Кристаллография, 2020, T. 65, № 3, стр. 395-401

ВВЕДЕНИЕ

Исследование и моделирование многих внутриклеточных процессов, таких как процессы транспорта, диффузия макромолекул и т.п., затруднены в связи с недостатком экспериментальных данных о свойствах внутриклеточной жидкости живых клеток. Более ста лет назад работы Эйнштейна продемонстрировали, что движение субмикронных наночастиц (НЧ) в простых растворах определяется принципами броуновского движения [1]. Данная парадигма оказалась непригодной в попытках описания движения макромолекул в комплексных биологических средах [2, 3]. Биологические жидкости, которыми наполнены все клетки, а также полости их органелл, представляют собой водные растворы, содержащие высокие концентрации биомолекул. Белки, углеводы, липиды, нуклеиновые кислоты могут занимать от 5 до 40% объема, что приводит к явлению “макромолекулярного краудинга” (МК) [4, 5]. Ряд исследований последних лет продемонстрировал наличие ряда аномальных явлений, связанных с движением макромолекул в клетках [2, 6–9]. На сегодняшний день существует несколько упрощенных моделей, описывающих МК. Такие модели основаны на результатах исследования модельных растворов [10, 11]. Создание достоверной модели, описывающей динамику в условиях МК биологических сред, невозможно ввиду отсутствия соответствующих экспериментальных данных [12].

В последние годы был успешно реализован ряд исследований, направленных на изучение вязкоэластичных свойств цитоплазмы in vitro [13]. Методом корреляционной спектроскопии изображений (ICS), способным исследовать перемещение молекул во внутриклеточном пространстве по трем измерениям, исследована подвижность отдельных белков [14]. Путем наблюдения за движением наночастицы-зонда, введенной в клетку, были исследованы вязкоэластичные свойства биологических сред [15–17]. Таким образом, все существующие подходы основаны на оптических измерениях, существенным недостатком которых является ограниченная разрешающая способность. Наиболее точные результаты исследования броуновского движения макромолекул и НЧ в реальных биологических средах были получены с пространственным и временным разрешением порядка 100 нм и 1 мкс соответственно [13].

Разрабатывается новый подход к изучению свойств цитоплазмы клеток, который заключается в исследовании внедренных в клетку НЧ оксидов железа методами мессбауэровской спектроскопии. В основе данного подхода лежит анализ броуновского движения НЧ различного размера в жидких средах посредством мессбауэровской спектроскопии [18]. Ранее была развита методика анализа сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров, учитывающая разделение вкладов магнитной релаксации и диффузионного движения НЧ в жидких средах [19]. Также была продемонстрирована возможность получения достоверных мессбауэровских спектров НЧ на основе оксидов железа, диспергированных в вязкой модельной среде, имитирующей клеточную цитоплазму [20]. Таким образом, представляется возможным исследование динамических свойств биологических жидкостей, основанное на анализе методом ядерной гамма-резонансной спектроскопии броуновского движения железосодержащих НЧ, доставленных в живые клетки. Основным преимуществом разрабатываемого подхода должно стать беспрецедентное временное разрешение менее 100 нс, определяемое временем жизни возбужденного состояния ядра ⁵⁷Fe.

Для успешной реализации разрабатываемого подхода применительно к in vitro-исследованиям необходимо создание нанозондов на основе железа. Исследование НЧ в вязких средах сопряжено со значительным снижением вероятности эффекта резонансного поглощения, что затрудняет получение спектров удовлетворительного качества. Использование при изготовлении наночастиц-зондов-прекурсоров, обогащенных изотопом ⁵⁷Fe, позволит скомпенсировать низкое содержание НЧ в последующих in vitro-исследованиях.

В отличие от модельных жидкостей, в которых изменение формы спектральных линий частиц определяется магнитной релаксацией и диффузией, при исследовании биологических объектов необходимо учитывать изменения в мессбауэровских спектрах частиц-зондов, обусловленные их взаимодействием с клетками. Известно, что практически все типы НЧ подвергаются активной биодеградации после попадания в живой организм [21]. В результате взаимодействия с биологической средой в той или иной степени происходит разрушение как органического стабилизирующего покрытия частиц, так и их неорганического “ядра”. Так, в условиях, сходных с условиями внутриклеточных лизосом, в которых локализуется основная масса частиц, может происходить интенсивное разложение “ядра” НЧ на основе оксидов железа вплоть до полного растворения [22]. Процессы, связанные со взаимодействием частиц с биологическими средами, приводят к изменению формы мессбауэровских спектров частиц в составе биологических образцов в сравнении с контрольными спектрами исходных частиц. Такие изменения наблюдались в ряде работ по исследованию биодеградации магнитных НЧ в организме млекопитающих [23, 24].

В настоящей работе синтезированы два типа наночастиц-зондов на основе оксида железа из прекурсоров, обогащенных по изотопу ⁵⁷Fe. В ходе работы исследована биосовместимость полученных частиц и методами мессбауэровской спектроскопии проанализирована устойчивость к биодеградации обоих типов частиц при их инкубации в клеточных культурах в течение нескольких дней.

ЭКСПЕРИМЕНТ

Синтез магнитных наночастиц-зондов (МНЗ). Синтезированы и исследованы два типа МНЗ: меньшего размера (МНЗ-1), полученные методом совместного осаждения солей железа Fe³⁺ и Fe²⁺, и крупного размера (МНЗ-2), полученные методом термического разложения олеатного комплекса железа(III).

Получение водного коллоида МНЗ-1. Смесь 0.0356 г FeCl₂ и 0.0975 г ⁵⁷FeCl₃ растворяли в 2 мл деионизированной воды и перемешивали на магнитной мешалке в течение 10 мин, барботируя аргоном. Далее раствор нагревали до 95°С, при непрерывном перемешивании в него вводили 500 мкл 28%-ного раствора NH₄OH. Полученную смесь интенсивно перемешивали в течение часа при температуре 95°С, далее 0.041 г лимонной кислоты в 500 мкл деионизированной воды добавляли в реакционную смесь и полученный раствор выдерживали при 95°С еще 2 ч с последующим охлаждением до комнатной температуры. Далее смесь центрифугировали (7000 об./мин^–1, 10 мин), полученный осадок диспергировали в 20 мл раствора лимонной кислоты (20 мг·мл^–1) при помощи УЗ-гомогенизатора в течение 20 мин. Процедуру с этапа центрифугирования повторили дважды. Для отделения крупных НЧ полученный раствор центрифугировали в течение 10 мин при 7000 об./мин^–1, надосадочный раствор собирали и доводили его значение pH до 7.4, добавляя 1 М раствор NaOH. Полученный раствор подвергали диализу в течение 48 ч в диализном мешке с размером пор 12–14 кДа. Расчетное содержание изотопа ⁵⁷Fe в МНЗ-1 составило не менее 65%.

Получение водного коллоида МНЗ-2. Для получения олеатного комплекса ⁵⁷Fe(III) 1.294 ммоль олеата натрия растворяли в смеси 10 мл деионизированной воды, 10 мл этанола и 20 мл гексана. Затем 0.432 ммоль ⁵⁷FeCl₃ добавили к раствору. Полученную реакционную смесь нагревали до кипения и удерживали при данной температуре при интенсивном перемешивании в течение 4 ч. Далее раствор охлаждали, нижний слой отделяли с помощью делительной воронки и трижды промывали деионизированной водой (50 мл). Остатки растворителя удаляли на роторным испарителе.

Для получения НЧ оксида железа смесь 0.432 ммоль комплекса олеата ⁵⁷Fe(III), 0.05 г олеиновой кислоты, 0.05 г олеата натрия и 5 мл 1-октадецена помещали в трехгорлую колбу 50 мл, снабженную термометром, подводом инертного газа (аргона) и обратным холодильником. Смесь нагревали до 140°C в токе аргона при непрерывном перемешивании (4000 об./мин^–1) на магнитной мешалке и удерживали при данной температуре в течение 1 ч. Далее реакционную смесь нагревали до температуры кипения со скоростью 4°C/мин^–1 и удерживали при данной температуре в течение 30 мин. К полученному раствору после охлаждения до комнатной температуры добавляли 20 мл изопропанола, после чего НЧ отделяли от раствора при помощи ультрацентрифугирования (14 000 об./мин^–1) и диспергировали в гексане. Для получения стабильного водного коллоида частиц их поверхность модифицировали сополимером Pluronic F-127. 1 мл раствора НЧ в гексане с концентрацией по железу [⁵⁷Fe] = 4.0 мг мл^–1 смешивали с 4 мл водного раствора Pluronic F-127 (4 мг мл^–1) и обрабатывали ультразвуком 30 мин. Частицы, покрытые Pluronic F-127, выделяли из образовавшейся эмульсии при помощи ультрацентрифугирования (14 000 об./мин^–1 в течение 20 мин) и ресуспендировали в деионизированной воде. Описанную процедуру повторяли трижды для полной очистки НЧ. Расчетное содержание изотопа ⁵⁷Fe в МНЗ-2 составило не менее 96%.

Характеризация МНЗ. Морфология и размер неорганического “ядра” полученных частиц устанавливали с использованием метода просвечивающей электронной микроскопии. Исследования проводили на микроскопе JEOL JEM-1400. Средний размер НЧ устанавливали с использованием программного обеспечения ImageJ. После стабилизации синтезированных образцов МНЗ измеряли их гидродинамический размер методом динамического светорассеяния с использованием прибора Malvern Zetasizer Nano ZS. Цитотоксичность синтезированных МНЗ в форме коллоидов проанализировали на клеточной линии рака молочной железы мыши.

Исследование биодеградации. Исследования проводили на клеточной линии 4T1, на которой ранее была проведена оценка цитотоксичности полученных МНЗ. Клетки культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% FBS и 2 ммоль L-глютамина при 37°С во влажной камере при 5%-ной CO₂-атмосфере. Клеточные образцы с МНЗ-1 и МНЗ-2 были подготовлены в ходе аналогичной процедуры, описанной далее. Клетки высевали в Т74 культуральные матрасы в концентрации 60 000 клеток/мл и культивировали 48 ч. После этого культуральную среду сливали из матрасов и заменяли новой порцией, содержащей обогащенные по изотопу ⁵⁷Fe частицы в концентрации 60 мкг/мл. Затем клетки инкубировали в течение 72 ч при 37°С и 5%-ной CO²-атмосфере с наложением слабого магнитного поля под матрасом (0.2 кЭ) с целью повышения эффективности поглощения частиц клетками в результате клеточного захвата [27]. После инкубации клетки открепляли с применением TrypLE, тщательно промывали PBS 4–5 раз, каждый раз центрифугируя с целью удаления частиц-зондов, не попавших в клетки. После этого клетки собирали, высушивали с помощью вакуумного роторного испарителя и размещали в ампулы для дальнейших исследований на спектрометре. В качестве контрольных образцов были подготовлены ампулы с порошком высушенных на испарителе МНЗ обоих типов. Полученные клеточные образцы с частицами-зондами и контрольные образцы частиц исследовали методами мессбауэровской спектроскопии.

Мессбауэровская спектроскопия. Мессбауэровские спектры всех образцов измеряли при комнатной температуре и температуре жидкого азота в геометрии движущегося поглотителя на спектрометре MС-1104Em. Среднее время набора спектров составляло около суток. Для проверки стабильности измерений на другом канале регистрации измеряли эталонный поглотитель α-Fe. В качестве источника гамма-квантов использовали ⁵⁷Co(Rh) активностью 2 мКи. Изомерные сдвиги определяли относительно линии поглощения α-Fe. Анализ всех мессбауэровских спектров проводили в рамках многоуровневой модели релаксации, разработанной для случая двух подрешеток с обменным взаимодействием ферримагнитного типа, каждой из которых соответствует свой парциальный спектр, а также с учетом комбинированного магнитного дипольного и электрического квадрупольного сверхтонкого взаимодействия [19, 25, 26].

РЕЗУЛЬТАТЫ

Из полученных микрофотографий был сделан вывод, что синтезированные МНЗ-2 в значительной степени обладают стержневидной формой, что говорит о высокой полидисперсности образца, в то время как образец МНЗ-1 обладает узким распределением по размеру. Средний размер “ядра” частиц составил для МНЗ-1 и МНЗ-2 порядка 12 ± 1.5 и 21 ± 10 нм соответственно. Значение среднего гидродинамического размера составило для МНЗ-1 порядка 50 нм. Средний гидродинамический размер НЧ в водном растворе после покрытия сополимером Pluronic F-127 составил 140 нм. Такое высокое значение гидродинамического размера обусловлено тем, что данный сополимер относится к мицеллообразующим. По результатам цитотоксического исследования установлены следующие допустимые концентрации нанозондов: 180 мкг/мл для МНЗ-1 и не менее 70 мкг/мл для более крупных МНЗ-2.

Основная часть работы связана с изучением возможной биодеградации МНЗ в in vitro-исследовании. Для полученных МНЗ-1 и МНЗ-2 были исследованы изменения формы их мессбауэровских спектральных линий в результате пребывания частиц внутри живых клеток в течение 5 дней. На рис. 1 представлены результаты исследования частиц-зондов, стабилизированных цитрат-ионами. Сверху представлены порошковые спектры частиц, измеренные при температуре жидкого азота и при комнатной температуре. Ниже представлены спектры образца лиофилизированных 4Т1 клеток, которые 120 ч инкубировались с данным типом частиц. Спектры измерены в аналогичных условиях. Форма линий спектров качественно отражает стандартное поведение ансамбля НЧ оксида железа с магнитной анизотропией. Анализ спектров показывает, что длительное (120 ч) пребывание частиц внутри клеточной культуры практически не повлияло на форму спектральных линий МНЗ-1 (табл. 1). Схожая картина наблюдается в случае МНЗ-2, спектры которого представлены на рис. 2, однако с некоторыми отличиями – появление ярко выраженного синглета в образце частиц, прошедших этап инкубации в клетках. Данный синглет фигурирует как в низкотемпературном спектре, так и в спектре при комнатной температуре. Характерный химический сдвиг порядка –0.1 мм/с при комнатной температуре и характер синглета, не свойственный биологическим формам железа, дают основание полагать, что в клеточный образец с МНЗ-2 могла попасть посторонняя примесь, например стружка нержавеющей стали, имеющая схожие мессбауэровские параметры с наблюдаемым синглетом. Окончательная природа данного синглета не установлена. Тем не менее как в случае МНЗ-1, так и в случае МНЗ-2 не наблюдается трансформаций спектра, характерных для изменений, связанных с процессами биодеградации НЧ в организме. Так, ранее наблюдались заметные изменения в спектрах частиц, стабилизированных декстраном, уже через час после их введения в организм млекопитающих [23, 28]. По всей видимости, столь быстрые изменения свойств ансамбля частиц связаны с изменением характера межчастичного взаимодействия вследствие разрушения полимерного стабилизирующего покрытия частиц, поскольку в случае НЧ, покрытых декстраном, они локально связаны дипольным взаимодействием. В процессе биодеградации покрытие разрушается, что приводит к высвобождению отдельных частиц и повышению частоты релаксации вектора намагниченности. В результате в спектрах, измеренных при комнатной температуре, наблюдается характерная трансформация секстета в дублет [27]. При этом в силу своей суперпарамагнитной природы, при достаточно низких температурах компонента спектра отдельных НЧ восстанавливает свою сверхтонкую структуру. Другой механизм трансформации сверхтонкой структуры спектральных линий НЧ в живых организмах связан с непосредственной биодеградацией неорганического ядра и образованием в результате парамагнитных форм эндогенного железа, преимущественно железосодержащих белков [21, 24]. Для данного процесса также характерна трансформация в спектре частиц секстета в дублет, который сохраняет свою форму при температурах 300 и 78 K. В случае биодеградации частиц в организмах млекопитающих интенсивность дублета нарастает со временем и становится значительной уже после нескольких дней их пребывания в организме.

Рис. 1.

⁵⁷Fe-мессбауэровские спектры МНЗ-1 на основе оксида железа, стабилизированных цитрат-ионами. Представлены спектры исходных частиц и частиц после их 5-дневной in vitro-инкубации в клетках линии 4Т1; 1, 2 – парциальные секстеты от магнитных подрешеток А и В.

Рис. 2.

⁵⁷Fe-мессбауэровские спектры МНЗ-2. Представлены спектры исходных частиц и частиц после их 5-дневной in vitro-инкубации в клетках линии 4Т1; 1, 2 – парциальные вклады от ферримагнитных подрешеток А и В, 3 – синглет неустановленной природы.

Таким образом, в случае обоих образцов полученных частиц в клеточных спектрах не наблюдается значительных изменений, в том числе характерных для процессов биодеградации. Несмотря на то что МНЗ-2, стабилизированные Pluronic F-127, образуют мицеллярные структуры и поэтому должны быть связаны дипольным взаимодействием, их длительное пребывание в клетках не привело к характерной релаксационной трансформации спектра. Это может объясняться как крупным размером ядра данного типа частиц, так и устойчивостью к in vitro-биодеградации покрытия Pluronic F-127. В спектрах обоих типов частиц также отсутствует дублет, характерный для парамагнитных форм эндогенного железа. Следовательно, на уровне отдельных клеток процессы биодеградации магнитных частиц практически не протекают, либо протекают в значительно более низком темпе, чем в организме млекопитающего.

Тем не менее отметим заметный признак взаимодействия МНЗ-2 с клеточной культурой (табл. 2). Мессбауэровские спектры клеток после введения МНЗ-2 демонстрируют незначительное содержание двухвалентного железа, что выражается в малом химическом сдвиге компоненты B-подрешетки и форме линий спектра, близкой к симметричной (не считая синглета). Такой эффект может быть объяснен активным окислением двухвалентного железа в составе частиц магнетита внутри клеток в результате реакции Фентона [29].

Также отметим, что вероятность эффекта резонансного поглощения на клеточном образце с более мелкими МНЗ-1 превосходит вероятность эффекта на образце клеток с МНЗ-2, имеющими гидродинамический размер порядка 140 нм, при том, что на этапе инкубации частиц в клетках они были добавлены в одинаковой исходной концентрации. По всей видимости, это связано с тем, что крупные частицы с меньшим успехом способны попадать внутрь клеток в ходе эндоцитоза, в результате чего в клетки с образцом МНЗ-2 проникло меньшее количество экзогенного изотопа ⁵⁷Fe.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Синтезированы два типа магнитных НЧ различного размера с измененным изотопным составом по ⁵⁷Fe. Данные частицы были проанализированы in vitro на предмет биосовместимости и устойчивости к биодеградации в клеточной культуре. Установлено, что оба типа частиц в условиях инкубации с клетками за 120 ч практически не претерпевают характерных для процессов биодеградации изменений, что позволяет говорить об устойчивости полученных частиц к разложению в in vitro. Таким образом, оба типа частиц являются пригодными для использования в качестве зондов для мессбауэровских исследований живых организмов. В ходе исследования на примере МНЗ-2 было установлено, что НЧ магнетита, даже покрытые полимерным стабилизирующим покрытием, активно окисляются в клетках.

Работа выполнена при частичной поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 18-32-20166, 19-02-00966) в части синтеза; в рамках Государственного задания ФТИАН им. К.А. Валиева РАН Минобрнауки РФ по теме №0066-2019-0004.