Кристаллография, 2021, T. 66, № 5, стр. 697-707

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение

1. Регуляторные комплексы рибосомного белка L1 с мРНК

2. Определение структуры и исследования РНК-связывающих свойств глобального регулятора трансляции – белка Hfq

3. Исследования РНК-связывающих свойств архейных Lsm белков

4. Исследование функции регуляторов транскрипции UxuR и ExuR

5. Структурные и функциональные исследования глицил-тРНК-синтетазы человека

6. Структурные исследования гетеротримерного фактора инициации трансляции 2

Заключение

ВВЕДЕНИЕ

Определение структур бактериальных рибосом с помощью методов рентгеноструктурного анализа и криоэлектронной микроскопии на рубеже ХХ и ХХI веков стало прорывным событием в исследованиях процесса биосинтеза белка в клетках. Важной стартовой частью этого проекта стало определение структур отдельных компонентов рибосомы, а именно, рибосомных белков и их комплексов с фрагментами рибосомной РНК. Они позволили ускорить интерпретацию получаемых огромных карт электронной плотности рибосом, а также описать подвижные участки рибосомных субчастиц, которые не видны на структурах целых рибосом. В Институте белка РАН (ИБ РАН) найдены условия кристаллизации 70S рибосом и 30S рибосомных субчастиц Thermus thermophilus, определены структуры более пятнадцати рибосомных белков и ряда рРНК-белковых комплексов, что внесло существенный вклад в реализацию масштабного “рибосомного проекта”. Разработан комплексный подход к определению структур РНК-белковых комплексов, включающий в себя рациональный дизайн фрагментов РНК, образующих наиболее стабильные комплексы с белками, кристаллизацию этих комплексов, получение дифракционных данных на лабораторной установке Proteum (Bruker-AXS) и на источниках синхротронного излучения BESSY, DESY, ESRF, MAX IV с последующим определением структур методами многоволновой аномальной дифракции и мультидоменного молекулярного замещения. Накопленный опыт по структурно-функциональным исследованиям рРНК-белковых комплексов позволил перейти к решению новых задач, связанных с изучением целого ряда регуляторных комплексов. Исследования регуляции трансляции и транскрипции в клетках на атомарном уровне позволяют находить ответы на новые вопросы, стоящие перед научным сообществом. В предлагаемом обзоре представлены краткие результаты наиболее интересных работ сотрудников ИБ РАН в этом направлении.

1. РЕГУЛЯТОРНЫЕ КОМПЛЕКСЫ РИБОСОМНОГО БЕЛКА L1 С МРНК

Рибосомный двухдоменный белок L1 является составной частью L1-выступа большой субчастицы рибосомы; у прокариот этот белок также регулирует трансляцию белков своего оперона по принципу обратной связи. В E. coli белок L1 связывается с участком мРНК перед первым геном L11 оперона [1], в экстремально-термофильных бактериях Thermus thermophilus и Thermotoga maritima имеются два участка связывания на мРНК [2], в археях Methanococcus vannielii и Methanococcus jannaschii регуляторный участок на мРНК располагается в начале кодирующей последовательности первого гена L1 оперона [3, 4]. Исследование регуляторных свойств рибосомного белка L1 явилось естественным продолжением работ по изучению структурной основы биосинтеза белка.

Белок L1 – единственный рибосомный белок, регуляторные свойства которого детально исследованы на основе сравнительного анализа структур комплексов L1-рРНК и L1-мРНК. Для получения кристаллизуемых препаратов комплекса L1-мРНК применена стратегия, разработанная в ИБ РАН при исследовании структуры комплекса рибосомного белка S8 со специфическим фрагментом 16S рРНК [5]. Были получены 10 фрагментов мРНК длиной от 36 до 49 нуклеотидов, специфически связывающихся с белком L1. Менялась длина и нуклеотидный состав двух спиралей, фланкирующих ассиметричную петлю, содержащую консервативные нуклеотиды. Верхняя полноразмерная спирально-петельная часть фрагментов мРНК, не содержащая консервативных нуклеотидов, в укороченных вариантах была заменена четырехнуклеотидной петлей UUCG [6]. Семь фрагментов представляли собой различные вариации L1-связывающего фрагмента мРНК M. vannielii, три фрагмента являлись вариациями специфического участка мРНК M. jannaschii. Высокую мозаичность кристаллов удалось понизить добавлением солей ртути в кристаллизационную каплю. Были определены структуры трех комплексов: комплекса L1-мРНК (49 нт) из M. jannaschii (разрешение 3.4 Å [7]) и двух гетерологичных комплексов, образованных белком L1 T. thermophilus и короткими фрагментами мРНК M. vannielii, длиной 38 (разрешение 2.6 Å [8]) и 36 нт (разрешение 2.1 Å [9]).

Белок L1 в перечисленных комплексах контактировал преимущественно с атомами сахарофосфатного остова мРНК. Сравнение структур рибосомного [10, 11] и полученных регуляторных комплексов белка L1 показало, что белок образует сеть недоступных растворителю водородных связей с мотивом, содержащим строго консервативные нуклеотиды и расположенным в месте сочленения двух спиралей, структурно инвариантном как на мРНК, так и на рРНК. Со стороны белка L1 в этом взаимодействии участвуют расположенные рядом петли домена I (рис. 1).

Рис. 1.

Наложение структур комплексов рибосомного белка L1 с фрагментами мРНК длиной 49 нуклеотидов (серый, PDB ID 1U63), 38 нуклеотидов (белый, PDB ID 1ZHO) и 36 нуклеотидов (черный, PDB ID 2HW8). Указаны 5´- и 3´-концы РНК, домены I и II белка L1.

Для исследования особенностей взаимодействия белка L1 со специфическими фрагментами мРНК и рРНК применяли комбинированный структурно-функциональный подход, добавив к структурному анализу метод поверхностного плазмонного резонанса, который позволяет наблюдать кинетику взаимодействия молекул в реальном времени [12]. Специфический фрагмент мРНК отличается от L1-связывающего фрагмента рРНК сильно укороченными участками, соответствующими спирали 78 и петле Б рибосомной РНК (рис. 2). Это приводит к понижению сродства белка L1 к мРНК на несколько порядков по сравнению с комплексом L1-рРНК.

Рис. 2.

Сравнение структур комплексов рибосомного белка L1 с фрагментом 23S рРНК (PDB ID 1MZP) (а) и белка L1 с мРНК (PDB ID 2HW8) (б). Указаны элементы структур РНК и белка.

Основная консервативная область контакта белка L1 расположена на его домене I и может быть разделена на два участка: один из них включает в себя консервативную триаду Thr-Met-Gly, образующую закрытые от растворителя водородные связи с нуклеотидами спирали H77 рРНК [13], другой – N-концевую часть спирали α1, взаимодействующую с нуклеотидами спирали H78 [14]. В комплексах белка L1 с мРНК и рРНК оба участка взаимодействия на домене I имеют одинаковые консервативные водородные связи, однако количество неконсервативных контактов в комплексе с мРНК уменьшается, что значительно снижает сродство белка к матричной РНК. Был получен домен I белка L1 в изолированном виде и показано, что он достаточен для взаимодействия как с рРНК, так и с мРНК [15, 16], а также обладает регуляторными свойствами целого белка [17]. Аминокислотные остатки домена II белка в рибосомном комплексе образуют дополнительные контакты с рРНК, что еще больше увеличивает стабильность рибосомного комплекса. Такое комплексное исследование комплексов белка L1 с мРНК и рРНК выявило причину разницы в сродстве белка к двум разным мишеням и позволило раскрыть основу регуляции трансляции рибосомным белком L1 по механизму обратной связи.

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТРУКТУРЫ И ИССЛЕДОВАНИЯ РНК-СВЯЗЫВАЮЩИХ СВОЙСТВ ГЛОБАЛЬНОГО РЕГУЛЯТОРА ТРАНСЛЯЦИИ – БЕЛКА HFQ

РНК-связывающий бактериальный белок Hfq принадлежит к обширному семейству Sm/Lsm белков и в бактериях выполняет роль многофункционального белка-регулятора трансляции [18]. Это небольшой белок размером ∼10 кДа, формирующий в растворе четвертичную структуру в виде гексамера [18]. В 1979 г. белок Hfq был идентифицирован как хозяйский фактор, необходимый для репликации (+)-цепи РНК бактериофага Qβ [19]. В дальнейшем было выявлено, что делеция гена hfq в клетках Escherichia coli приводит к изменению продукции более чем 30 различных белков, включая белки репарации ДНК [20], вовлеченные в метаболизм железа [21] и синтез σ^s-субъединицы бактериальной РНК-полимеразы [22]. В большинстве случаев регуляция трансляции белком Hfq реализуется посредством транс-кодируемых малых регуляторных РНК (мрРНК; в английской литературе используют аббревиатуру sRNA). Белок Hfq входит в когорту так называемых “РНК-шаперонов”, включающих в себя такие бактериальные регуляторные белки, как CsrA, ProQ, KhpA, KhpB, SpoVG, способствующие взаимодействию мрРНК со своими мишенями на мРНК [23]. Этот способ регуляции позволяет контролировать адаптацию бактерий к изменению внешней среды за короткое время. Hfq – наиболее универсальный белок среди РНК-шаперонов и обнаружен в большинстве бактерий. Он стимулирует взаимодействие мрРНК с комплементарными участками на мРНК с последующей репрессией или стимуляцией трансляции, а также регулирует время жизни мРНК за счет взаимодействия с их поли(А)3'-концевыми участками.

В начале 2000 г. были получены первые структуры белка из Staphylococcus aureus [24], укороченной формы белка из E. coli [25] и полноразмерного белка из Pseudomonas aeruginosa [26], что позволило предложить ряд гипотез о том, как белок способствует взаимодействию двух разных РНК. Были идентифицированы два основных участка связывания РНК на поверхности гексамера белка: уридин-специфический участок на “проксимальной” поверхности белка (со стороны N-концов мономеров белка) и аденин-специфический на противоположной, “дистальной”, поверхности (рис. 3).

Рис. 3.

Расположение участков взаимодействия белка Hfq с РНК. В центре – вид на гексамер белка с боковой стороны. Указаны N- и С-концы мономеров белка. Выделены области связывания РНК: уридин-специфический проксимальный сайт, аденин-специфический дистальный сайт и один из шести уридин-специфических боковых сайтов. Слева вверху показана структура комплекса белка Hfq с 5'-GUUUUUA-3' РНК [25] (вид с проксимальной стороны гексамера; PDB ID 1KQ2), слева внизу – структура комплекса Hfq с олиго(А) РНК [68] (вид со стороны дистального сайта; PDB ID 3GIB), справа посередине – структура комплекса Hfq с УМФ [28] (вид со стороны проксимального сайта; PDB ID 4J6X). Молекулы РНК и нуклеотидов показаны шаростержневой моделью на поверхности гексамеров белка Hfq.

Структуры комплексов Hfq с короткими фрагментами РНК показали детали узнавания оснований РНК аминокислотными остатками белка и объяснили его высокую специфичность к определенным последовательностям РНК. Интересно, что для разрушения вторичной структуры РНК белком Hfq не требуется дополнительной энергии в виде расщепления АТФ или ГТФ, однако ряд биохимических данных позволял предположить наличие АТФазной активности белка [27]. Мы получили структуру комплекса белка Hfq с АТФ и, исходя из особенностей контактов АТФ с аминокислотными остатками белка, сделали вывод, что вероятность специфической АТФазной активности Hfq крайне мала. Параллельно проверили возможность других одиночных нуклеотидов связываться с поверхностью белка и оказалось, что Hfq обладает высоким сродством к УТФ и ЦТФ, но не связывает ГТФ. Положение связанных нуклеотидов и ориентация их оснований полностью соответствовали таковым в структурах комплексов Hfq с олигонуклеотидами [28]. На основе этих наблюдений была предложена методика картирования участков связывания одноцепочечных РНК на поверхности РНК-связывающих белков [29, 30], которая в дальнейшем использовалась при исследовании гомологичных архейных Lsm белков. Более того, удалось идентифицировать третий, “латеральный” участок взаимодействия белка Hfq с РНК (рис. 3). Он расположен на боковой поверхности гексамера белка в области N-концевой спирали мономера и, как оказалось, является местом встречи и взаимодействия двух РНК – мрРНК и мРНК. Данное открытие было сделано одновременно с идентификацией этого участка биохимическими методами, что подтвердило достоверность наших результатов [31–34]. Таким образом, мы впервые показали на структурном уровне, как происходит фиксация цепи РНК с последующим ее взаимодействием с белковым партнером. Эти данные внесли существенный вклад в дальнейшее развитие модели взаимодействия мрРНК с мРНК с участием белка Hfq и процессов регуляции трансляции, опосредованное белками РНК-шаперонами.

3. ИССЛЕДОВАНИЯ РНК-СВЯЗЫВАЮЩИХ СВОЙСТВ АРХЕЙНЫХ LSM БЕЛКОВ

Архейные Lsm белки (или SmAP – Sm Archaeal Proteins), как и бактериальные белки Hfq, принадлежат к семейству Sm/Lsm и имеют аналогичную третичную структуру из пяти-тяжевого β-листа с N-концевой α-спиралью [35]. Геномы различных видов архей могут кодировать от одного до трех паралогов SmAP белков, классифицируемых как SmAP1, SmAP2 и SmAP3. Интересно, что SmAP1 и SmAP2 из клеток одного вида имеют меньшую степень гомологии, чем SmAP1 (или SmAP2) из клеток разных организмов. Однако все они имеют строгий консенсус по аминокислотной последовательности RGXX (где Х – положительно заряженный аминокислотный остаток) в отличие от консенсуса YKHАI бактериальных белков Hfq (рис. 4а). Кроме этого, в отличие от большинства бактериальных белков Hfq архейные SmAP белки имеют удлиненную петлю L4, соединяющую тяжи β3 и β4, и лишены протяженной неупорядоченной С-концевой части. Наиболее заметное отличие SmAP от бактериальных гомологов – формирование ими четвертичной структуры в виде гомогептамеров (за редким исключением), а не гомогексамеров (рис. 4б). Этим свойством они ближе к своим эукариотическим гомологам – белкам Sm/Lsm, которые участвуют в процессинге РНК в клетках и, как правило, входят в состав различных РНП, таких как сплайсосома. В отличие от бактериальных и эукариотических гомологов функции SmAP в архейных клетках не установлены. Имеются данные, что они связываются с рядом “незрелых” РНК, а также с белками, участвующими в процессинге РНК в клетках [36–39], что указывает на их возможную вовлеченность в созревание РНК, однако прямых доказательств функциональной роли SmAP белков пока не имеется.

Рис. 4.

Выравнивание аминокислотных последовательностей представителей белков Hfq (Hfq_Eco – E. coli, Hfq_Pae – P. aeruginosa, Hfq_Sty – Salmonella typhimurium, Hfq_Bsu – Bacillus subtilis), SmAP (SmAP1_Mva – Methanococcus vannielii, SmAP1_Sso – Sulfolobus solfataricus, SmAP1-Afu – Archeoglobus fulgidus) и эукариотических Lsm из Saccharomyces cerevisiae. Внизу показаны элементы вторичной структуры, соответствующие аминокислотным последовательностям белков. Выравнивание сделано в программе T-Coffee с учетом информации по 3D-структурам белков (Espresso) [69] (а). Схематическое представление структур гексамерного бактериального белка Hfq из P. aeruginosa (слева, PDB ID 1U1S) и гептамерного архейного белка SmAP из M. vannielii (справа, PDB ID 5MKI). Вид со стороны α-спиралей мономеров белков (проксимальной стороны) (б).

Задачей проводимых исследований стало определение РНК-связывающих и РНК-шаперонных свойств белков SmAP с целью определения возможной функции этих белков в археях. Для этого применили описанную выше технику идентификации РНК-связывающих участков на поверхности SmAP белков, определив ряд структур комплексов белков с рибонуклеотидами. Полученные данные показали, что SmAP белки имеют только один, уридин-специфический РНК-связывающий сайт на проксимальной стороне гомогептамера [40, 41]. Таким образом, сложно предположить, что SmAP белки могут связывать две разные молекулы РНК и участвовать в регуляции трансляции посредством мрРНК. Однако, как было показано ранее, SmAP белки могут разрушать структуру целевой РНК без участия второй, комплементарной, РНК, что потенциально позволяет этим белкам взаимодействовать с мРНК, изменять ее пространственную структуру и таким образом влиять на процесс трансляции. Следовательно, SmAP белки нельзя исключать из числа возможных регуляторов трансляции в археях, но для полного выяснения их функции требуются дополнительные исследования.

4. ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИИ РЕГУЛЯТОРОВ ТРАНСКРИПЦИИ UXUR И EXUR

Экспрессия генов регулируется не только на уровне трансляции, но и на уровне транскрипции. Одним из примеров этого является регуляция метаболического процесса усвоения D-гексуроновых кислот, таких как D-глюкуронат и D-галактуронат (метаболический путь Эшвелла) [42, 43]. В бактериях этот путь является альтернативой наиболее известному гликолитическому пути метаболизма и играет заметную роль для выживания в стрессовых условиях. Процессы утилизации гексуронатов находятся под контролем двух тесно взаимосвязанных регуляторов – UxuR и ExuR [44, 45]. Эти белки являются паралогами, так как ExuR, по-видимому, появился в результате дупликации гена uxuR [46], и относятся к семейству регуляторов GntR. К настоящему времени получены пространственные структуры нескольких белков этого семейства [46, 47], однако степень их гомологии с UxuR и ExuR составляет не более 25% [48]. Целью данной работы стало определение структур этих двух белков и их комплексов с регуляторными областями ДНК, в том числе в присутствии лигандов – глюкороната и галакторуната. Это позволило бы на молекулярном уровне описать регуляцию экспрессии генов, вовлеченных в метаболизм гексуронатов.

Получение белков в препаративных количествах было осложнено высокой склонностью белков UxuR и ExuR к агрегации и их токсичностью для клеток-продуцентов, поэтому пришлось тщательно подбирать условия их получения [49]. Эксперименты по определению сродства белков к целевым участкам ДНК подтвердили наличие двух различающихся участков связывания UxuR и ExuR, причем присутствие сахаров меняло сродство белков к ДНК. Нестабильность белков в условиях кристаллизации не позволила получить кристаллы белков в свободном состоянии и в комплексах с лигандами и/или фрагментами ДНК, поэтому структуры таких комплексов промоделированы с помощью методов гибкого докинга на основе структур гомологичных белков [50]. Это позволило локализовать предположительный участок связывания сахаров в области С-концевых доменов UxuR, совпадающий с местом, предсказанным ранее по данным мутагенеза.

Применение современных методов молекулярного моделирования и молекулярной динамики позволяет получить интересные данные по взаимодействию молекул, однако только определение структур комплексов может подтвердить достоверность расчетных моделей.

5. СТРУКТУРНЫЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЛИЦИЛ-ТРНК-СИНТЕТАЗЫ ЧЕЛОВЕКА

Энтеровирусы, а также некоторые родственные им вирусы инициируют синтез своих белков в зараженной эукариотической клетке посредством кэп-независимого механизма. В этом случае специфическая вторичная структура определенного участка вирусной мРНК (IRES) делает возможной сборку трансляционного аппарата непосредственно в месте, близком к старт-кодону. В отличие от кэп-зависимой инициации трансляции механизмы IRES-зависимой инициации весьма разнообразны. IRES из различных источников могут быть абсолютно не похожи друг на друга: не найдено элемента структуры, общего для всех IRES, или какой-либо заметной гомологии, общей для всех их последовательностей. Такое разнообразие вызвало определенные трудности классификации IRES c момента их открытия. Однако интенсивные исследования вирусов, их мРНК и механизмов ее трансляции позволили к настоящему моменту выделить ряд общих черт, позволяющих вполне определенно отличать одни типы IRES от других.

Большинство вирусных IRES обладают стабильной вторичной и третичной структурами, способствующими их эффективному связыванию с 40S субчастицей [51]. Инициация трансляции на всех исследованных на сегодняшний день IRES типа I зависит от наличия ITAF (англ: IRES trans-acting factors, представляют собой специальные факторы трансляции), список которых до сих пор полностью не определен. Одним из ITAFs, необходимых для эффективной инициации трансляции полиовирусной мРНК, является глицил-тРНК-синтетаза человека (GlyRS). Этот белок взаимодействует с апикальной частью домена V IRES полиовируса, которая мимикрирует под антикодоновую шпильку глициновой тРНК и содержит глициновый антикодон. GlyRS имеет трехдоменную структуру, при этом за узнавание глицинового антикодона отвечает отдельный домен, называемый ABD (Anticodon Binding Domein). К настоящему моменту определены структуры GlyRS как в свободной форме, так и в комплексе с глициновой тРНК, что позволило детально изучить механизм узнавания белком антикодоновой петли тРНК [52, 53], однако структура комплекса GlyRS с вирусной мРНК пока не определена.

Ранее были получены фрагменты домена V IRES первого типа (IRES I) и определен минимальный фрагмент, взаимодействующий с GlyRS [54]. Также было показано, что глицил-тРНК-синтетаза человека специфически связывает фрагменты IRES I вирусов, таксономически удаленных друг от друга, с близкими константами. Это указывает на универсальность механизма регуляции инициации трансляции при помощи глицил-тРНК-синтетазы для таких вирусов и на схожесть пространственных структур соответствующих участков их мРНК [55].

Сродство глицил-тРНК-синтетазы человека к фрагментам IRES I примерно в 3 раза превышает сродство к родственной тРНК [55], что дает основания предполагать схожий механизм взаимодействия белка и РНК в обоих случаях. В отличие от тРНК «антикодоновая петля» в составе апикальной части пятого домена IRES содержит не пять, а шесть нуклеотидов. Пространственная структура V домена IRES I до сих пор неизвестна. Однако удалось построить теоретическую модель этого фрагмента и его комплекса с ABD доменом глицил-тРНК-синтетазы человека (рис. 5), основываясь на имеющейся структурной информации [56]. Модель имеет повышенное (по сравнению с гомологичной частью tRNAGly) число водородных связей с белком, что позволяет объяснить полученные нами биохимические данные.

Рис. 5.

Расчетная модель комплекса антикодон-связывающего домена глицил-тРНК-синтетазы человека с фрагментом IRES полиовируса.

6. СТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЕТЕРОТРИМЕРНОГО ФАКТОРА ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ 2

У бактерий фактор инициации трансляции 2 (IF2) является шестидоменным мономерным белком, который способствует связыванию инициаторной аминоацил-тРНК с малой рибосомной субчастицей. У архей и эукариот фактор инициации трансляции 2 (e/aIF2) состоит из трех различных субъединиц: α, β, γ. Функционально он аналогичен бактериальному IF2, однако ни одна из субъединиц e/aIF2 не имеет гомологии с бактериальным IF2. Субъединицы эукариотического eIF2 по размеру больше, чем гомологичные им субъединицы архейного aIF2. В присутствии ГТФ гетеротримерный фактор e/aIF2 специфически узнает инициаторную Met-тРНКi и образует с ней тройной комплекс e/aIF2–GTP–Met-тРНКi. В такой форме e/aIF2 доставляет Met-тРНКi в P-участок малой рибосомной субчастицы, где за счет кодон-антикодонового взаимодействия происходит точное узнавание инициирующего кодона на мРНК с последующим гидролизом ГТФ. В комплексе с ГДФ фактор инициации трансляции IF2 покидает рибосому, после чего происходит обмен связанного ГДФ на ГТФ, и фактор снова способен образовывать прочный комплекс с Met-тРНКi. Таким образом, фактор инициации трансляции IF2 выполняет очень важную функцию в клетке: запускает синтез белка на рибосоме.

Впервые структура гетеротримерного фактора инициации трансляции IF2 была определена в лаборатории ИБ РАН [57] и до настоящего времени она остается единственной кристаллической структурой полноразмерного фактора инициации трансляции eIF2 эукариотического типа. Структура aIF2 была определена из термофильной археи Sulfolobus solfataricus и в дальнейшем использовалась для построения модели β-субъединицы эукариотического фактора eIF2 в составе пространственной структуры дрожжевого 48S преинициаторного комплекса (48S PIC), которая исследована методом криоэлектронной микроскопии [58]. Общими очертаниями гетеротримерный фактор инициации трансляции 2 напоминает английскую букву L и состоит из конформационно-стабильной центральной части и двух подвижных “крыльев” [57]. Минимальной и достаточной для связывания инициаторной Met-тРНКi является конформационно-стабильная центральная часть aIF2 – γ-субъединица с третьим доменом α-субъединицы aIF2α_D3γ.

Практически одновременно были расшифрованы две кристаллические структуры тройного комплекса aIF2–ГТФ–Met-тРНКi с использованием архейного фактора инициации трансляции IF2. В 2012 г. французская группа ученых получила кристаллы тройного комплекса, содержащего полноразмерный гетеротримерный фактор aIF2αβγ, однако построить и уточнить модель для подвижной β-субъединицы не удалось в силу недостаточно ясной электронной плотности [59]. В 2013 г. в лаборатории ИБ РАН были получены кристаллы тройного комплекса, содержащего коровую конформационно-стабильную часть фактора aIF2α_D3γ [60]. Обе структуры тройного комплекса дали понимание того, как фактор aIF2 отличает инициаторную тРНК от элонгаторной тРНК. Инициаторная тРНК обращена к белку aIF2 своей D-стороной, тогда как фактор элонгации EF-Tu, структурно схожий с aIF2γ, взаимодействует с элонгаторной тРНК по Т-шпильке [61]. Таким образом, различия в нуклеотидной последовательности T-шпильки инициаторной и элонгаторных тРНК могут предотвращать связывание инициаторной тРНК с EF-Tu, а различия в D-шпильке могут предотвращать связывание элонгаторных тРНК с aIF2.

При сравнении двух структур тройного комплекса aIF2–ГТФ–Met-тРНКi было обнаружено, что несмотря на то, что в обеих структурах тРНК обращена к белку своей D-стороной, взаимодействует она с aIF2 несколько по-разному (рис. 6). В структуре тройного комплекса, полученной нашей группой, акцепторный стебель тРНК образует контакты со всеми тремя доменами γ-субъединицы и aIF2α_D3: CCA-конец тРНК локализован в расщелине между G(I)- и III-доменами γ-субъединицы, II-домен γ-субъединицы aIF2 взаимодействует с 5′-концом Met-тРНКi, а белок aIF2α_D3 контактирует с локтем тРНК [60]. В модели aIF2–ГТФ–Met-тРНКi, полученной группой французских коллег [59], акцепторный стержень тРНК не взаимодействует с III-доменом γ-субъединицы, а локоть тРНК контактирует с aIF2α_D1 и aIF2α_D2, которые согласно биохимическим данным проявляют неспецифическую РНК-связывающую активность [62, 63].

Рис. 6.

Сравнение структур комплексов тРНК с EF-Tu (PDB ID 1TTT, слева), aIF2α_D3γ (PDB ID 3QSY, в центре) и aIF2αβγ (PDB ID 3V11, справа).

В сотрудничестве с лабораторией И. Шатского (НИИ ФХБ МГУ) в экспериментах in vitro показано, что архейный фактор aIF2 способен поддерживать рибосомное сканирование [64]. С помощью метода тоупринтинга выявили, что если добавить архейный фактор aIF2 в систему инициации трансляции млекопитающих, в которой отсутствует его эукариотический гомолог, то 48S инициаторный комплекс образуется, и идет сканирование мРНК в поисках инициирующего AUG-кодона. Эта совместная работа раскрыла особенность второй стадии инициации трансляции – присоединение большой субчастицы к 48S инициаторному комплексу. На этом этапе в работу включаются дополнительные факторы: eIF5 и eIF5B (промотируют присоединение большой субчастицы). У архей aIF5 отсутствует, но мы добавляли eIF5 в систему трансляции с архейным вторым фактором, и оказалось, что если заменить eIF2 на aIF2, то 80S рибосомный комплекс не образуется. Этот результат демонстрирует, что в археях способ стимуляции ГТФазной активности aIF2 отличается от того, который реализуется в эукариотах.

Дальнейшие наши исследования в области архейного фактора aIF2 привели к тому, что был определен ряд пространственных структур γ-субъединицы aIF2, представляющих разные функциональные состояния этой рибосомной ГТФазы: от активного (ON) ГТФ-связанного до неактивного (OFF) ГДФ-связанного состояния, проходя через промежуточные формы, когда белок может быть связан одновременно с ГДФ и неорганическим фосфатом P_i или не содержать нуклеотида вовсе [65]. Сравнение структур впервые продемонстрировало смещение доменов II и III относительно домена G(I), хотя и не столь значительное как в его структурном гомологе, факторе элонгации трансляции EF-Tu. Скоординированные перестройки происходят и в петлях-переключателях Switch 1 и 2. Петля Switch 1 играет роль “застежки” для нуклеотид-связывающего кармана. Обнаружено, что конформация этого переключателя не позволяет полностью закрыть карман в aIF2γ в отличие от EF-Tu. Он остается открытым на протяжении всего цикла работы aIF2γ, и γ-фосфату ничто не препятствует покинуть белок после гидролиза ГТФ. Это в свою очередь указывает на возможность спонтанного гидролиза ГТФ у фактора aIF2 на рибосоме и объясняет отсутствие у архей фактора aIF5, стимулирующего ГТФазную активность aIF2.

При анализе структуры aIF2γ, нуклеотид-связывающий карман которой находится в состоянии интермедиата при переходе из ГТФ- в ГДФ-связанную форму, были обнаружены три кластера молекул воды, образующие водные мостики между γ-фосфатом ГТФ и двумя консервативными остатками Asp19 и Asp93 [66]. Эти водные мостики могут быть использованы для переноса протона, образующегося при каталитической реакции – гидролизе ГТФ.

Кроме этого, выявлена дополнительная петля (третья) у γ-субъединицы aIF2, которая может работать как переключатель во время гидролиза ГТФ [67]. В результате изменения конформации этой петли растворитель (молекулы воды) получает доступ к γ-фосфату ГТФ. Главным привратником на пути к γ-фосфату ГТФ является Met45. Интересно, что у эукариотической γ-субъединицы eIF2 вместо Met45 расположена более крупная аминокислота – изолейцин, и для открытия “ворот” требуется приложить усилия, чтобы не встретить стерические препятствия, что приводит к необходимости использовать белковый фактор eIF5, индуцирующий гидролиз ГТФ. А у фактора элонгации трансляции EF-Tu и вовсе отсутствует эта петля. В совокупности эти и изложенные выше данные лишний раз указывают на вероятность отсутствия ГТФаза-активирующего фактора у архей и спонтанного гидролиза ГТФ у фактора aIF2.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Накопленный в Институте белка РАН опыт структурно-функциональных исследований РНК-белковых комплексов в рамках “рибосомного проекта” успешно использован при выполнении ряда исследований принципов регуляции трансляции и транскрипции функционально важными объектами. Среди них исследование авторегуляции трансляции универсально-консервативного рибосомного белка L1 в бактериях и археях, регулятора трансляции Hfq и его архейных гомологов, регуляторов транскрипции UxuR и ExuR, исследование дополнительной функции глицил-тРНК-синтетазы человека, изучение гетеротримерного фактора инициации трансляции IF2.

В обзоре кратко представлены результаты проведенных исследований. На молекулярном уровне показана природа различного сродства рибосомного белка L1 к специфически узнаваемым участкам мРНК и рРНК, что позволяет регулировать трансляцию своего оперона по принципу обратной связи. Для белка Hfq выявлены структурные основы узнавания молекул РНК в функционально важном боковом РНК-связывающем участке белка. Исследованы РНК-связывающие свойства ряда архейных белков семейства Lsm и показаны существенные отличия их РНК-связывающих свойств по сравнению с бактериальным гомологом – белком Hfq. Получены структурные данные о взаимодействии глицил-тРНК-синтетазы с IRES вирусов. Проведены обширные комплексные исследования гетеротримерного фактора инициации трансляции IF2 архей и эукариот.

Особую благодарность авторы выражают родоначальникам структурно-функциональных исследований в Институте белка РАН – Марии Борисовне Гарбер, Станиславу Владимировичу Никонову и Наталии Александровне Невской.

Работа выполнена при поддержке следующих фондов: проект “Регуляторные комплексы рибосомного белка L1 с мРНК” – Российский фонд фундаментальных исследований (РФФИ) (гранты № 03-04-48327, 04-04-49634, 05-04-48338, INTAS YSF № 04-83-3842); проект “Исследования РНК-связывающих свойств белка Hfq” – РФФИ (гранты № 04-04-48556, 07-04-00296, 13-04-00783); проект “Исследования РНК-связывающих свойств архейных Lsm белков” – Российский научный фонд (РНФ) (грант № 14-14-00496), РФФИ (грант № 18-04-00222); проект “Исследование функции регуляторов транскрипции UxuR и ExuR” – РНФ (грант № 18-14-00322); проект “Структурные и функциональные исследования глицил-тРНК-синтетазы человека” – РНФ (грант № 15-14-00028), РФФИ (грант № 19-34-90135); проект “Структурные исследования гетеротримерного фактора инициации трансляции IF2” – РФФИ (грант № 18-04-01331).