]. Отметим, что поперечные размеры элементарных фибрилл исследованной БНЦ, лежащих в плоскости пленки, заметно больше, чем фибрилл, перпендикулярных поверхности (рис. 4).

Из дифрактограмм, зарегистрированных в геометрии на отражение, нельзя сделать выводы о длине ОКР вдоль оси фибриллы, так как отражение $11\bar {4}$ лучше выявляется на дифрактограммах, полученных на просвет. То есть самые длинные фибриллы располагаются параллельно поверхности образца. Это явление характерно не только для БНЦ [20, 29]. Поэтому в табл. 1 расчеты длины области кристалличности выполнены по дифрактограммам, снятым в геометрии на просвет. Полученные результаты свидетельствуют о высоких индексах кристалличности: от 86 до 94%. Индекс кристалличности образцов БНЦ, синтезированных продуцентом Мedusomyces gisevii Sa-12 на синтетической питательной среде и на средах ферментативных гидролизатов плодовых оболочек овса, находится в том же диапазоне и составляет от 86 до 93% [3].

Основываясь на полученных данных для образцов БНЦ, синтезированных на синтетической питательной среде и на ферментативных гидролизатах плодовых оболочек овса и мискантуса, можно утверждать, что при использовании продуцента Мedusomyces gisevii Sa-12 состав питательной не оказывает влияния на индекс кристалличности и содержание алломорфа Іα. Синтезированные образцы БНЦ являются высококристалличными и преимущественно состоят из целлюлозы триклинной фазы Іα.

Настоящие исследования важны для определения области применения БНЦ. Например, изучение гемостатической активности БНЦ, синтезированной Мedusomyces gisevii Sa-12, показало, что время остановки кровотечения и масса кровопотери при использовании БНЦ в 7 раз меньше, чем в случае марлевого тампона [35]. Таким образом, установлена самостоятельная гемостатическая активность БНЦ. Полученные результаты можно объяснить уникальной структурой образцов БНЦ, что, в свою очередь, связано с преобладанием триклинной модификации Іα и расположением наиболее крупных элементарных фибрилл и элементарных фибрилл с наиболее длинными ОКР вдоль оси фибриллы параллельно поверхности пленки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Установлено, что состав питательных сред ферментативных гидролизатов мискантуса оказывает влияние на форму и размер элементарных фибрилл и не оказывает влияния на степень кристалличности и содержание алломорфа Іα. Показано, что использование продуцента Мedusomyces gisevii Sa-12 позволяет получить БНЦ с высокой степенью кристалличности в диапазоне 86–93% и с преимущественным содержанием алломорфа Іα вне зависимости от используемой питательной среды.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 17-19-01054).