Кристаллография, 2022, T. 67, № 6, стр. 930-934

ВВЕДЕНИЕ

Цитохром С (Цит с) – это небольшой белок, содержащий в своем составе гем С [1, 2]. Цит c имеет две функции: является участником дыхательной цепи [3], а также одним из активаторов апоптоза – запрограммированной клеточной гибели. Известно, что взаимодействие Цит c с кластерами кардиолипина в составе внутренней мембраны митохондрий является одной из ключевых стадий процесса апоптоза [4–7]. В [8, 9] показано, что молекулы кардиолипина образуют комплекс с Цит c, а также высказывались предположения о строении данного комплекса [10, 11], однако на молекулярном уровне данный комплекс описан не был. Вместе с тем такой комплекс гидрофобен и способен катализировать реакции образования свободных радикалов как в водной среде, так и в гидрофобном окружении. Этот процесс приводит к пероксидации липидов мембран митохондрий, что приводит к запуску каскада реакций апоптоза и гибели клеток [12, 13]. Было показано, что при действии комплекса Цит c–кардиолипин на культуры раковых клеток активируется апоптоз и гибнут клетки, в том числе резистентные к обычным противораковым препаратам [14]. В настоящее время в связи с развитием компьютерной техники, а также все большей доступностью суперкомпьютеров метод молекулярной динамики (МД) можно использовать для изучения достаточно больших систем, таких как белок-белковые комплексы и комплексы белков с билипидными мембранами на молекулярном уровне [15–17]. Имеются также работы по молекулярному моделированию ионного тока через ионные каналы, которые представляют собой трансмембранные белки или белковые комплексы [18]. Чтобы определить на молекулярном уровне структуру комплекса Цит c с кардиолипином, в настоящей работе исследована молекулярная динамика Цит c, помещенного в водное окружение с добавлением молекул кардиолипина. Описаны динамика формирования и свойства комплекса Цит c–кардиолипин.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Построение начальной модели системы проведено с использованием программных пакетов PackMol [19] и AmberTools19 [20]. Для построения топологии гема использовали параметры, полученные в [21].

Моделирование МД проводили с помощью программы Amber18 [20]. В качестве силового выбрано поле ff14SB [22]. В качестве модели воды выбрана модель TIP3P, как наиболее подходящая для использования с силовым полем ff14SB. В систему добавили 0.15 М KCl, а также несколько ионов для нейтрализации заряда системы. Для релаксации структуры и избежания стерических клэшей выполнили минимизацию потенциальной энергии. Давление и температура в системе были уравновешены до 1 атм и 310 K путем запуска моделирования с ограничениями в NVT- и NPT-ансамблях (шесть этапов, 25–50 пс). После этого ограничение на подвижность атомов было снято, и уравновешивание продолжалось еще 2 нс. Давление и температуру в системе контролировали с использованием термостата Берендсена [23] и баростата Паринелло–Рахмана [24]. Продуктивное 90 нс моделирование МД для каждой из систем проводили в изотермо-изобарическом ансамбле с шагом в 2 фс. Ван-дер-ваальсовы и кулоновские взаимодействия были усечены до 1.4 нм, что является наиболее оптимальным для используемого силового поля [22].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Первоначальный анализ траекторий включал в себя расчет зависимости среднеквадратичного отклонения радиуса инерции молекулы Цит c (рис. 1) и среднеквадратичных смещений (RMSF) Cα-атомов Цит c (рис. 2). Рисунок 1 показывает, что радиус инерции существенно не изменяется в процессе моделирования, что говорит о том, что молекула Цит c не меняет свою компактность на промоделированной траектории. Рисунок 2 показывает, что молекула Цит c весьма подвижна на участке, представленном аминокислотными остатками 20–30, и стабильна на остальных участках. Участок 20–30 представляет собой неупорядоченную петлю, не включающую в себя в отличие от других неупорядоченных петель в составе молекулы Цит c аминокислотных остатков, связанных с железом гема координационными связями. Вероятно, с этим связана подвижность данной петли.

Рис. 1.

График зависимости радиуса инерции молекулы Цит c от времени.

Рис. 2.

Среднеквадратичные флуктуации Cα-атомов (RMSF) молекулы Цит c.

В [25] показано, что в определенных условиях Цит c может менять свою конформацию, переходя в состояние так называемой “расплавленной глобулы”. Кроме того, присутствие в растворе кардиолипина может служить фактором перехода молекулы цитохрома в состояние расплавленной глобулы [26]. Переход Цит c в состояние расплавленной глобулы связывают с аксиальными аминокислотными остатками, координирующими железо гема [27]. В Цит c из сердца лошади координация гема осуществляется Met-80. На рис. 3 изображен график зависимости расстояния между серой Met-80 и железа гема от времени. Интересно, что, хотя окончательного разрыва координационной связи не происходит, расстояние между серой Met-80 и атомом железа гема колеблется в широком диапазоне, достигая на 47-й нс моделирования 4.8 А. Это может свидетельствовать о начале перехода молекулы Цит c в состояние расплавленной глобулы.

Рис. 3.

График зависимости расстояния между железом гема и атомом серы метионина 80 в молекуле Цит c от времени.

Динамику формирования комплекса Цит c–кардиолипин можно условно разбить на четыре стадии. Изначально (рис. 4а) молекула цитохрома окружена липидами в произвольном порядке, однако через 3.6 нс (рис. 4б) уже заметны сформированные из молекул липида структуры. Видно, что большинство молекул липида находится около молекулы цитохрома, однако структура, которую они формируют, нестабильна и неоднородна. Также заметны пять небольших структур липидов от одной до восьми молекул кардиолипина в каждой. Самая большая из них содержит восемь молекул липида, еще одна – три, а остальные по одному. Молекулы липида, находящиеся около цитохрома, еще не сформировали энергетически выгодную структуру, о чем свидетельствует тот факт, что полярные головки липидов иногда расположены внутри липидной мицеллы. Начиная с 40 нс (рис. 4в) основная структура из липидов немного изменяется, она становится более плоской по сравнению со структурой, рассмотренной ранее. Также все полярные головки липидов с этого момента расположены снаружи мицеллы. Количество небольших структур липидов уменьшилось с пяти до четырех, самая большая из них все еще состоит из восьми липидов. Начиная с 54-й нс (рис. 4г) основная липидная мицелла стабилизировалась в комплексе с молекулой цитохрома. Кроме того, структура, состоящая из восьми липидов, прикрепилась к цитохрому с противоположной от основной липидной мицеллы стороны. Отметим, что молекула Цит c не претерпевает существенных конформационных изменений (рис. 5).

Рис. 4.

Моделируемая система в начальном состоянии (а), на 3.6 (б), 40 (в) и на 54 нс (г). Сферами изображена молекула Цит c, линиями – молекулы кардиолипина.

Рис. 5.

Сравнение конформации молекулы Цит c в начальном состоянии, на 10, 30, 60 и 90-й нс. Красным отмечена подвижная петля 20–30. Сферами показаны гемы.

В [28, 29] высказано предположение, что молекулы кардиолипина взаимодействуют с молекулой Цит c из сердца лошади преимущественно за счет лизиновых кластеров на поверхности молекулы цитохрома. В настоящей работе показано, что молекулы кардиолипина взаимодействуют со следующими положительно заряженными аминокислотными остатками на поверхности цитохрома: Lys7, Lys8, Lys22, Lys25, Lys27, Arg38, Lys53, Lys55, Lys72, Lys73, Lys79, Lys86, Lys87 и Arg91, что соответствует ранее выдвинутым предположениям, а также показывает важность аргининов во взаимодействии молекулы Цит c с кардиолипином.

Данное исследование необходимо не только для расшифровки механизма процесса, важнейшего для жизни клеток и организма в целом, но может иметь и непосредственное практическое значение для медицины. Известно, что действие существующих противораковых лекарственных средств основано главным образом на стимуляции апоптоза или ферроптоза в раковых клетках. В [14] продемонстрирована способность каталитически реакционноспособного комплекса Цит c с кардиолипином индуцировать апоптоз и убивать раковые клетки в культуре. Было показано, что комплекс Цит c с кардиолипином продуцирует липопероксидные радикалы в двух реакциях: путем разложения липидных гидропероксидов и перекисного окисления липидов под действием перекиси водорода. Антиоксиданты ингибировали образование липидных радикалов. Именно комплекс Цит c с кардиолипином, а не сам Цит c резко повышал уровень апоптоза и гибель клеток в двух клеточных линиях: чувствительных к лекарственным средствам (A2780) и доксорубицин-резистентным (A2780-Adr) клеткам [14]. Поскольку комплексы ферментов с липидами являются составными элементами клеток млекопитающих, то воздействие этих комплексов или их аналогов на раковые (или бактериальные) клетки может стать способом создания лекарственных препаратов, к которым у чужеродных клеток или микроорганизмов не вырабатываются механизмы защиты.

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект № 19-14-00244) в части моделирования МД и при поддержке Министерства науки и высшего образования РФ в рамках выполнения работ по Государственному заданию ФНИЦ “Кристаллография и фотоника” РАН в части анализа результатов молекулярного моделирования.