Кристаллография, 2022, T. 67, № 4, стр. 632-635

ВВЕДЕНИЕ

Структура комплекса цитохрома С (Цит c) с липидным бислоем изучается давно вследствие ее важности для понимания механизмов апоптоза. Первая гипотеза о структуре такого комплекса была высказана в 1977 г. [1] и заключалась в том, что комплекс представляет собой молекулу Цит c и прилегающий участок липидного бислоя мембраны. Эта гипотеза в дальнейшем развивалась и использовалась в ряде работ [2–5]. Вначале Цит c присоединяется к отрицательным фосфатным группам на поверхности мембраны, содержащей кардиолипин, благодаря электростатическому взаимодействию с лизиновыми аминокислотными остатками [1, 5–8]. Существуют три сайта на поверхности Цит c, в основном представленные аминокислотными остатками лизина [8–11]. Эти сайты получили названия A, С и L. Сайт A включает в себя остатки Lys72, Lys73, Lys86 и Lys87, сайт C состоит из одного остатка аминокислоты – Asn52, а сайт L включает в себя аминокислотные остатки Lys22, Lys25, Lys27, His26 и His33. Сайты А и L взаимодействуют с липидными структурами в основном через электростатические взаимодействия, в то время как сайт C делает это через водородные связи [2].

До последнего времени многие авторы, рассматривающие свойства комплекса Цит c с кардиолипином, считали, что белок не проникает в глубину липидного бислоя мембран, а в лучшем случае лишь прогибает мембрану, а прочность связи обусловлена [1] “заякореванием” белка путем проникновения в его толщу одной или двух жирнокислотных цепей. При этом изменения конформации все же должны происходить, так как иначе не появится ферментативная активность. Согласно [12] изменения конформации значительнее: Цит c распластывается на поверхности липидного слоя мембраны.

В [13] на основании данных, полученных с помощью исследования методом малоуглового рассеяния осадка, состоящего из комплекса Цит c с кардиолипином, предложили совершенно другую схему строения комплекса, в соответствии с которой молекула Цит c в состоянии расплавленной глобулы находится в центре наносферы и окружена монослоем из молекул кардиолипина. Предложенная структура наносферы подразумевает возможность ее проникновения в липидный бислой клеточных и митохондриальных мембран благодаря своей гидрофобной поверхности, образуя “вздутие” на мембране [14]. Предположение сделано на основании данных, полученных на модельных системах кристаллических осадков и ленгмюровских монослоев комплекса Цит c и кардиолипина [14].

В настоящей работе методом молекулярной динамики (МД) получена модель процесса формирования наносферы на молекулярном уровне.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Построение начальной системы. Начальная модель системы, включающая в себя липидный би-слой и молекулу Цит с, была построена с использованием программных пакетов PackMol [15] и AmberTools19 [16], после чего преобразована в формат GROMACS [17] с использованием программы ACPYPE [18]. Для построения топологии гема применяли параметры, полученные в [19]. Для моделирования использовали силовое поле amber14sb [20]. В качестве молекул липидов были взяты 256 молекул тетраолеилкардиолипина.

МД-моделирование. Моделирование проводили с помощью программы GROMACS 2020.3 [17]. В качестве силового поля выбрано поле ff14SB [20], так как в нем существенно улучшена точность моделирования боковых цепей аминокислотных остатков по сравнению с ff99SB [20]. В качестве модели воды выбрана модель TIP3P, как наиболее подходящая для использования с силовым полем ff14SB. Ячейку заполняли молекулами воды. Кроме того, в систему добавляли 0.15 М KCl, а также несколько ионов К для уравновешивания заряда системы. На первом этапе проводили минимизацию энергии с шагом 1 фс до максимальной силы 1000.0 кДж/моль^–1 нм^–1. Далее система была уравновешена при температуре 310 K и давлении 1 атм путем моделирования в NVT и NTP (100 пс в каждом) соответственно. Температуру и давление в системе контролировали с использованием модифицированного термостата Берендсена [21] и баростата Паринелло–Рахмана [22] с временными константами tau_t = 0.1 пс и tau_p = = 2 пс соответственно. Расчет продуктивной МД проводили в изотермо-изобарическом ансамбле с шагом в 2 фс. Алгоритм LINCS [23] использовали для ограничения связей с участием атомов водорода. Дальнодействующие электростатические взаимодействия рассчитывали с использованием схемы суммирования по Эвальду [24]. Радиусы действия сил Ван-дер-Ваальса и кулоновских взаимодействий были усечены до 1.4 нм, что является наиболее оптимальным для используемого силового поля [20].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Получена динамическая модель взаимодействия Цит c из сердца лошади и бислоя, состоящего из молекул тетраолеилкардиолипина (рис. 1). Первая стадия (рис. 1а) заключается в приближении глобулы Цит c к данному бислою. Вторая стадия (рис. 1б) представляет собой присоединение посредством электростатических взаимодействий одного из лизиновых кластеров Цит c к бислою. Далее (рис. 1в) происходит погружение молекулы Цит c в бислой из тетраолеилкардиолипина, что сопровождается конформационными изменениями как в молекуле Цит c, так и в би-слое. На рис. 1г изображен комплекс Цит c с тетраолеилкардиолипином в равновесном состоянии. Отметим, что после приближения молекулы Цит c к бислою на расстояние ∼4 Å весь дальнейший процесс погружения происходит относительно быстро и занимает ∼11 нс.

Рис. 1.

Стадии погружения молекулы Цит c из сердца лошади в бислой, состоящий из тетраолеилкардиолипина. Над бислоем изображена вторичная структура молекулы Цит с, она выделена овалом.

Молекула Цит c при взаимодействии с бислоем тетраолеилкардиолипина претерпевает конформационные изменения: происходит разрыв координационной связи между метионином-80 и железом гема (рис. 2). По-видимому, произошел переход молекулы Цит c в состояние “расплавленной глобулы” [25].

Рис. 2.

Наложение кристаллической структуры Цит c из сердца лошади (PDB ID: 1hrc) на структуру Цит c в комплексе с монослоем тетраолеилкардиолипина, полученную методом молекулярной динамики. На рисунке показаны участки альфа-спиралей интактного Цит с, а также Цит с в комплексе с бислоем тетраолеилкардиолипина. Гем изображен тонкими линиями и его координаты совпадают для двух наложенных структур Цит с. Железо гема отмечено буквами FE. Метионины в 80-м положении (MET-80) полипептидной цепи Цит с изображены палочками, правый из них относится к интактному цит с, а левый – к структуре цит с в комлексе с бислоем тетраолеилкардиолипина. Наложение проводилось программой PyMol по C-alpha атомам Цит c.

Полученные результаты позволяют окончательно завершить затянувшуюся дискуссию о структуре данного комплекса, является он мембрано-связанным Цит c или наносферой, встроенной в липидный бислой, в пользу последнего предположения [13, 25–27]. Однако оно было существенно конкретизировано и в известной степени изменено. В данной гипотезе предполагалось, что заранее сформированная наносфера Цит c–кардиолипин не совсем понятным образом оказывается внутри жидкого и гидрофобного липидного слоя мембраны, так что на обеих поверхностях мембраны образуется пузырь (так называемый bubble). Сам липидный бислой при этом как бы расщепляется на два [26]. Оказалось, что образование наносферы не предшествовало ее внедрению в липидный бислой, как предполагалось ранее, а произошло в момент самого внедрения благодаря тому, что фрагменты молекулы белка диффундировали сквозь цепочки фосфолипидных молекул. Вращательная подвижность участков полипептидной цепи и боковых групп аминокислотных остатков Цит c придает белковой глобуле свойства, характерные не для твердого тела, а для капли жидкости. Эта жидкая капля, не смешиваясь с липидным бислоем, тоже жидким, внедряется внутрь участка мембраны и остается там после установления окончательной стабильной структуры комплекса Цит c-кардиолипин. Таким образом, с использованием метода МД подтверждена сформулированная ранее гипотеза наносферы, а также построена модель такой наносферы на молекулярном уровне.

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант № 19-14-00244) в части моделирования молекулярной динамики и при поддержке Министерства науки и высшего образования в рамках выполнения работ по Государственному заданию ФНИЦ “Кристаллография и фотоника” РАН в части анализа результатов молекулярного моделирования.