1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Кристаллография
  4. T. 64, № 6, 2019

Кристаллография, 2019, T. 64, № 6, стр. 902-905

Кристаллизация и предварительное рентгеновское исследование мутантной формы L-аспарагиназы Wolinella succinogenes

В. И. Тимофеев 1, 2, Н. В. Булушова 3, Н. Е. Жухлистова 1, И. П. Куранова 1, 2, *

1 Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова ФНИЦ “Кристаллография и фотоника” РАН
Москва, Россия

2 Национальный исследовательский центр “Курчатовский институт”
Москва, Россия

3 Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, НИЦ “Курчатовский институт”
Москва, Россия

* E-mail: inna@crys.ras.ru

Поступила в редакцию 04.03.2019
После доработки 04.03.2019
Принята к публикации 19.03.2019

Полный текст (PDF)

Аннотация

Мутантная форма L-аспарагиназы Wolinella succinogenes (Was72), содержащая две замены V23Q и K24T в С-концевом участке N-концевой петли, ограничивающей активный центр и имеющая глутаминазную активность, в 8 раз меньшую по сравнению с исходной формой, закристаллизована в апо-форме и в комплексах с L-аспарагиновой и L-глутаминовой кислотами. Кристаллы апо-формы фермента получены в двух модификациях (пр. гр. P21 и P22121). Кристаллы, выращенные в присутствии аспарагиновой или глутаминовой кислоты, имеют одну и ту же пр. гр. Р21, но разные параметры элементарной ячейки. Для всех типов кристаллов собраны дифракционные наборы при разрешении 1.65–2.00 Å. Все наборы пригодны для решения пространственной структуры фермента.

ВВЕДЕНИЕ

Ферменты семейства аспарагиназ, широко распространенные среди микроорганизмов, относятся к треонинамидогидролазам (EC 3.5.1.1) и катализируют гидролиз аспарагина до аспарагиновой кислоты и аммиака. Замечательной особенностью L-аспарагиназ является их ярко выраженная противоопухолевая активность, благодаря которой они находят применение в медицине как эффективные антиопухолевые агенты при лечении острых лимфобластных лейкозов, лимфо- и ретикулосарком [1–3]. Антиопухолевую активность L-аспарагиназ связывают с их способностью подавлять метаболизм аспарагина, необходимого для роста раковых клеток [2]. Однако антиопухолевая активность аспарагиназ сопровождается рядом побочных эффектов из-за токсичности, которая частично ассоциируется с глутаминазной активностью ферментов. Поскольку L-глутамин важен для транспорта азота в крови, то длительное уменьшение его концентрации, возникающее при терапии аспарагиназами, вызывает серьезные расстройства в организме. В результате только некоторые аспарагиназы, например из Erwinia chrysanthemi, Wolinella succinogenes [4–6], имеющие наиболее низкую глутаминазную активность, можно использовать в качестве лекарств. Поиск и инженерия новых аспарагиназ, эффективных в качестве терапевтических агентов, остаются актуальными, и различные представители этого класса ферментов интенсивно изучаются [4–10]. Особый интерес представляет изучение факторов, влияющих на изменение соотношения аспарагиназной и глутаминазной активности аспарагиназ. Низкая глутаминазная активность благоприятствует применению аспарагиназ в медицине, а выяснение причин, обусловливающих избирательность ферментов по отношению к субстратам (аспарагину и глутамину), представляет значительный теоретический интерес.

Пространственные структуры ряда аспарагиназ установлены не только для свободных ферментов, но и для комплексов с продуктами реакции – аспарагиновой и глутаминовой аминокислотами, а также с аналогами переходного состояния реакции [5, 9, 10]. Пространственная структура свободной аспарагиназы Wolinella succinogenes (Was) была установлена одной из первых среди белков этого семейства [5]. В [11] при более высоком разрешении исследованы две формы этого фермента, одна из которых идентична изученной ранее, а другая отличалась от нее заменой остатка пролина в положении 121 на серин (WasP121 и WasS121 соответственно). Отметим, что обе формы существенно отличались глутаминазной активностью. При практически одинаковой аспарагиназной активности глутаминазная активность WasP121 оказалась почти на порядок выше, чем у WasS121. Комплексы этого фермента с аспартатом и глутаматом были также исследованы. Проанализировав пространственные структуры свободных ферментов и комплексов обоих ферментов с аспартатом и глутаматом, авторы пришли к выводу, что повышение глутаминазной активности связано с тем, что закрытая конформация, образование которой необходимо для протекания реакции, более стабильна в WasP121 из-за взаимодействия между СНδ-атомом пролина и ароматическим циклом тирозина активного центра. Вследствие этого фермент-субстратный комплекс образуется не только с аспарагином, но и с большим по объему глутамином. В [12] была получена мутантная форма L-аспарагиназы Wolinella succinogenes (Was72), которая в положении 121 содержит пролин, но имеет две замены V23Q, K24T в С-концевом участке N-концевой подвижной петли, ограничивающей активный центр. Эта мутантная форма не только обладает повышенной устойчивостью к действию трипсина, но и при сохранении аспарагиназной активности в присутствии пролина в положении 121 характеризуется на порядок меньшей глутаминазной активностью.

В настоящей работе с целью исследования структурных основ, приводящих к изменению соотношения аспарагиназной и глутаминазной активности L-аспарагиназы Was72, выращены кристаллы свободной формы Was72 и ее комплексов с аспарагиновой и глутаминовой кислотами, которые использованы для рентгеноструктурного исследования. Для полученных кристаллов собраны дифракционные наборы, пригодные для установления пространственной структуры фермента.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение и очистка L-аспарагиназы Was72. Клетки E. coli штамма BL21(DE3) (Novagen), несущего плазмиду pET28-Was72, кодирующую аспарагиназу, выращены на жидкой среде TRB (дрожжевой экстракт 2.4%, триптон 1.2%, буфер KH2PO4–K2HPO489 мМ, MgSO4 3 мM, лактоза 0.5%, глицерин 0.5%, канамицин 90 мг/л) в условиях лактозной аутоиндукции при 37°C. Клетки собраны путем центрифугирования (9000 г) в течение 10 мин при 4°C и промыты в фосфатносолевом буфере (рН 7.4) (PBS). Отмытые клетки были суспендированы в натрий-калий-фосфатном буфере концентрацией 5 мM (pH 7.3), содержащем 0.5 М NaCl и 5 мM EDTA, и разрушены на льду с помощью French Press Cell Disruptor (Thermo Electron Corp., Model FA-078A-E240). Фенилметилсульфонилфторид был прибавлен к клеточному лизату до концентрации 1 мМ. Модифицированная L-аспарагиназа Was72 выделена из клеточного лизата по следующей методике. Лизат, полученный при разрушении клеток продуцента, центрифугировали (16 000 г) в течение 10 мин при 4°С. Осадок обрабатывали натрий-калий-фосфатным буфером концентрацией 5 мМ (рН 7.3), содержащим 0.2 М NaCl и 5 мМ ЭДТА. Смесь центрифугировали в описанных выше условиях. Аспарагиназу выделяли из полученного супернатанта с помощью комбинации двух типов ионообменной хроматографии на сорбентах SP- и Q-сефароза. Фракции, содержащие фермент, объединяли и переводили в воду MilliQ с помощью ультрафильтрации в системе VivaFlow с использованием мембраны с отсекающим размером пор 10 кДа, после чего раствор лиофилизовали на установке Martin Christ (Beta 1-8KC). Полученный препарат содержал аспарагиназу с чистотой белка более 95%.

Кристаллизация L-аспарагиназы Was72 и ее комплексов с L-аспарататом и L-глутаматом. Поиск условий и кристаллизация проведены методом диффузии паров растворителя в висячей капле с использованием приготовленных растворов PEG различной концентрации и разной молекулярной массы в интервале значений рН 5.5–7.2. Пригодные для структурного исследования кристаллы апо-формы L-аспарагиназы Was72 и ее комплексов получили при температуре 295 K. К 2 мкл раствора белка (концентрация 12 мг/мл) в фосфатном буфере 0.01 М (рН 7.2) на силиконированной стеклянной пластинке добавляли равный объем резервуарного раствора, содержащего 8%-ный PEG3350 в фосфатном буфере 0.1 М (рН 7.2). Стеклянной пластинкой с каплей накрывали ячейку, содержащую 0.5 мл резервуарного раствора. Кристаллы комплексов с аспартатом и глутаматом получены методом сокристаллизации. К капле раствора белка в фосфатном буфере 0.01 М (рН 7.2) добавляли равный объем осадителя, содержащего 15%-ный PEG3350, 0.2 М NaCl, 0.02% NaN3 в 0.1 М натрий-калий-фосфатном буфере (рН 6.0) и 20 мM L-аспарагиновой (или, соответственно, 20 мM L-глутаминовой) кислоты. Кристаллы в форме удлиненных пластин появлялись через два–три дня и через неделю достигали максимального размера 0.05 × × 0.03 × 0.1 мм.

Получение и обработка дифракционных данных. Дифракционные наборы для кристаллов, предварительно замороженных в токе жидкого азота, собраны при 100 K на синхротроне SPring-8 (Япония), снабженном детектором PILATUS, на станции BL41XU. Для сбора данных использован метод вращения, длина волны составляла 0.8 Å, угол вращения 360°, угол качания 0.5°, расстояние кристалл–детектор равно 200 мм. Наборы были обработаны с использованием программы iMosflm [13]. Статистика обработки наборов представлена в табл. 1.

Таблица 1.  

Статистические характеристики экспериментальных наборов рентгеновских данных кристаллов мутанта Was72 аспарагиназы Wolinella succinogenes, выращенных в апо-форме в двух разных пространственных группах и в присутствии L-аспартата (L-asp) и L-глутамата (L-glu)

Параметр Апо-форма Кристалл в присутствии L-asp Кристалл в присутствии L-glu
Пр. гр. P21 P22121 P21 P21
a, b, c, Å 62.82, 109.17, 87.7 60.64, 79.95, 108.51 64.92, 134.36, 73.15 64.76, 110.29, 89.90
α, β, γ, град 90, 95.5, 90 90, 90, 90 90, 93.7, 90 90, 97.72, 90
Т, К 100 100 100 100
λ, Ǻ 0.8 0.8 0.8 0.8
Разрешение, Ǻ 40.00–1.70 (1.79–1.70)* 40.00–1.75 (1.84–1.75) 40.00–1.65 (1.74–1.65) 40.00–2.00 (2.11–2.00)
Число независимых рефлексов 125 360 (18244) 52 936 (7512) 146 129 (21413) 80 519 (11557)
Повторяемость 2.91 (2.98) 4.72 (4.52) 2.89 (2.85) 2.80 (2.71)
Полнота набора, % 97.23 (97.28) 98.31 (97.11) 97.91 (97.58) 95.50 (94.21)
I/σ (I) 9.22 (3.65) 9.03 (4.58) 5.41 (3.20) 5.92 (2.12)
Rmrgd-F 0.06 (0.21) 0.06(0.16) 0.07 (0.22) 0.10 (0.33)

* В скобках приведены значения для последнего слоя.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

L-Аспарагиназа из грам-отрицательных бактерий Wolinella succinogenes (Was) наряду с аспарагиназой из Erwinia chrysanthemi используется при лечении лимфобластной лейкемии. Поэтому получение мутантных форм фермента с минимальной глутаминазной активностью представляет особый интерес. В [11] показано, что глутаминазная активность Was уменьшается при замене пролина в положении 121 (WasP121) на серин (WasS121). Авторы объяснили большую глутаминазную активность большей стабильностью закрытого состояния активного центра вследствие образования дополнительной связи между СHδ-атомом пролина и ароматическим кольцом остатка тирозина активного центра. Стабилизация закрытого состояния способствует связыванию в активном центре более объемного и менее специфичного субстрата глутамина. В [12] глутаминазная активность WasP121 уменьшена иным способом: посредством введения в подвижную петлю, ограничивающую активный центр, двух замен V23Q и K24T (мутант Was72). Замены не только увеличили устойчивость фермента к действию трипсина, но и привели к уменьшению почти на порядок глутаминазной активности. Определение пространственной структуры Was72 даст возможность проследить структурные изменения, способствующие уменьшению глутаминазной активности белка в присутствии остатка пролина в положении 121.

Для получения кристаллов, пригодных для рентгеноструктурного исследования, методом диффузии паров растворителя в висячей капле был проведен поиск условий с использованием растворов PEG с молекулярной массой 3350, 4000, 8000 в интервале концентраций 6–25% при значениях рН 6.5–7.2. Кристаллы апо-формы Was72 получены при использовании в качестве осадителя 15%-ного раствора PEG3350. Наилучшие кристаллы в присутствии L-аспартата и L-глутамата получены при добавлении в раствор осадителя хлорида натрия. Для выращенных кристаллов собраны дифракционные наборы до разрешения 1.70, 1.75 Å (две кристаллические формы апо-фермента), 1.65 Å (комплекс, полученный в присутствии L-аспартата), 2.00 Å (комплекс, полученный в присутствии L-глутамата). Статистические данные дифракционных наборов представлены в табл. 1. Кристаллы апо-формы фермента принадлежат двум модификациям (пр. гр. P21 и P22121). Кристаллы предполагаемых комплексов, полученные методом сокристаллизации в присутствии аспарагиновой или глутаминовой кислоты, имеют одну и ту же пр. гр. Р21, но разные параметры элементарной ячейки. Все обработанные наборы пригодны для решения пространственной структуры фермента методом молекулярного замещения.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 19-04-01148) в части выращивания кристаллов и получения рентгенодифракционных наборов и при поддержке Министерства науки и высшего образования РФ в рамках Государственного задания ФНИЦ “Кристаллография и фотоника” РАН в части обработки рентгенодифракционных наборов.

Список литературы

  1. Hortobagyi G.N., Yap H.Y., Wiseman C.L. et al. // Cancer Treat. Rep. 1980. V. 64. P. 157.

  2. Roberts J., Schmid F.A., Rosenfeld H.J. // Cancer Treat. Rep. 1979. V. 63. P. 1045.

  3. Carlsson H., Stockelberg D., Tengborn L. et al. // Eur. J. Haematol. 1995. V. 55. P. 289.

  4. Aghaiypour K., Wlodawer A., Lubkowski J. // Biochemistry. 2001. V. 40. P. 5655.

  5. Lubkowski J., Palm G.J., Gilliland G.L. et al. // Eur. J. Biochem. 1996. V. 241. P. 201.

  6. Nguyen H.A., Su Y., Lavie A. // J. Biol. Chem. 2016. V. 291. P. 17664.

  7. Rohm K.H., Van Etten R.L. //Arch. Biochem. Biophys. 1986. V. 244. P. 128.

  8. Krasotkina Ju., Borisiva A.A., Gervaziev Yu.V., Sokolov N.N. // Biotechnol. Appl. Biochem. 2004. V. 39. P. 215.

  9. Kravchenko O.V., Kislitsin Yu.A., Popov A.N. et al. // Acta Cryst. D. 2008. V. 64. P. 248.

  10. Miller M., Rao J.K.M., Wlodawer A., Gribskov M.R. // FEBS Lett.1993. V. 328. P. 275.

  11. Nguyen H.A., Durden D.L., Lavie A. // Sci. Rep. 2017. V. 7. P. 41643. https://doi.org/10.1038/srep41643

  12. Sannikova E.P., Bulushova N.V. Cheperegin S.E. et al. // Mol. Biotechnol. 2016. V. 58. P. 528. https://doi.org/10.1007/s12033-016-9950-1

  13. Otwinowski Z., Minor W. // Methods Enzymol. 1997. V. 276. P. 307.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Кристаллография

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал