Кристаллография, 2022, T. 67, № 6, стр. 924-929

ВВЕДЕНИЕ

Церулоплазмин (ЦП, ферро:O₂-оксидоредуктаза, КФ 1.16.3.1) является полифункциональной медьсодержащей оксидазой. Важное физиологическое значение имеет ферроксидазная активность ЦП. Фермент катализирует окисление иона Fe²⁺ до Fe³⁺ и обеспечивает встраивание Fe³⁺ в апо-трансферрины, участвуя таким образом в метаболизме железа [1]. ЦП окисляет четыре иона Fe²⁺ и осуществляет четырехэлектронный перенос на кислород с образованием воды, препятствуя неферментативной реакции окисления железа, ведущей к появлению свободных радикалов, что делает его природным антиоксидантом. ЦП обладает также активностью супероксиддисмутазы [2] и глутатион-зависимой пероксидазы [3]. ЦП образует комплексы с белками лейкоцитов: пероксидазой эозинофилов, лактоферрином, прооксидантным ферментом нейтрофилов и моноцитов – миелоперксидазой (МПО). ЦП относят к физиологическим ингибиторам МПО [4]. ЦП также подавляет активность фактора ингибирования миграции макрофагов благодаря контактам вблизи активного центра при их взаимодействии [5].

Кристаллическая структура ЦП впервые была решена в 1996 г. с разрешением 3.1 Å [6]. ЦП представляет собой мономер, а при повышенной концентрации ионов меди ЦП может образовывать димеры [7]. Мономер состоит из шести доменов, с которыми неравномерно, но прочно связаны шесть ионов меди. Во втором, четвертом и шестом доменах расположены гомологичные одноядерные центры связывания меди, трехъядерный центр расположен между первым и шестым доменами. Кроме этого, были обнаружены еще два лабильных сайта связывания металлов, из которых в нативном ЦП заселена лишь половина [8]. По гипотезе, высказанной в [9], эти сайты играют важную роль в окислении железа. Банк белковых данных (Protein Data Bank, PDB) содержит три структуры ЦП человека, относящиеся к тригональной сингонии (P3₂21) с разрешением от 3.1 до 2.6 Å [6, 9, 10]. В 2008 г. была получена орторомбическая пространственная группа в условиях кристаллизации, аналогичных тем, что позволяли получить кристаллы тригональной сингонии [11]. Влияние на кристаллическую упаковку, вероятно, оказали ионы Ni²⁺, использовавшиеся при выделении белка и связавшиеся в лабильных центрах связывания ионов меди. Позднее была продемонстрирована зависимость кристаллической упаковки ЦП крысы (имеющего высокую гомологию с ЦП человека) от кристаллизационных условий [12].

Чувствительность ЦП к протеолитической деградации затрудняет получение кристаллов высокого дифракционного качества. В известных кристаллических структурах ЦП человека отсутствует электронная плотность для двух из трех междоменных петель, содержащих консервативные сайты протеолиза, одна из которых соответствует участку а.о. 885–890. Выделение недеградированного и стабильного ЦП остается непростой задачей. В препаратах ЦП присутствуют примеси протеиназ [13–15], что делает необходимым использование смеси протеиназных ингибиторов на всех стадиях выделения ЦП [16].

Существуют три консервативных сайта протеолиза ЦП: R481/S482, R701/Q702, K887/V888 [13] (рис. 1). Согласно [17] замена этих аминокислотных остатков в рекомбинантном ЦП с помощью сайт-направленного мутагенеза позволяет получить белок, устойчивый к протеолизу. Отсутствие протеолитической деградации по K887 важно для ингибирования церулоплазмином белка нейтрофилов МПО при образовании комплекса [10].

Рис. 1.

Общая структура ЦП. Аминокислотные остатки, относящиеся к консервативным сайтам протеолиза, показаны стиками (верхняя панель – петля, содержащая R481, смоделирована) и обозначены стрелками на схеме доменной структуры ЦП.

В настоящей работе получена новая, моноклинная кристаллической модификации ЦП и описаны ее особенности. Обсуждается конформация функциональной петли 885–890 между пятым и шестым доменами, пространственная структура которой установлена впервые благодаря использованию для кристаллизации недеградированного ЦП.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение и очистка ЦП. Для получения препарата мономерного ЦП с A₆₁₀/A₂₈₀ > 0.049 плазму крови с добавлением 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты и 0.1 мМ фенилметилсульфонилфторида подвергали анионообменной хроматографии на UNOsphere Q и неомицин-агарозе [18]. Для гарантированного удаления следов тромбина препарат ЦП фильтровали через колонку с бензамидин-агарозой. ЦП концентрировали до 80 мг/мл с помощью центрифужной ячейки Vivaspin 20 (для M > 100 кДа), трижды заменяя буферный раствор (0.1 M Hepes-NaOH, рН 7.5).

Кристаллизация и сбор дифракционных данных. Кристаллы ЦП получали при 4°C методом диффузии паров. Кристаллизационный раствор содержал 3–7% PEG 3350, 20 мМ MgCl₂ и 50 мМ Tris-буфера, рН 7.5. Кристаллы голубого цвета в виде тонких пластин размером 0.08–0.2 мм появлялись через 3–5 дней. В качестве криопротектора использовали 20% глицерина. Сбор дифракционных данных проводили на станции синхротронного излучения BL41XU, SPring-8 (Япония) при температуре 100 К с использованием детектора PILATUS 6M. Для обработки данных использовали программы DENZO, SCALEPACK [19]. Характеристики дифракционного набора приведены в табл. 1.

Решение и уточнение структуры. Структура решена методом молекулярного замещения с использованием программы MOLREP [20]. В качестве начальной модели использовали структуру ЦП (ID PDB: 4ENZ), решенную с разрешением 2.6 Å [10]. Уточнение выполнено с использованием программы REFMAC [21] и графической программы СOOT [22]. Финальный R‑фактор/R_free-фактор составил 21.49/32.6%. Согласно карте Рамачандрана в наиболее благоприятных областях находятся 86.6/87.1% аминокислотных остатков (а.о.), в дополнительно разрешенных – 12.8/12.2%, в основных – 0.5/0.6%, в запрещенных – лишь 0.1/0.1% а.о. Характеристики решенной и уточненной пространственной структуры приведены в табл. 1.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Найдены новые кристаллизационные условия для ЦП, в которых белок впервые был закристаллизован в пр. гр. I2. Коэффициент Мэтьюса для моноклинной кристаллической упаковки составляет 2.59 ų/Да, что соответствует содержанию растворителя 52.57%. Для сравнения содержание растворителя для тригональной упаковке составляет ∼70% при коэффициенте Мэтьюса 4.23 [11].

Обычно меньшее содержание растворителя в кристаллической ячейке позволяет получить лучшее разрешение дифракционных данных от кристалла белка [23]. Наиболее высокое пространственное разрешение было получено для орторомбической формы ЦП крысы с содержанием растворителя в кристаллической ячейке 51.71% (коэффициент Мэтьюса 2.55 ų/Да). Несмотря на сходное значение коэффициента Мэтьюса разрешение структуры моноклинной формы ЦП человека значительно хуже. Однако в данном случае, вероятно, сыграли роль меньший размер кристалла и его форма в виде тонкой пластины. Также кристалл обладал высокой мозаичностью, составлявшей 1.54°.

В кристалле имеются каналы вдоль короткой оси диаметром ∼30 Å и извилистые каналы с полостями диаметром ∼40 Å вдоль оси а. Они уже каналов тригональной кристаллической упаковки, которые по форме напоминают треугольник и имеют сечение ∼110 × 110 × 110 Å (рис. 2).

Рис. 2.

Кристаллические упаковки ЦП: а – тригональная, б – моноклинная.

Благодаря упаковке молекул в кристалле подвижная петля между пятым и шестым доменами, содержащая сайт протеолиза, находится вблизи симметричной молекулы (рис. 3). Впервые в истории структурных исследований ЦП, несмотря на невысокое разрешение, для этой петли присутствует электронная плотность, позволяющая определить позиции Сα-атомов участка 884–892. Несмотря на отсутствие близких контактов с симметричной молекулой, атом О Lys 887 находится на расстоянии 2.94 Å от атома O 721 Gly симметричной молекулы, что может указывать на то, что эти атомы образуют водородную связь. Учитывая, что именно пептидная связь 887 лизина является сайтом протеолиза, это взаимодействие имеет, по-видимому, важное значение для стабилизации конформации петли. Также это еще раз подтверждает, что протокол, разработанный в [18], позволяет получать недеградированный ЦП. Исследования комплекса ЦП с МПО показали, что протеолизованный ЦП образует комплекс, но не ингибирует хлорирующую активность МПО [10]. Структура комплекса ЦП с МПО определена методами малоуглового рентгеновского рассеяния в растворе и рентгеноструктурного анализа с низким разрешением, не позволяющим увидеть тонкие детали структуры. В структуре также не наблюдалось электронной плотности для атомов а. о. петли 884–892, ее конформация была смоделирована [10]. Пространственное совмещение структуры молекулы ЦП, полученной в настоящей работе, и ЦП в кристаллической структуре комплекса ЦП с МПО показало, что позиция симметричной молекулы ЦП в моноклинной сингонии сходна с позицией мономера МПО (рис. 4). Конформация петли в моноклинном ЦП естественно не может точно соответствовать конформации этой петли в комплексе. Однако она расположена близко от входа в гемовый карман МПО. Можно с осторожностью предположить, что боковая цепь Tyr885, обращенная в сторону гемового кармана МПО, может участвовать в контакте ЦП с МПО и ингибировании миелопероксидазы церулоплазмином.

Рис. 3.

Фрагмент карты электронной плотности 2Fo-Fc для петли 884–892. Уровень срезки 1σ. Светлым показана структура симметричной молекулы.

Рис. 4.

Сравнение конформаций петли 882–894 в ЦП (пр. гр. I2) (показана стиками: атомы углерода показаны зеленым, кислорода – красным, азота – синим) и в комплексе ЦП–МПО (красный). Структуры наложены по Сα-атомам ЦП. Для наглядности ЦП моноклинной формы не показан, за исключением петли 882–894. Y885 показан темно-голубым, ЦП комплекса ЦП–МПО – синим. Тяжелая цепь МПО изображена желтым, легкая – розовым. Симметричная молекула ЦП моноклинной кристаллической упаковки показана темно-зеленым (ход полипептидной цепи). Гем МПО показан темно-оранжевым.

Работа выполнена в рамках Федеральной космической программы 2016–2025 гг. (ОКР “МКС (Наука)”) в части сбора набора дифракционных данных и программы деятельности НИЦ Курчатовский Институт (приказ № 2756 от 28.10.2021 г.) в части кристаллизации, решения, уточнения и анализа структуры белка.