Микробиология, 2019, T. 88, № 1, стр. 116-119

Перфторкарбоновые кислоты внесены в Приложение В Стокгольмской конвенции по стойким органическим загрязняющим веществам, что предусматривает принятие мер по минимизации и, по возможности, прекращению их производства и использования, с последующим уничтожением (Report…, 2009). Основные значимые представители этого класса соединений – перфтороктановая кислота (ПФОК) и перфтороктансульфонат (ПФОС) ‒ это высокостабильные синтетические химические соединения, широко используемые в производстве фторполимеров, пестицидов и, вследствие их поверхностно-активных свойств, в качестве компонентов противопожарных пен. ПФОК и ПФОС крайне устойчивы к биоразложению и детектируются во многих объектах окружающей среды и живых организмах (Yamashita et al., 2005; Tao et al., 2006; Betts, 2007; Anderson et al., 2008). В настоящее время в литературе имеются лишь единичные сообщения об утилизации ПФОК и ПФОС бактериями рода Pseudomonas без раскрытия особенностей биодеструкции (Kwon et al., 2014; Yi et al., 2016), хотя представители других типов фторорганических соединений, такие как фторбензол, перфторбифенилы и пр. биодеградабельны (Carvalho et al., 2005; Hughes et al., 2011; Amorim et al., 2013).

В настоящей работе представлены результаты исследования физиолого-биохимических свойств и таксономического положения штамма Ensifer adhaerens M1, обладающего уникальной способностью к использованию ПФОК и ПФОС в качестве единственного источника углерода и энергии.

Штамм E. adhaerens M1 был выделен из почвы, отобранной с территории хранения и испытания средств тушения пожаров (Мальдивская Республика), методом накопительной культуры. При выделении бактерий в качестве единственного источника углерода и энергии использовали ПФОС (1.0 г/л). Чистую культуру культивировали с использованием минеральной среды Раймонда (Raymond, 1961) с ПФОК или ПФОС (1.0 г/л) при 26°С и 160 об./мин. Рост штамма оценивали по оптической плотности (ОП₅₉₀) клеточной суспензии на спектрофотометре СФ-56 (Россия).

Характеристику чистой культуры проводили по культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам, используя общепринятые руководства (Методы …, 1984, Определитель …, 1997). Выделение и очистку ДНК, определение молярного % Г + Ц, амплификацию, секвенирование гена 16S рРНК, филогенетический анализ осуществляли общепринятыми методами. Определенная для штамма E. adhaerens M1 последовательность фрагмента гена длиной 1319 пар нуклеотидов депонирована в GenBank под номером MH141439.

Оценивали содержание ПФОК и ПФОС в среде и идентифицировали продукты их биотрансформации на жидкостном тандемном хромато-масс-спектрометре LCMS-IT-TOF (“Shimadzu”, Япония) в ЦКП “БиоАналит” УИБ УФИЦ РАН в ультрафильтратах (≤3 кДа) культуральных жидкостей (КЖ). Хроматографическое разделение проводили в изократическом режиме на колонке Shim-pak XR-ODS (75 × 2.0 мм) (“Shimadzu”, Япония) при соотношении растворителей 5 мM ацетат аммония в воде‒ацетонитрил = 56 : 44; скорость элюирования 0.2 мл/мин. Концентрацию фторид-иона в среде измеряли при помощи фторид-селективного электрода ЭЛИС-131F (Россия).

Клетки штамма M1 – грамотрицательные подвижные палочки размером 0.7‒1.0 × 1.0‒2.0 мкм; имеют пучок жгутиков, неспорообразующие. На МПА колонии бело-кремовые, круглые, выпуклые, прозрачные, слизистые, диаметром 2‒3 мм. Метаболизм дыхательный. Штамм M1 – каталазо- и оксидазоположительный, восстанавливал нитрат и нитрит, не гидролизовал казеин, крахмал. Культура росла при температуре 10‒37°С (оптимум 26‒28°С), рН 6.0‒8.0 и концентрации NaCl до 2%.

Культура использовала в качестве единственного источника углерода D-глюкозу, лактозу, мальтозу, сахарозу, маннит, сорбит, D-арабинозу, D-ксилозу, D-маннозу, D-галактозу, D-рамнозу, сукцинат, малат, цитрат, 2-кетоглюконат, L-аланин, L-аспарагин, L-глутамин, L-глутаминовую кислоту.

Филогенетически выявлена принадлежность штамма M1 к виду Ensifer adhaerens, уровень сходства гена 16S рРНК с типовым штаммом E. adhaerens LMG 20216 составил 99.85%. Содержание Г + Ц в ДНК 62.2 мол. % ‒ типичное для бактерий данного вида.

Штамм M1 активно рос на минеральных средах, содержащих в качестве единственного источника углерода перфторкарбоновые кислоты (рисунок 1), достигая максимального показателя оптической плотности КЖ через 4 сут при культивировании на ПФОС с его полной трансформацией за 6 сут и через 3 сут выращивания на ПФОК с его разложением за 4 сут. Конверсия перфторированных субстратов сопровождалась выходом в среду свободных ионов фтора, а начало высвобождения коррелировало с началом линейного снижения их концентрации в среде.

Рис. 1.

Динамика роста (1) штамма Ensifer adhaerens M1 и изменения концентрации перфторкарбоновой кислоты (2) со схемой ее бактериальной деструкции (3) при культивировании в жидкой минеральной среде: а – с ПФОС; б – с ПФОК.

При хроматографическом анализе с масс-спектрометрией в исходной культуральной жидкости (КЖ) наблюдали диссоциированные кислотные ионы ПФОС и ПФОК (молекулярные ионы с отношением m/z 499 а.е.м. и 413 а.е.м. соответственно) характерные для анионных перфторсоединений. Через 1 сут в варианте с ПФОС детектировали наличие компонента, молекулярному иону которого соответствует m/z 419 а.е.м., что возможно в результате прохождения процесса монооксигеназного удаления из ПФОС сульфонатой группы (m/z 80 а.е.м.) в виде сульфита, который способен метаболизироваться в условиях голодания. Вероятно, с этим связана более низкая скорость роста на этом субстрате. Через 3 сут культивирования помимо компонентов с m/z 499 и 419 а.е.м. в ультрафильтрате обнаруживалось соединение, молекулярный ион которого имел соотношение m/z 363 а.е.м., отсутствовавшее первоначально в среде. В последующие сутки концентрация этого компонента в КЖ увеличивалась, а соединения с m/z 499 и 419 а.е.м. через 6 сут культивирования в среде не детектировались. Соединение с отношением m/z, равным 363 а.е.м., по масс-спектрам MS¹ и MS² идентифицировали как перфторгептановую кислоту с характерным прекурсор-ионом (m/z 363 а.е.м.) в масс-спектре MS¹, фрагментирующемся с образованием продукт-иона с m/z 319 а.е.м. в масс-спектре MS².

В варианте же с ПФОК через 1 сут обнаруживалось соединение, молекулярному иону которого соответствует m/z 369 а.е.м., что возможно в результате реакции элиминирования диоксида углерода (m/z 44 а.е.м.) из карбоксильной группы. В дальнейшем обнаруженное соединение полностью было трансформировано также в перфторгептановую кислоту.

Таким образом, в результате работы выделен и идентифицирован штамм Ensifer adhaerens M1, обладающий уникальной способностью использовать перфторкарбоновые кислоты, в частности, ПФОК и ПФОС, в качестве единственного источника углерода и энергии с образованием такого метаболита деградации, как перфторгептановая кислота, выделяя в среду свободные фторид-ионы, являющиеся индикатором частичной минерализации, и, возможно, оказывающие ингибирующий эффект на дальнейшую деструкцию промежуточных фторированных соединений.