Микробиология, 2019, T. 88, № 6, стр. 655-664
Анализ систем праймеров на ген 16S рРНК для профилирования термофильных микробных сообществ
А. Ю. Меркель a, *, И. Ю. Тарновецкий b, О. А. Подосокорская a, С. В. Тощаков a
a Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского, ФИЦ
“Фундаментальные основы биотехнологии” РАН
117312 Москва, Россия
b Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова
119991 Москва, Россия
* E-mail: alexandrmerkel@gmail.com
Поступила в редакцию 12.12.2018
После доработки 10.06.2019
Принята к публикации 02.07.2019
Аннотация
Термофильные микроорганизмы представляют особый интерес с точки зрения филогенетики и изучения эволюции прокариот, так как многие из них являются представителями глубоких филогенетических ветвей дерева жизни. Этим обстоятельством обусловлено то, что многие широко применяемые универсальные праймерные системы на ген 16S рРНК элиминируют из спектра детекции те или иные группы термофильных прокариот. В данной работе мы проанализировали известные на сегодняшний день системы праймеров на ген 16S рРНК с целью оценки их способности выявлять представителей глубоких филогенетических линий прокариот, содержащих термофильные микроорганизмы. Показано, что использование большинства из опубликованных систем праймеров может вести к элиминации тех или иных групп термофильных прокариот. На основании in silico анализа уже существующих систем праймеров была выбрана система праймеров на V3−V4 регион гена 16S рРНК, которая обладает минимизированным эффектом элиминации групп термофильных прокариот. При использовании высокопроизводительного секвенирования проведен анализ предложенной системы праймеров в сравнении с ранее опубликованными системами. В результате статистического анализа результатов секвенирования, основанного на подсчете индекса Шеннона и значения Chao1, показана высокая эффективность использования предложенной системы при анализе микробных сообществ высокотемпературных источников Камчатки.
За последние несколько лет благодаря технологии высокопроизводительного секвенирования и метагеномным подходам к исследованию микробных сообществ, а также успехам в культивировании микроорганизмов новых глубоких филогенетических линий, наши представления о филогенетическом разнообразии прокариот были значительно расширены (Mori et al., 2009; Parks et al., 2017; Sorokin et al., 2018). Одновременно с этим возрастает необходимость и востребованность модификации и улучшения имеющихся методов качественной и количественной оценки состава микробных сообществ с целью повышения их инклюзивности в отношении новых таксонов и филогенетических линий микроорганизмов.
На сегодняшний день стандартом высокоинформативного анализа состава микробных сообществ является метод профилирования по гену 16S рРНК с использованием технологий высокопроизводительного секвенирования (Caporaso et al., 2011). Главным преимуществом этого метода является возможность анализировать сотни образцов, получая при этом тысячи последовательностей для каждого образца, при относительно невысокой себестоимости самого анализа (de Muinck et al., 2017). Благодаря этому за последние годы было проведено огромное количество исследований состава как симбиотических, так и свободноживущих микробных сообществ (Hugerth, Andersson, 2017). Одним из главных недостатков данного метода является значительная обусловленность получаемых результатов выбором той или иной праймерной системы (Yang et al., 2016; Thijs et al., 2017; Peng et al., 2018). К сожалению, на сегодняшний день так и не удалось создать систему универсальных праймеров на ген 16S рРНК, которая бы позволяла с одинаковой эффективностью амплифицировать участки этого гена всех известных филогенетических линий прокариот.
Термофильные микроорганизмы и их сообщества вызывают живой интерес ученых на протяжении четырех последних десятилетий, что обусловлено несколькими причинами. Во-первых, ряд теорий основывается на предположении, что именно термальные места обитания стали местом зарождения жизни на нашей планете (Russell et al., 1988; Martin, Russell, 2003; Martin et al., 2008; Mulkidjanian et al., 2012). Во-вторых, многие экотопы, ассоциированные с геотермальной активностью, способны существовать независимо от энергии Солнца (McCollom, Shock 1997; Preiner et al., 2018). В-третьих, исследование термофильных микроорганизмов имеет важное практическое значение, поскольку они способны синтезировать термостабильные внеклеточные ферменты, ценные для биотехнологии (Dalmaso et al., 2015; Counts et al., 2017; Wohlgemuth et al., 2018). Наконец, ряд термофильных микроорганизмов представляют особый интерес для филогенетики и изучения эволюции прокариот, так как являются представителями глубоких филогенетических ветвей дерева жизни (Miroshnichenko, Bonch-Osmolovskaya, 2006; Takai, Nakamura, 2011; Weiss et al., 2017). Именно последним обстоятельством объясняется тот факт, что многие широко применяемые универсальные праймерные системы на ген 16S рРНК элиминируют ряд глубоких филогенетических групп термофильных прокариот.
Горячие источники Камчатки являются модельными объектами изучения термофильных микробных сообществ. Целью настоящего исследования было проанализировать известные на сегодняшний день системы праймеров на ген 16S рРНК для оценки их способности амплифицировать гены представителей глубоких филогенетических линий прокариот, содержащих термофильные микроорганизмы, на примере микробных сообществ горячих источников Камчатки.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования – три термофильные микробные сообщества, образцы которых были получены в ходе экспедиции в кальдеру Узон (Кроноцкий государственный заповедник, Камчатка) в 2015 году. Образцы были отобраны из горячих источников “Солнечный” (температура 52°С; pH 6.1; Eh –34 мВ), “Термофильный” (температура 67°С; pH 6.1; Eh –90 мВ) и “Извилистый” (температура 77°С; pH 5.85; Eh 20 мВ). Образцы отбирали в 50 мл стеклянные флаконы с газонепроницаемыми пробками, которые были затем герметично запечатаны и транспортированы в лабораторию при температуре окружающей среды. Кроме того, в некоторых экспериментах использовали образец человеческого кала как пример мезофильного микробного сообщества.
Секвенирование библиотек 16S рРНК. ДНК из образцов выделяли по ранее описанной методике (Lever et al., 2015). Приготовление библиотек фрагментов 16S рРНК осуществляли путем одного раунда амплификации согласно методике Fadrosh et al. (2014). В качестве последовательностей, фланкирующих V3−V4 гипервариабельный участок гена 16S рРНК, были использованы участки отжига праймеров Pro-341F–Pro-805R (Takahashi et al., 2014). Помимо праймеров Pro-341F–Pro-805R проводили анализ эффективности профилирования для пары праймеров 341F (Frey et al., 2016) и Pro-mod-805R (эта работа), а также I‑341F–Pro-mod-I-805R. В качестве последовательностей, фланкирующих только V4 гипервариабельный участок гена 16S рРНК, использовали участки отжига праймеров UNIV-515F–UNIV-806R (Caporaso et al., 2012). Для постановки ПЦР использовали 5× Taq Red buffer и HS Taq полимеразу (“Евроген”, Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. Конечная концентрация праймеров во всех случаях была 1 мкМ. Конечный объем реакции составлял 30 мкл. Каждый образец ДНК был амплифицирован в трех повторностях. Затем повторности объединяли и визуализировали в 2% агарозном геле при длине волны 470 нм. Нужную полосу ДНК вырезали и очищали при помощи набора Standard Cleanup Gel Extraction Kit (“Евроген”, Россия). Концентрацию ДНК определяли на флуориметре Qubit® 2.0 c набором реагентов HS Assay Kit (“Life Technologies”, США). Перед секвенированием библиотеки эквимолярно смешивали и разводили полученный раствор ДНК до 4 нМ. Дальнейшую денатурацию пула библиотек и подготовку к секвенированию проводили согласно стандартному протоколу Illumina Sample Preparation Guide на платформе MiSeq с использованием набора MiSeq Reagent Kit v3 (600 циклов) (“Illumina”, США). Первичная обработка данных, формирование ОТЕ-таблицы, анализ таксономического состава и альфа-метрик разнообразия были проведены с помощью QIIME (версия 1.9.1; Caporaso et al., 2010) и сервиса SILVA online data analysis service (Quast et al., 2013). Все полученные данные секвенирования депонированы в NCBI BioProject PRJNA546132.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Выбор региона гена 16S рРНК для разработки универсальных праймеров. На первом этапе работы нами in silico были проанализированы 85 уникальных последовательностей праймеров на ген 16S рРНК, считающихся универсальными для бактерий, архей или для обоих прокариотических доменов жизни (табл. 1). Все праймеры были разбиты на группы в зависимости от участка гена 16S рРНК, на который они были разработаны авторами. Затем для каждого участка было подсчитано среднее покрытие этими праймерами филогенетического разнообразия бактерий и архей по отдельности. Анализ производили с использованием online ресурса Silva TestProbe 3.0 (Quast et al., 2013).
Таблица 1.
Анализ среднего покрытия разнообразия бактерий и архей праймерами в зависимости от консервативного участка гена 16S рРНК
| Участок* | Количество проанализиро-ванных праймеров | Покрытие, % | |||
|---|---|---|---|---|---|
| праймеры, специфичные к домену Bacteria | праймеры, специфичные к домену Archaea | универсальные праймеры | |||
| бактерии | археи | ||||
| 967–985 | 3 | 62.0 | – | – | – |
| 906–935 | 12 | 84.7 | 80.7 | – | – |
| 7–38 | 10 | 79.4 | 67.9 | – | – |
| 781–806 | 12 | 81.2 | 86.7 | 91.3 | 90.7 |
| 515–540 | 17 | 89.6 | 86.4 | 91.0 | 54.7 |
| 337–365 | 12 | 90.5 | 66.1 | 87.4 | 73.8 |
| 1492–1510 | 3 | – | – | 71.1 | 78.4 |
| 1390–1407 | 5 | – | – | 78.9 | 72.5 |
| 1091–1114 | 2 | 85.6 | – | – | – |
| 1061–1080 | 4 | 89.0 | – | – | – |
| 1046–1070 | 5 | 62.4 | – | – | – |
На основе полученных данных в качестве целевого был выбран V3−V4 регион гена 16S рРНК: этот регион фланкируется 337–365 и 781–806 консервативными участками гена 16S рРНК в соответствии с нумерацией нуклеотидов, основанной на номенклатуре для Escherichia coli. Участок 781–806 имеет наилучшие показатели покрытия бактерий и архей – 91.3 и 90.7% соответственно, тогда как участок 337–365 дает 87.4 и 73.8% покрытия соответственно. Показатели по покрытию других участков были значительно хуже: участок 515–540 показывает относительно слабое покрытие архей (54.7%), тогда как участки 1492–1510 и 1390–1407 демонстрируют относительно слабое покрытие бактерий (71.1 и 78.9% соответственно). Средняя длина ампликона при использовании консервативных участков 337–365 и 781–806 составляет 464 нуклеотида (Klindworth et al., 2013), что хорошо подходит для широко используемого высокопроизводительного секвенатора Illumina MiSeq с применением наборов реактивов, обеспечивающих общую длину чтения 500 нуклеотидов и более. Кроме того, такая длина ампликона обеспечивает более высокую информативность анализа, в сравнении с часто применяющимся анализом V4 региона. Наши выводы согласуются с данными многих публикаций, в которых применимость V3−V4 региона для анализа микробных сообществ оценивалась выше по сравнению с другими регионами: анализ этого региона давал большее количество таксонов прокариот в природных микробных сообществах и более адекватное описание искусственно сформированных микробных ассоциаций (Castelino et al., 2017; Graspeuntner et al., 2018).
In silico анализ опубликованных универсальных праймеров на V3−V4 регион гена 16S рРНК. Нами было in silico проанализировано 13 часто применяющихся праймеров на 337–365 позицию гена 16S рРНК и 15 часто применяющихся праймеров на 781–806 позицию гена 16S рРНК (табл. 2). В результате этого анализа было показано, что использование всех опубликованных систем праймеров может вести к элиминации тех или иных групп термофильных прокариот и/или других экологически значимых групп микроорганизмов. Анализ производился с использованием online ресурса Silva TestProbe 3.0 (Quast et al., 2013).
Таблица 2.
Анализ опубликованных праймеров на 337–365 и на 781–806 участки гена 16S рРНК
| Олигонуклеотидная последовательность (5'–3') | Ссылка | Пример элиминируемых групп термофильных прокариот (покрытие разнообразия менее 70%) | Пример элиминируемых экологически значимых групп прокариот (покрытие разнообразия менее 50%) |
|---|---|---|---|
| Позиция 337–365* | |||
| CCTACGGGNBGCASCAG | Takahashi et al., 2014 | p_Acetothermiia | p_Thaumarchaeota; p_Planctomycetes |
| GGCCCTAYGGGGYGCASCAGGC | Kublanov et al., 2009 | d_Bacteria; p_Nanoarchaeaeota | d_Bacteria |
| ACTCCTACGGGAGGCAGCAG | el Fantroussi et al., 1999 | d_Archaea | d_Archaea |
| CCTACGGGRSGCAGCAG | Baker et al., 2003 | p_Korarchaeota; p_Nanoarchaeaeota | p_Thaumarchaeota; p_Planctomycetes |
| GYGCASCAGKCGMGAAW | Takai, Horikoshi, 2000 | d_Bacteria; p_Korarchaeota | d_Bacteria |
| CCTACGGGAGGCAGCAG | Juck et al., 2000 | d_Archaea | d_Archaea |
| TCCTACGGGAGGCAGCAGT | Li et al., 2010 | d_Archaea | d_Archaea |
| CCTACGGGNGGCWGCAG | Herlemann et al., 2011 | d_Archaea | d_Archaea |
| TACGGRAGGCAGCAG | Nossa et al., 2010 | d_Archaea | d_Archaea |
| CCCTACGGGGYGCASCAG | Ovreås et al., 1997 | d_Bacteria; p_Thaumarchaeota | d_Bacteria |
| TGCTGCCTCCCGTAGGAGT (RC) | Fierer et al., 2008 | d_Archaea | d_Archaea |
| GGAGGCAGCAGTRRGGAAT | Nossa et al., 2010 | d_Archaea | d_Archaea |
| CCTAYGGGDBGCWSCAG | Frey et al., 2016 | p_Korarchaeota | – |
| Позиция 781–8061 | |||
| GGACTACSSGGGTATCTA (RC) | Baker et al., 2003 | d_Bacteria; p_Nanoarchaeaeota | d_Bacteria |
| GGACTACVSGGGTATCTAAT | Wang, Qian, 2009 | d_Bacteria; p_Nanoarchaeaeota | d_Bacteria |
| GGACTACCAGGGTATCTAAT | Wang, Qian, 2009 | d_Archaea; p_Thermotogae | d_Archaea |
| GGACTACHVGGGTATCTAAT | Walters et al., 2011 | p_Acetothermia; p_Nanoarchaeaeota | p_Chloroflexi |
| AGGATTAGATACCCTGGTA | Andersson et al., 2008 | d_Archaea; p_Thermosulfidibacteraeota p_Thermotogae | d_Archaea |
| TACNVGGGTATCTAATCC | Claesson et al., 2010 | – | p_Chloroflexi |
| CTACCAGGGTATCTAATCC | Juck et al., 2000 | d_Archaea; p_Acetothermia | d_Archaea |
| TACHVGGGTATCTAAKCC | Lucena et al., 2010 | p_Acetothermia; p_Hydrothermae | p_Chloroflexi |
| GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT | Li et al., 2010 | d_Archaea; p_Thermotogae | d_Archaea |
| GACTACCAGGGTATCTAAT | Frank et al., 2007 | d_Archaea; p_Acetothermia; p_Deinococcus-Thermus | d_Archaea |
| GACTACHVGGGTATCTAATCC | Herlemann et al., 2011 | p_Nanoarchaeaeota | P_Chloroflexi |
| CTACCRGGGTATCTAATCC | Nossa et al., 2010 | d_Archaea; p_Acetothermiia | d_Archaea; p_Cyanobacteria |
| GACTACNVGGGTATCTAATCC | Takahashi et al., 2014 | c_Anaerolineae | – |
| GGACTACHVGGGTWTCTAAT | Caporaso et al., 2011 | p_Acetothermia; p_Hydrothermae | – |
| GGACTACNVGGGTHTCTAAT | Frey et al., 2016 | – | p_Omnitrophicaeota |
Для подбора праймерной системы с минимизированным эффектом элиминации групп термофильных прокариот были получены консенсусные последовательности для всех проанализированных праймеров на 337–365 и 781–806 позиции гена 16S рРНК. Для позиции 337–365, таким образом, была получена последовательность 5'-CCTAYGGRNBGCWSCAG-3', кодирующая смесь из 192 индивидуальных олигонуклеотидов, а для позиции 781–806 последовательность 5'-GACTACNVGGGTHTCTAAKCC-3', кодирующая смесь из 72 индивидуальных олигонуклеотидов. Каждый из этих индивидуальных олигонуклеотидов затем был отдельно проанализирован с использованием online ресурса Silva TestProbe 3.0 (Quast et al., 2013) с целью выявления последовательностей, необходимых для наиболее полного покрытия разнообразия термофильных прокариот и других экологически значимых групп микроорганизмов.
Для позиции 337–365 было получено 19 значимых вариантов индивидуальных олигонуклеотидов, а для позиции 781–806 – 20 значимых вариантов. Затем для данного набора индивидуальных олигонуклеотидов были сгенерированы консенсусные последовательности. Для позиции 337–365, таким образом, получена последовательность 5'-CCTAYGGGDBGCWSCAG-3', а для позиции 781–806 – последовательность 5'‑GACTACNVGGGTMTCTAATCC-3'. Именно эти последовательности праймеров были задействованы для дальнейшего анализа. Полученная последовательность для позиции 337–365 точно соответствует последовательности праймера 341F (Frey et al., 2016), а праймер на позицию 781–806 назван нами Pro-mod-805R (по аналогии с Takahashi et al., 2014). Далее был проведен сравнительный анализ покрытия отдельных филогенетических групп прокариот парой праймеров 341F – Pro-mod-805R и двумя другими наиболее широко применяемыми парами праймеров: Pro341F–Pro805R (Takahashi et al., 2014) и UNIV515F–UNIV806R (Caporaso et al., 2012) (табл. 3). Этот вид анализа был проведен с использованием online ресурса Silva TestPrime 1.0 (Quast et al., 2013).
Таблица 3.
Сравнительный анализ покрытия отдельных филогенетических групп прокариот широко применяемыми праймерами на ген 16S рРНК
| 341F (Frey et al., 2016) CCTAYGGGDBGCWSCAG Pro-mod-805R (это исследование) GACTACNVGGGTMTCTAATCC |
Pro341F CCTACGGGNBGCASCAG Pro805R GACTACNVGGGTATCTAATCC (Takahashi et al., 2014) |
UNIV515F GTGCCAGCMGCCGCGGTAA UNIV806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT (Caporaso et al., 2012) |
|---|---|---|
| d_Archaea (81.6) d_Bacteria (88.1) |
d_Archaea (65.2) d_Bacteria (85.8) |
d_Archaea (52.9) d_Bacteria (86.8) |
| Домен Archaea | ||
| p_Altiarchaeota (25.8) p_Asgardaeota (2.6) p_Crenarchaeota (75.1) p_Diapherotrites (39.2) p_Euryarchaeota (89.0) p_Hadesarchaeaeota (85.5) p_Hydrothermarchaeota (93.4) p_Korarchaeota (33.3) p_Nanoarchaeaeota (53.0) c_Nanoarchaeia (88.9) c_Nanohaloarchaeia (53.2) c_Woesearchaeia (49.2) p_Thaumarchaeota (89.8) |
p_Altiarchaeota (25.8) p_Asgardaeota (2.4) p_Crenarchaeota (73.1) p_Diapherotrites (38.2) p_Euryarchaeota (88.9) p_Hadesarchaeaeota (84.7) p_Hydrothermarchaeota (92.9) p_Korarchaeota (33.2) p_Nanoarchaeaeota (47.7) c_Nanoarchaeia (0.0) c_Nanohaloarchaeia (51.7) c_Woesearchaeia (48.9) p_Thaumarchaeota (7.8) |
p_Altiarchaeota (0.0) p_Asgardaeota (77.8) p_Crenarchaeota (3.3) p_Diapherotrites (16.7) p_Euryarchaeota (87.8) p_Hadesarchaeaeota (83.9) p_Hydrothermarchaeota (87.6) p_Korarchaeota (45.5) p_Nanoarchaeaeota (51.9) c_Nanoarchaeia (0.0) c_Nanohaloarchaeia (20.1) c_Woesearchaeia (79.2) p_Thaumarchaeota (0.5) |
| Домен Bacteria (выборочно) | ||
| p_Acetothermia (90.9) p_Caldiserica (91.6) p_Chloroflexi (59.4) p_Cyanobacteria (78.5) p_‘Hydrothermae’ (89.4) p_Nitrospirae (91.6) p_Patescibacteria (62.4) p_Planctomycetes (75.4) |
p_Acetothermia (63.6) p_Caldiserica (91.6) p_Chloroflexi (40.0) p_Cyanobacteria (76.4) p_‘Hydrothermae’ (86.8) p_Nitrospirae (91.4) p_Patescibacteria (48.0) p_Planctomycetes (2.5) |
p_Acetothermia (23.6) p_Caldiserica (5.3) p_Chloroflexi (53.7) p_Cyanobacteria (80.3) p_‘Hydrothermae’ (50.0) p_Nitrospinae (66.8) p_Patescibacteria (17.4) p_Planctomycetes (81.1) |
Проведенный анализ показал, что система 341F–Pro-mod-805R дает наибольший процент покрытия разнообразия как архей, так и бактерий в целом. При этом разнообразие некоторых групп архей и бактерий лучше покрывается парой праймеров UNIV515F–UNIV806R (Caporaso et al., 2012). В частности, недавно предложенный филум Asgardaeota (Zaremba-Niedzwiedzka et al., 2017; здесь и далее классификация дана в соответствии с базой данных SILVA SSU r132) покрывается парой праймеров UNIV515F–UNIV806R на ~78%, тогда как анализированные пары праймеров на V3−V4 регион почти полностью элиминируют эту группу архей. Прирост в покрытии разнообразия при использовании пары праймеров UNIV515F–UNIV806R наблюдается и для двух других групп архей – филума Korarchaeota и класса Woesearchaeia. В сравнении с парой праймеров 341F–Pro-mod-805R покрытие возрастает от 33.3 до 45.5% и от 49.2 до 79.2% соответственно. Однако в целом пара праймеров UNIV515F–UNIV806R покрывает архейное разнообразие значительно хуже, чем пара праймеров 341F–Pro-mod-805R: 52.9 и 81.6% соответственно. В частности, пара праймеров UNIV515F–UNIV806R почти полностью элиминирует филумы Crenarchaeota и Thaumarchaeota, а также класс Nanoarchaeia. Значительный прирост в покрытии разнообразия при использовании пары праймеров UNIV515F–UNIV806R наблюдается также для двух групп бактерий – филума Cyanobacteria и филума Planctomycetes, однако в целом пара праймеров UNIV515F–UNIV806R покрывает бактериальное разнообразие несколько хуже, чем пара праймеров 341F–Pro-mod-805R: 86.8 и 88.1% соответственно. Так, например, пара праймеров UNIV515F–UNIV806R элиминирует значительную часть разнообразия филотипов филумов Acetothermia, Caldiserica, Hydrothermae и др.
In vitro анализ предложенной системы праймеров в сравнении с ранее опубликованными. На следующем этапе работы мы провели экспериментальный анализ системы 341F–Pro-mod-805R в сравнении с ранее опубликованными системами Pro341F–Pro805R и UNIV515F–UNIV806R. Кроме того, в качестве эксперимента нами был использован аналог пары праймеров 341F–Pro-mod-805R, но с заменой высоковырожденных нуклеотидов (D, B, V и N) на дезоксиинозин. Дезоксиинозин был впервые обнаружен на 5'-конце антикодонов тРНК, что позволяет им узнавать разные кодоны матричной РНК в ходе биосинтеза белка. Эта позиция известна как “колеблющееся” (англ. wobble) положение Уотсона–Крика (Crick, 1966). Дезоксиинозин образует водородные связи с любым из четырех основных нуклеотидов, однако термодинамическая стабильность таких пар будет не одинакова (Watkins, SantaLucia, 2005). Тем не менее, замена вырожденных оснований в ПЦР праймерах на дезоксиинозин была успешно применена во многих случаях, при этом было зафиксировано значимое повышение эффективности ПЦР в сравнении со стандартными вырожденными праймерами (Patil, Dekker, 1991; Palva et al., 1994). Последовательность использованных нами праймеров с дезоксиинозином была следующая: I-341F 5'-CCTAYGGGIIGCWSCAG -3' и Pro-mod-I-805R 5'-GACTACIIGGGTMTCTAATCC-3'.
Статистический анализ системы 341F–Pro-mod-805R, в сравнении с ранее опубликованными системами Pro341F–Pro805R и UNIV515F–UNIV806R, был проведен на образцах тотальной ДНК микробных сообществ трех горячих источников Камчатки и одного образца человеческого кала. Результаты представлены в табл. 4. Анализируемыми показателями были индекс Шеннона и значение Chao1. Индекс Шеннона – это показатель разнообразия видов (типов) живых существ в экосистеме, который основан на средневзвешенном геометрическом значении пропорциональной доли вида в сообществе (Tuomisto, 2010). Достоинством этого индекса является то, что он учитывает как общее количество видов, так и неоднородность их представленности в экосистеме. Значение Chao1 – это прогнозируемое количество видов (типов) в сообществе, которое основывается на имеющейся выборке и учитывает количество видов, представленных единожды или дважды в выборке (Chao, 1984). Таким образом, Chao1 – это показатель количества видов в сообществе при минимизации эффекта влияния объема выборки. Для всех проанализированных образцов была взята стандартизованная выборка в 10 000 последовательностей.
Таблица 4.
Значения индекса Шеннона и Chao1 для проанализированных образцов в зависимости от использовавшейся системы праймеров
| Образец | Система праймеров | Индекс Шеннона | Chao1 |
|---|---|---|---|
| Ист. “Солнечный” | Pro-mod-I | 3.197 | 316 |
| Pro-mod | 4.232 | 370 | |
| Pro | 4.294 | 512 | |
| UNIV | 4.296 | 437 | |
| Ист. “Термофильный” | Pro-mod-I | 1.526 | 89 |
| Pro-mod | 1.582 | 107 | |
| Pro | 1.262 | 83 | |
| UNIV | 0.527 | 68 | |
| Ист. “Извилистый” | Pro-mod-I | 1.259 | 53 |
| Pro-mod | 1.621 | 71 | |
| Pro | 1.108 | 43 | |
| UNIV | 0.922 | 65 | |
| Кал | Pro-mod-I | 3.802 | 142 |
| Pro-mod | 3.768 | 158 | |
| Pro | 3.855 | 153 |
Примечание. Серым цветом выделены наибольшие значения для данного образца. Pro-mod-I: I-341F 5'-CCTAYGGGIIGCWSCAG-3' и Pro-mod-I-805R 5'-GACTACIIGGGTMTCTAATCC-3'; Pro-mod: 341F (Frey et al., 2016) 5'-CCTAYGGGDBGCWSCAG-3' и Pro-mod-805R (эта работа) 5'-GACTACNVGGGTMTCTAATCC-3'; Pro: Pro341F 5'-CCTACGGGNBGCASCAG-3' и Pro805R 5'-GACTACNVGGGTATCTAATCC-3' (Takahashi et al., 2014); UNIV: UNIV515F 5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3' и UNIV806R 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3' (Caporaso et al., 2012).
Из анализа полученных результатов следует, что в трех из четырех типов микробных сообществ показатель Chao1 имеет наибольшее значение при использовании подобранной нами системы праймеров 341F–Pro-mod-805R. Исключением является образец микробного сообщества источника “Солнечный”, где системы Pro341F–Pro805R и UNIV515F–UNIV806R дают более высокие значения Chao1. Наибольший индекс Шеннона был получен при использовании системы 341F–Pro-mod-805R для образцов микробных сообществ источников “Извилистый” и “Термофильный” (температура 77 и 67°С соответственно). В случае ист. “Солнечный” (температура 52°С) наибольшее значение индекса Шеннона было достигнуто при использовании пары праймеров UNIV515F–UNIV806R, а в случае анализа образца кала – при использовании пары праймеров – Pro805R. Таким образом, на данном этапе мы можем говорить о том, что использование системы 341F–Pro-mod-805R будет оправдано при анализе микробных сообществ, адаптированных к высоким температурам, тогда как при анализе мезофильных микробных сообществ (кал) или умеренно термофильных микробных сообществ (ист. “Солнечный”) положительный эффект не наблюдается. Интересно, что при анализе индекса Шеннона система I-341F–Pro-mod-I-805R ни в одном из случаев не показывает лучший результат. При анализе источников с высокой температурой она показывает средний результат, в случае мезофильных микробных сообществ (кал) или умеренно термофильных микробных сообществ (ист. “Солнечный”) – худший результат. По всей видимости, это связано со значительной разницей в термодинамической стабильности пар I−C, I−G, I−A и I−T (Watkins, SantaLucia, 2005). Отметим также, что показатели индекса Шеннона и значение Chao1, полученные при использовании системы UNIV515F–UNIV806R, имеют сильный провал в случае анализа источников с высокой температурой в сравнении с системой 341F–Pro-mod-805R, что позволяет сделать вывод о нежелательности использования системы праймеров UNIV515F–UNIV806R при анализе экстремально термофильных микробных сообществ. В случае же мезофильных микробных сообществ (кал) или умеренно термофильных микробных сообществ (ист. “Солнечный”) падение значений индекса Шеннона при использовании системы 341F–Pro-mod-805R оказалось незначительным.
В результате проведенной работы нами было показано, что использование широко применяемых на сегодняшний день систем праймеров может вести к элиминации из спектра детекции ряда групп термофильных прокариот. Использование пары праймеров, предложенной в статье Caporaso et al. (2012), может вести к элиминации таких важных для экологии термофильных прокариот филумов как Crenarchaeota, Thaumarchaeota, Acetothermia, Caldiserica и классов Methanopyri, Archaeoglobi, Nanoarchaeia и Thermococci. Использование пары праймеров, предложенной в статье Takahashi et al. (2014), может вести к элиминации таких важных для экологии термофильных прокариот групп, как Nanoarchaeia, Thaumarchaeota, Chloroflexi, а также к недооценке количественной представленности филума Acetothermia. Кроме того данная пара праймеров крайне слабо покрывает разнообразие филума Planctomycetes. Подобранная нами система праймеров на V3−V4 регион гена 16S рРНК обладает минимальным эффектом элиминации из спектра детекции этих групп микроорганизмов (см. табл. 3). Следует также отметить, что все три системы праймеров достаточно слабо (менее чем на 50%) покрывают разнообразие филума Korarchaeota.
При анализе состава микробных сообществ, развивающихся при умеренных температурах, необходимо учитывать и то, что использование праймеров с большим количеством вырожденных нуклеотидов нежелательно в связи со значительным в этом случае уменьшением действующих концентраций отдельных вариантов олигонуклеотидов. У системы 341F–Pro-mod-805R всего 8 вырожденных нуклеотидов, у системы, предложенной в статье Takahashi et al. (2014), – 5, а у системы, предложенной в статье Caporaso et al. (2012), – 4. К сожалению, система с дезоксиинозином, которая нами рассматривалась как возможная альтернатива системы 341F–Pro-mod-805R, но с отсутствием эффекта вырожденных нуклеотидов, показала свою непригодность в in vitro экспериментах.
Одним из важных достоинств подобранной в настоящей работе системы 341F–Pro-mod-805R является ее способность значительно покрывать разнообразие класса Nanoarchaeia (табл. 3). Это ее свойство позволило выявить присутствие в горячих источниках Камчатки наноархей и показать их значительную численность в этих экотопах (Merkel et al., 2017).
Список литературы
Andersson A.F., Lindberg M., Jakobsson H., Bäckhed F., Nyrén P., Engstrand L. Comparative analysis of human gut microbiota by barcoded pyrosequencing // PLoS One. 2008. V. 3. P. e2836.
Baker G.C., Smith J.J., Cowan D.A. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers // J. Microbiol. Methods. 2003. V. 55. P. 541–555.
Caporaso J.G., Kuczynski J., Stombaugh J., Bittinger K., Bushman F.D., Costello E.K., Fierer N., Peña A.G., Goodrich J.K., Gordon J.I., Huttley G.A., Kelley S.T., Knights D., Koenig J.E., Ley R.E., Lozupone C.A., McDonald D., Muegge B.D., Pirrung M., Reeder J., Sevinsky J.R., Turnbaugh P.J., Walters W.A., Widmann J., Yatsunenko T., Zaneveld J., Knight R. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data // Nat. Methods. 2010 V. 7. P. 335–336.
Caporaso J.G., Lauber C.L., Walters W.A., Berg-Lyons D., Huntley J., Fierer N., Owens S.M., Betley J., Fraser L., Bauer M., Gormley N., Gilbert J.A., Smith G., Knight R. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms // ISME J. 2012. V. 6. P. 1621–1624.
Caporaso J.G., Lauber C.L., Walters W.A., Berg-Lyons D., Lozupone C.A., Turnbaugh P.J., Fierer N., Knight R. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011. V. 15. P. 4516–4522.
Castelino M., Eyre S., Moat J., Fox G., Martin P., Ho P., Upton M., Barton A. Optimization of methods for bacterial skin microbiome investigation: primer selection and comparison of the 454 versus MiSeq platform // BMC Microbiol. 2017. V. 17. https://doi.org/10.1186/s12866-017-0927-4
Chao A. Nonparametric estimation of the number of classes in a population // Scand. J. 1 Stat. 1984. V. 11. P. 265–270.
Claesson M.J., Wang Q., O’Sullivan O., Greene-Diniz R., Cole J.R., Ross R.P., O’Toole P.W. Comparison of two next-generation sequencing technologies for resolving highly complex microbiota composition using tandem variable 16S rRNA gene regions // Nucleic Acids Res. 2010. V. 38. https://doi.org/10.1093/nar/gkq873
Counts J.A., Zeldes B.M., Lee L.L., Straub C.T., Adams M.W.W., Kelly R.M. Physiological, metabolic and biotechnological features of extremely thermophilic microorganisms // Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2017. V. 9. https://doi.org/10.1002/wsbm.1377
Crick F.H. Codon-anticodon pairing: the wobble hypothesis // J. Mol. Biol. 1966. V. 19. P. 548–555.
Dalmaso G.Z., Ferreira D., Vermelho A.B. Marine extremophiles: a source of hydrolases for biotechnological applications // Mar. Drugs. 2015. V. 13. P. 1925–1965.
de Muinck E.J., Trosvik P., Gilfillan G.D., Hov J.R., Sundaram A.Y.M. A novel ultra high-throughput 16S rRNA gene amplicon sequencing library preparation method for the Illumina HiSeq platform // Microbiome. 2017. V. 5. https://doi.org/10.1186/s40168-017-0279-1
el Fantroussi S., Verschuere L., Verstraete W., Top E.M. Effect of phenylurea herbicides on soil microbial communities estimated by analysis of 16S rRNA gene fingerprints and community-level physiological profiles // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 982–988.
Fadrosh D.W., Ma B., Gajer P., Sengamalay N., Ott S., Brotman R.M., Ravel J. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform // Microbiome. 2014. V. 2. P. 6.
Fierer N., Hamady M., Lauber C.L., Knight R. The influence of sex, handedness, and washing on the diversity of hand surface bacteria // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V. 105. P. 17994–17999.
Frank D.N., St Amand A.L., Feldman R.A., Boedeker E.C., Harpaz N., Pace N.R. Molecular-phylogenetic characterization of microbial community imbalances in human inflammatory bowel diseases // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. P. 13780–13785.
Frey B., Rime T., Phillips M., Stierli B., Hajdas I., Widmer F., Hartmann M. Microbial diversity in European alpine permafrost and active layers // FEMS Microbiol. Ecol. 2016. V. 92. P. fiw018.
Graspeuntner S., Loeper N., Künzel S., Baines J.F., Rupp J. Selection of validated hypervariable regions is crucial in 16S-based microbiota studies of the female genital tract // Sci. Rep. 2018. V. 8. https://doi.org/10.1038/s41598-018-27757-8
Herlemann D.P., Labrenz M., Jürgens K., Bertilsson S., Waniek J.J., Andersson A.F. Transitions in bacterial communities along the 2000 km salinity gradient of the Baltic Sea // ISME J. 2011. V. 5. P. 1571–1579.
Hugerth L.W., Andersson A.F. Analysing microbial community composition through amplicon sequencing: from sampling to hypothesis testing // Front. Microbiol. 2017. V. 4. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.01561
Juck D., Charles T., Whyte L.G., Greer C.W. Polyphasic microbial community analysis of petroleum hydrocarbon-contaminated soils from two northern Canadian communities // FEMS Microbiol. Ecol. 2000. V. 33. P. 241–249.
Klindworth A., Pruesse E., Schweer T., Peplies J., Quast C., Horn M., Glöckner F.O. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies // Nucleic Acids Res. 2013. V. 41. P. e1.
Kublanov I.V., Perevalova A.A., Slobodkina G.B., Lebedinsky A.V., Bidzhieva S.K., Kolganova T.V., Kaliberda E.N., Rumsh L.D., Haertlé T., Bonch-Osmolovskaya E.A. Biodiversity of thermophilic prokaryotes with hydrolytic activities in hot springs of Uzon Caldera, Kamchatka (Russia) // Appl. Environ. Microbiol. 2009. V. 75. P. 286–291.
Lever M.A., Torti A., Eickenbusch P., Michaud A.B., Šantl-Temkiv T., Jørgensen B.B. A modular method for the extraction of DNA and RNA, and the separation of DNA pools from diverse environmental sample types // Front. Microbiol. 2015. V. 6. P. 476.
Li D., Li Z., Yu J., Cao N., Liu R., Yang M. Characterization of bacterial community structure in a drinking water distribution system during an occurrence of red water // Appl. Environ. Microbiol. 2010. V. 76. P. 7171–7180.
Lucena T., Pascual J., Garay E., Arahal D.R., Macián M.C., Pujalte M.J. Haliea mediterranea sp. nov., a marine gammaproteobacterium // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2010. V. 60. P. 1844–1848.
Martin W., Baross J., Kelley D., Russell M.J. Hydrothermal vents and the origin of life // Nat. Rev. Microbiol. 2008. V. 6. P. 805–814.
Martin W., Russell M.J. On the origins of cells: a hypothesis for the evolutionary transitions from abiotic geochemistry to chemoautotrophic prokaryotes, and from prokaryotes to nucleated cells // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2003. V. 29. P. 59–83.
McCollom T.M., Shock E.L. Geochemical constraints on chemolithoautotrophic metabolism by microorganisms in seafloor hydrothermal systems // Geochim. Cosmochim. Acta. 1997. V. 61. P. 4375–4391.
Merkel A.Y., Pimenov N.V., Rusanov I.I., Slobodkin A.I., Slobodkina G.B., Tarnovetckii I.Y., Frolov E.N., Dubin A.V., Perevalova A.A., Bonch-Osmolovskaya E.A. Microbial diversity and autotrophic activity in Kamchatka hot springs // Extremophiles. 2017. V. 21. P. 307–317.
Miroshnichenko M.L., Bonch-Osmolovskaya E.A. Recent developments in the thermophilic microbiology of deep-sea hydrothermal vents // Extremophiles. 2006. V. 10. P. 85–96.
Mori K., Yamaguchi K., Sakiyama Y., Urabe T., Suzuki K. Caldisericum exile gen. nov., sp. nov., an anaerobic, thermophilic, filamentous bacterium of a novel bacterial phylum, Caldiserica phyl. nov., originally called the candidate phylum OP5, and description of Caldisericaceae fam. nov., Caldisericales ord. nov. and Caldisericia classis nov // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2009. V. 59. P. 2894–2898.
Mulkidjanian A.Y., Bychkov A.Y., Dibrova D.V., Galperin M.Y., Koonin E.V. Origin of first cells at terrestrial, anoxic geothermal fields // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. V. 109. P. E821–E830.
Nossa C.W., Oberdorf W.E., Yang L., Aas J.A., Paster B.J., Desantis T.Z., Brodie E.L., Malamud D., Poles M.A., Pei Z. Design of 16S rRNA gene primers for 454 pyrosequencing of the human foregut microbiome // World J. Gastroenterol. 2010. V. 16. P. 4135–4144.
Ovreås L., Forney L., Daae F.L., Torsvik V. Distribution of bacterioplankton in meromictic Lake Saelenvannet, as determined by denaturing gradient gel electrophoresis of PCR-amplified gene fragments coding for 16S rRNA // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P. 3367–3373.
Palva A., Vidgren G., Paulin L. Application of PCR with oligonucleotide primers containing deoxyinosine for gene detection, isolation and sequencing // J. Microbiol. Methods. 1994. V. 19. P. 315–321.
Parks D.H., Rinke C., Chuvochina M., Chaumeil P.A., Woodcroft B.J., Evans P.N., Hugenholtz P., Tyson G.W. Recovery of nearly 8,000 metagenome-assembled genomes substantially expands the tree of life // Nat. Microbiol. 2017. V. 2. P. 1533–1542.
Patil R.V., Dekker E.E. PCR amplification of an Escherichia coli gene using mixed primers containing deoxyinosine at ambiguous positions in degenerate amino acid codons // Nucleic Acids Res. 1990. V. 18. P. 3080.
Peng W., Li X., Wang C., Cao H., Cui Z. Metagenome complexity and template length are the main causes of bias in PCR-based bacteria community analysis // J. Basic Microbiol. 2018. V. 58. P. 987–997.
Preiner M., Xavier J.C., Sousa F.L., Zimorski V., Neubeck A., Lang S.Q., Greenwell H.C., Kleinermanns K., Tüysüz H., McCollom T.M., Holm N.G., Martin W.F. Serpentinization: connecting geochemistry, ancient metabolism and industrial hydrogenation // Life (Basel). 2018. V. 22. https://doi.org/10.3390/life8040041
Quast C., Pruesse E., Yilmaz P., Gerken J., Schweer T., Yarza P., Peplies J., Glöckner F.O. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools // Nucleic Acids Res. 2013. V. 41. P. D590–D596.
Russell M.J., Hall A.J., Cairns-Smith A.G., Braterman P.S. Submarine hot springs and the origin of life // Nature. 1988. V. 336. P. 609–611.
Sorokin D.Y., Merkel A.Y., Abbas B., Makarova K.S., Rijpstra W.I.C., Koenen M., Sinninghe Damsté J.S., Galinski E.A., Koonin E.V., van Loosdrecht M.C.M. Methanonatronarchaeum thermophilum gen. nov., sp. nov. and “Candidatus Methanohalarchaeum thermophilum”, extremely halo(natrono)philic methyl-reducing methanogens from hypersaline lakes comprising a new euryarchaeal class Methanonatronarchaeia classis nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2018. V. 68. P. 2199–2208.
Takahashi S., Tomita J., Nishioka K., Hisada T., Nishijima M. Development of a prokaryotic universal primer for simultaneous analysis of Bacteria and Archaea using next-generation sequencing // PLoS One. 2014. V. 9. P. e105592.
Takai K., Horikoshi K. Rapid detection and quantification of members of the archaeal community by quantitative PCR using fluorogenic probes // Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. P. 5066–5072.
Takai K., Nakamura K. Archaeal diversity and community development in deep-sea hydrothermal vents // Curr. Opin. Microbiol. 2011. V. 14. P. 282–291.
Thijs S., Op De Beeck M., Beckers B., Truyens S., Stevens V., Van Hamme J.D., Weyens N., Vangronsveld J. Comparative evaluation of four Bacteria-specific primer pairs for 16S rRNA gene surveys // Front. Microbiol. 2017. V. 8. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.00494
Tuomisto H. A diversity of beta diversities: straightening up a concept gone awry. Part 1. Defining beta diversity as a function of alpha and gamma diversity // Ecography. 2010. V. 33. P. 2–22.
Walters W.A., Caporaso J.G., Lauber C.L., Berg-Lyons D., Fierer N., Knight R. PrimerProspector: de novo design and taxonomic analysis of barcoded polymerase chain reaction primers // Bioinformatics. 2011. V. 27. P. 1159–1161.
Wang Y., Qian P.Y. Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies // PLoS One. 2009. V. 4. P. e7401.
Watkins N.E., Jr., SantaLucia J., Jr. Nearest-neighbor thermodynamics of deoxyinosine pairs in DNA duplexes // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33. P. 6258–6267.
Weiss M.C., Sousa F.L., Mrnjavac N., Neukirchen S., Roettger M., Nelson-Sathi S., Martin W.F. The physiology and habitat of the last universal common ancestor // Nat. Microbiol. 2016. V. 1. https://doi.org/10.1038/nmicrobiol.2016.116
Wohlgemuth R., Littlechild J., Monti D., Schnorr K., van Rossum T., Siebers B., Menzel P., Kublanov I.V., Rike A.G., Skretas G., Szabo Z., Peng X., Young M.J. Discovering novel hydrolases from hot environments // Biotechnol. Adv. 2018. V. 36. P. 2077–2100.
Yang B., Wang Y., Qian P.Y. Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis // BMC Bioinformatics. 2016. V. 135. https://doi.org/10.1186/s12859-016-0992-y
Zaremba-Niedzwiedzka K., Caceres E.F., Saw J.H., Bäckström D., Juzokaite L., Vancaester E., Seitz K.W., Anantharaman K., Starnawski P., Kjeldsen K.U., Stott M.B., Nunoura T., Banfield J.F., Schramm A., Baker B.J., Spang A., Ettema T.J. Asgard archaea illuminate the origin of eukaryotic cellular complexity // Nature. 2017. V. 541. P. 353–358.
Дополнительные материалы отсутствуют.
Пн.-пт.: 10.00-19.00