1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Микробиология
  4. T. 90, № 2, 2021

Микробиология, 2021, T. 90, № 2, стр. 155-165

Выделение и идентификация алкалотолерантных бактерий с гидролитической активностью из содового шламохранилища

А. В. Шилова a, *, А. Ю. Максимов a, b, Ю. Г. Максимова a, b

a Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН – филиал Пермского федерального исследовательского центра УрО РАН
614081 Пермь, Россия

b Пермский государственный национальный исследовательский университет
614990 Пермь, Россия

* E-mail: A.Shilova-IEGM@yandex.ru

Поступила в редакцию 08.07.2020
После доработки 31.08.2020
Принята к публикации 09.11.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Идентифицировано 58 культур алкалотолерантных бактерий, обладающих амилазной, липазной, протеазной и целлюлазной активностями, которые были выделены из содового шламохранилища на среде с селективными субстратами в отсутствие экстремальных условий (рН 8) и на богатой среде с рН 11 без селективных субстратов. Исследовано влияние рН и концентрации хлорида натрия на рост и проявление гидролитической активности у штаммов Pseudomonas peli, Paenarthrobacter nitroquajacolicus и Microbacterium kitamiense, обладающих липазной и амилазной активностями. Показано, что амилазы культур, выделенных на среде с рН 11 и 8, проявляют наибольшую активность при рН 10 и 6 соответственно, тогда как удельная активность внеклеточной липазы изолятов P. peli, выделенных при рН 8, максимальна при рН 11. На среде с рН 11 выделены Bacillus aequororis, Brevibacterium pityocampae, Microbacterium kitamiense, Microcella putealis, Oerskovia paurometabola, O. enterophila, O. jenensis, обладающие активностью щелочной амилазы.

Ключевые слова: содовое озеро, содовое шламохранилище, алкалофилы, алкалотолерантные микроорганизмы, гидролитическая активность, амилаза, липаза, протеаза, целлюлаза

Места обитания, значительно отличающиеся по одному или нескольким физико-химическим параметрам от большинства экосистем, принято называть экстремальными, а населяющие их организмы – экстремофилами. Экстремальные водные системы широко распространены в природе и отличаются крайними значениями температуры, рН, солености, повышенным давлением, высокими концентрациями токсичных веществ (Horikoshi, 1999; Grant, Sorokin, 2011). Длительное время экстремофилы находятся в центре внимания исследователей. Большой интерес вызывает изучение механизмов биохимической адаптации микроорганизмов к экстремальным условиям окружающей среды, а также использование их биомассы и экстремоферментов в биотехнологии (Морозкина и соавт., 2010).

Содовые озера – экстремальные природные водные системы, характерной особенностью которых является высокая концентрация солей и щелочная среда. Накопление соды происходит вследствие их питания поверхностными и грунтовыми карбонатными водами, минерализованными за счет выветривания силикатов (Заварзин, Жилина, 2000; Борзенко, Замана, 2008; Sorokin et al., 2015). Щелочные высокоминералированные водные системы могут иметь и антропогенное происхождение. Это могут быть шламонакопители, места захоронения отходов, щелочные сточные воды. Работы, посвященные изучению микробиома таких искусственных щелочных биоценозов, немногочисленны (Kevbrin, 2019). Так, изучено микробное разнообразие и геохимия озера Калумет на юго-востоке Чикаго. За десятилетия захоронения промышленных отходов крупномасштабное заполнение заболоченных угодий стальным шлаком создало водоносный горизонт со значениями рН, достигающими 12.8. В этой щелочной среде были обнаружены представители Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria и Firmicutes (Roadcap et al., 2006). Из золя щелочного диоксида кремния, который является важным малотоннажным химическим продуктом, были выделены штаммы факультативных алкалофилов с протеазной и амилазной активностями (Ren et al., 2014). Щелочные сточные воды также явились источником выделения алкалофильных бактерий, которые были отнесены к родам Ae-romonas, Alcaligenes, Cupriavidus, Escherichia, Marinococcus, Micrococcus, Natronobacterium, Neisseria, Pleisomonas, Pseudomonas и Sporosarcina (Ali et al., 2009). Есть единичный пример исследования микробиома содового шламохранилища. Было изучено микробное разнообразие искусственной щелочной среды – отходов производства карбоната натрия, получаемого из известняка и хлорида натрия по методу Сольве в Польше, г. Яниково. В этой сильно засоленной, щелочной и бедной питательными веществами среде было обнаружено бактериальное сообщество, в котором доминировали филумы Proteobacteria (52.8%) и Firmicutes (16.6%) (Kalwasińska et al., 2017).

Нами ранее был изучен микробиом шламохранилища АО “Березниковский содовый завод” (Пермский край), на котором кальцинированная сода также производится аммиачным способом по методу Сольве (Шилова и соавт., 2018, 2020). Это техногенное образование характеризуется щелочной реакцией среды (рН до 12) и высокой степенью минерализации за счет содержания катионов натрия, калия и аммония, а также хлорид- и сульфат-анионов. В процессе извлечения аммиака образуется хлорид кальция, который составляет большую часть отходов производства. В шламонакопитель отход поступает в виде пульпы, в которой преобладает жидкая фаза (Блинов и соавт., 2003), что отличает его от содового шламохранилища г. Яниково, где эти отходы представляют собой относительно сухую массу (Kalwasińska et al., 2017).

Выделенные из экстремальных экологических ниш микроорганизмы адаптированы к неблагоприятным факторам окружающей среды и обладают большим биотехнологическим потенциалом. Ферменты, синтезируемые данными микроорганизмами, как правило, обладают повышенной активностью и стабильностью в различных неблагоприятных условиях, в том числе в щелочных условиях и при высоких концентрациях соли (Морозкина и соавт., 2010; Oren, 2010).

Гидролитические ферменты, устойчивые к экстремальным условиям, представляют большой интерес для промышленности. Так, протеазы (КФ 3.4) находят широкое применение в качестве компонентов моющих средств, растворов для контактных линз, в производстве сыра и переработке мясных продуктов (Gupta et al., 2002; Sharma et al., 2017). Амилазы (КФ 3.2.1.1) используются преимущественно в пищевой промышленности: в хлебопечении, в переработке фруктовых соков, а также в обработке бумаги и текстиля, составляя около 25% объема используемых промышленных ферментов. Щелочные амилазы сохраняют активность в диапазоне рН 8–11 и применяются в производстве моющих средств (Sarethy et al., 2011). Целлюлазы (КФ 3.2.1.4) применяются для модификации целлюлозосодержащих отходов (Jagtap, Rao, 2005). Щелочные целлюлазы также являются компонентами моющих средств и используются в текстильной промышленности (Anish et al., 2007; Новожилов, Пошина, 2011).

Во многих биокаталитических процессах используются липазы (КФ 3.1.1). Они активны по отношению к широкому ряду субстратов, стабильны в органических растворителях, не требуют присутствия кофакторов. Липазы широко используются в биотехнологии, включая синтез биополимеров, биодизельного топлива, фармацевтических препаратов и других соединений, а также биодеструкцию техногенных загрязнителей (Безбородов, Загустина, 2014). Липазы, устойчивые в щелочной среде, в основном находят применение в производстве моющих средств (Hasan et al., 2010).

В связи с этим, целью работы было выделение из содового шламохранилища гидролитических алкалофильных и алкалотолерантных бактерий, их идентификация, а также изучение влияния рН и концентрации хлорида натрия на рост, липазную и амилазную активность наиболее перспективных штаммов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования являлось содовое шламохранилище АО “Березниковский содовый завод”, расположенное на северо-западной окраине г. Березники Пермского края (59.439618 с.ш., 56.715197 в.д. – 59.427038 с.ш., 56.746573 в.д.). Пробы воды и донных отложений, а также техногенных поверхностных образований в прибрежной зоне действующего и грунта осушенного шламохранилища отбирали в сентябре 2017 г. В почвоподобных образованиях осушенного шламохранилища пробы отбирали с поверхности, а также с глубины 5 и 10 см (в точке 59.428803 с.ш., 56.729718 в.д.). Образцы хранили при температуре 4°С.

Выделение алкалофильных и алкалотолерантных бактерий проводили в двух вариантах:

1) Высев на слабощелочной среде с селективными субстратами (рН 8), создающий условия для преимущественного роста гидролитически-активных бактерий с протеазной, амилазной, целлюлазной и липазной активностями. Пробы высевали на агаризованную среду Пфеннига следующего состава (г/л): NH4Cl – 0.3, KH2PO4 – 0.3, MgCl2 – 0.3, СаСl2 – 0.03, дрожжевой экстракт – 0.5, раствор микроэлементов по Липперту–Витману – 1 мл (Рандагуруева, Лаврентьева, 2009). В качестве субстратов вносили до концентрации 1.5%: пептон (“Sigma–Aldrich”) для выделения протеолитиков, крахмал растворимый (ЗАО “ННПЦ ГИП”, Оболенск, Россия) – для амилолитиков, микрокристаллическую целлюлозу ЛТ (“Chemapol”, Чехословакия) – для целлюлолитиков, твин-80 (“FERAK”, Германия) – для липолитиков. Кислотность среды доводили 1 M раствором NaOH до 8 и инкубировали чашки при 30°С.

2) Высев на богатой среде с рН 11 без селективных субстратов, позволяющий выделить культуры, устойчивые к экстремальному защелачиванию среды. Для этого использовали богатую среду следующего состава (г/л): пептон – 10, глюкоза – 10, дрожжевой экстракт – 5, K2HPO4 – 1, Na2CO3 – 10, рН 11 (Atlas, 1993).

Идентификацию изолятов до вида проводили методом секвенирования фрагмента гена 16S рРНК, амплифицированного в ПЦР-реакции с использованием универсальных праймеров 27F 5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3' и 1492R 5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3'. Температурный цикл состоял из начальной денатурации при 95°С в течение 3 мин, 35 циклов амплификации (денатурация при 94°С в течение 30 с, отжиг при 54°С в течение 30 с и элонгация при 72°С в течение 60 с) и окончательно элонгация при 72°С в течение 3 мин. ПЦР-ампликоны анализировали электрофоретически в 1% агарозном геле в трис-боратном буфере при напряженности поля 5 В/см. Для оценки молекулярной массы фрагментов ДНК использовали маркеры 1 kb (ООО “СибЭнзим”, Новосибирск). Визуализацию полос осуществляли путем окрашивания бромистым этидием с последующим документированием с использованием системы гельдокументации BioDocAnalyze (“Biometra”, Германия). Очистку ПЦР-продукта перед секвенированием осуществляли с использованием смеси ферментов ExoSAPMix (“Thermo Fisher Scientific”, США). Секвенирующую реакцию проводили с праймером 27F и набором Big Dye Terminator v. 3.1 (“Thermo Fisher Scientific”, США), в соответствии с инструкцией производителя. Анализ проводили на приборе Genetic Analyzer 3500xl (“Applied Biosystems”, США). Сравнение полученных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК проводили с использованием онлайн-сервиса EzBioCloud (https://www.ezbiocloud.net/).

Для определения липолитической активности изолятов, выращенных на селективной среде с твин-80, проводили биохимическую реакцию с р‑нитрофениллауратом, который под действием липазы расщеплялся с образованием окрашенного продукта р-нитрофенола (Margesin et al., 2002). Активность липазы определяли по приросту оптической плотности среды при λ 405 нм, измеренной на спектрофотометре Ultraspec 3000 (“GE Healthcare”, США).

Активность амилазы оценивали с помощью коммерческого набора реактивов для определения амилазы Альфа-Амилаза-Ольвекс (ООО “Ольвекс Диагностикум”, Россия). Реакция основана на гидролизе синтетического субстрата этилиден-р-нитрофенилмальтогептазида с образованием нитрофенилмальтозидов, которые подвергаются дальнейшему расщеплению α-глюкозидазой до глюкозы и окрашенного продукта р-нитрофенола. Активность фермента определяли по изменению оптической плотности среды при λ 405 нм на планшетном ридере Infinite M1000 (“Tecan”, Швейцария) в течение пяти циклов с интервалом в 1 мин.

Измерение целлюлозолитической активности культур основано на колориметрическом определении редуцирующих сахаров, выделившихся после 24-часовой инкубации образцов с натриевой солью карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ). Концентрацию глюкозы определяли с помощью коммерческого набора реактивов для определения глюкозы Глюкоза-8-Ольвекс (ООО “Ольвекс Диагностикум”, Россия). Интенсивность окраски определяли фотометрически на планшетном ридере Infinity M1000 (“Tecan”, Швейцария) в течение пяти циклов с интервалом в 1 мин при λ 500 нм. Для качественного определения целлюлозолитической активности использовали способность красителя конго красного образовывать комплекс с целлюлозой. Культуры высевали штрихом на чашки с минимальной средой следующего состава (г/л): КН2РО4 – 1.0, K2НРО4 · 3Н2О – 3.7, NaCl – 0.5, раствор микроэлементов по Липперту–Витману – 1 мл и КМЦ в качестве субстрата и инкубировали в термостате при 30°С, после чего окрашивали среду 1% конго красным, выдерживали 15 мин и смывали 1 М раствором NaCl. Целлюлозолитическую активность оценивали по зоне просветления вокруг штриха.

Протеазную активность оценивали по ширине зоны лизиса казеината натрия (“Sigma–Aldrich”, Германия) вокруг штриха.

Для оценки влияния концентрации хлорида натрия и рН на рост и активность наиболее перспективных изолятов варьировали pH среды Пфеннига, содержащей соответствующий источник углерода, в диапазоне от 6 до 11. Добавляли NaCl до концентрации 0.5, 5, 50, 100, 200 г/л; 4 мл среды инокулировали 50 мкл культуры (ОП540 = 1.0). О росте бактерий судили по увеличению биомассы (мг/мл), которую определяли гравиметрически. Для этого центрифугировали суспензию клеток, полученный осадок высушивали до постоянной массы в сушильном шкафу при температуре 50°С и взвешивали на аналитических весах. Выживаемость бактерий оценивали методом КОЕ при высеве из десятикратных разведений.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Идентификация изолятов. Несмотря на то, что щелочные высокоминерализованные среды антропогенного происхождения бедны питательными субстратами, скрининг образцов грунта, осадков и воды содового шламохранилища г. Березники на наличие бактериальных культур с активностью амилазы, липазы, протеазы и целлюлазы позволил выделить и идентифицировать культуры алкалотолерантных умеренно галофильных гидролитических бактерий (табл. 1, 2). Как отмечено ранее, для поиска бактериальных культур использовали два подхода: выделение на среде с селективными субстратами в отсутствие экстремальных условий (рН 8) и на богатой среде с рН 11 без селективных субстратов, так как объединение нескольких лимитирующих факторов при выделении чистых культур значительно сужает исходный материал для скрининга ферментативных активностей.

Таблица 1.

Идентификация изолятов гидролитических бактерий, выделенных на крахмале, пептоне, твин-80 и целлюлозе в качестве единственного источника углерода

Изолят Субстрат Типовой штамм ближайшего родственного вида и номер в базе данных EzBioCloud Сходство генов 16S рРНК, % Количество прочтенных нуклеотидов Идентифика-ционный номер последова-тельности в GenBank
Старая карта содового шламонакопителя
8-К Крахмал Sphingopyxis panaciterrae, Gsoil124T AB245353 99.23 783 MT860696
9-К Pedobacter quisquiliarum, C62-2T KU973598 99.75 808 MT860697
14-K Pseudomonas peli, R-20805T AM114534 99.65 851 MT860695
15-K Pseudomonas peli, R-20805T AM114534 99.65 851 MT887618
21-K Microcella putealis, CV-2T AJ717388 100 726 MT860698
24-К Bacillus cereus, ATCC14579T AE016877 100 879 MT860699
26-K Ensifer morelensis, Lc04T AY024335 99.88 872 MT860700
29-К Arthrobacter ginsengisoli, DCY81T KF212463 99.75 797 MT860701
1-Ц Целлюлоза Lysobacter prati, SYSU H10001T MN181427 99.71 802 MT875267
6-Ц Paenarthrobacter aurescens, NBRC 12136T BJMD01000050 99.36 594 MT875275
8-Ц Metabacillus indicus, LMG 22858T JGVU01000003 100 693 MT875282
3-Т Твин-80 Pseudomonas peli, R-20805T AM114534 99.17 855 MT860703
4-Т Sphingopyxis chilensis, S37T AF367204 99.47 1321 MT860704
5-Т Bosea lathyri, DSM 26656T jgi.1058926 99.75 809 MT860706
6-Т Ensifer morelensis, Lc04T AY024335 99.62 795 MT860707
10-Т Exiguobacterium undae, DSM 14481T JHZV01000003 100 842 MT860708
11-Т Ensifer morelensis, Lc04T AY024335 99.76 1264 MT860709
13-Т Ensifer morelensis, Lc04T AY024335 99.63 810 MT860710
14-Т Pseudomonas peli, R-20805T AM114534 99.17 855 MT887617
15-Т Pseudomonas peli, R-20805T AM114534 100 885 MT860712
16-Т Pseudoxanthomonas mexicana, AMX 26BT AF273082 99.88 843 MT860715
17-Т Pseudoxanthomonas putridarboris, WD12T GU908487 98.82 847 MT860720
5-П Пептон Exiguobacterium undae, DSM14481T JHZV01000003 100 729 MT872007
7-П Pseudoxanthomonas mexicana, AMX 26BT AF273082 99.88 841 MT872010
12-П Bacillus aquimaris, TF-12T AF483625 99.27 829 MT875305
14-П Paenarthrobacter aurescens, NBRC 12136T BJMD01000050 92.42 729 MT872020
15-П Ensifer morelensis, Lc04T AY024335 100 876 MT872021
Действующее содовое шламохранилище
4-К Крахмал Paenisporosarcina quisquiliarum, SK 55T DQ333897 99.29 841 MT872022
5-К Microcella putealis, CV-2T AJ717388 100 910 MT872023
6-К Actinotalea fermentans, DSM 3133T AXCX01000029 98.86 875 MT872026
7-К Microcella putealis, CV-2T AJ717388 100 831 MT872027
10-К Microbacterium oxydans, DSM 20578T Y17227 100 790 MT872028
13-К Pseudomonas peli, R-20805T AM114534 99.40 671 MT872055
19-К Bacillus vietnamensis, 15-1T AB099708 99.54 879 MT872057
25-К Bacillus aquimaris, TF-12T AF483625 98.69 768 MT872059
27-К Paenarthrobacter nitroguajacolicus, G2-1T AJ512504 100 876 MT872058
28-К Bacillus toyonensis, BCT-7112T CP006863 100 867 MT875308
11-Ц Целлюлоза Microbacterium pygmaeum, DSM 23142T LT6296692 99.76 821 MT872064
8-Т Твин-80 Bacillus aquimaris TF-12T AF483625 99.88 814 MT875310
9-Т Metabacillus litoralis, SW-211T AY608605 100 799 MT875314
12-Т Citricoccus zhacaiensis, FS24T EU305672 99.17 844 MT872066
1-П Пептон Bacillus amyloliquefaciens, DSM 7T FN597644 99.78 903 MT872067
2-П Bacillus amyloliquefaciens, DSM 7T FN597644 100 838 MT872068
3-П Dietzia maris, DSM 43672T X79290 100 719 MT872069
6-П Kocuria polaris, CMS 76orT JSUH01000031 99.76 835 MT872071
8-П Microcella putealis, CV-2T AJ717388 100 858 MT872070
9-П Arthrobacter halodurans, JSM078085T EU583729 99.86 727 MT872072
11-П Micrococcus luteus, NCTC 2665T CP001628 100 788 MT875311
Таблица 2.

Идентификация изолятов гидролитических бактерий, выделенных на богатой среде с рН 11

Изолят Типовой штамм ближайшего родственного вида и номер в базе данных EzBioCloud Сходство генов 16S рРНК, % Количество прочтенных нуклеотидов Идентифи-кационный номер последова-тельности в GenBank
Старая карта содового шламонакопителя
3-ДБ Oerskovia paurometabola, DSM14281T AJ314821 99.86 748 MT872073
4-ДБ Brevibacterium pityocampae, DSM21720T EU484189 100 754 MT872074
5-ДБ Bacillus aequororis, M-8T KC686697 99.87 758 MT875306
12-ДБ Bacillus aequororis, M-8T KC686697 99.76 833 MT875307
13-ДБ Oerskovia enterophila, DSM 43852T MAQA01000098 100 845 MT872075
Действующее содовое шламохранилище
7-ДБ Bacillus halmapalus, DSM 8723T KV917375 99.75 813 MT872080
8-ДБ Bacillus zhangzhouensis, DW5-4T JOTP01000061 98.73 709 MT872079
9-ДБ Microcella putealis, CV-2T AJ717388 100 825 MT872081
10-ДБ Oerskovia jenensis, DSM46000T AJ314848 100 697 MT872082
16-ДБ Microbacterium kitamiense, Kitami C2T AB013919 100 802 MT872083

Таким образом, проведенные исследования в содовом шламохранилище г. Березники позволили выделить и идентифицировать гидролитические бактерии филумов Firmicutes, Actinobacteria и Proteobacteria.

В условиях умеренно-щелочной среды выделены алкалотолерантные микроорганизмы. Среди культур, изолированных из материала старого содового шламонакопителя, значительную часть составляли протеобактерии. Так, на средах с твин-80 и пептоном преобладали представители класса Alphaproteobacteria – главным образом Ensifer morelensis; Gammaproteobacteria – виды рода Pseudoxanthomonas; а также класса Bacilli (Firmi-cutes). На среде с крахмалом наблюдалось большее таксономическое разнообразие изолятов: были выделены культуры Sphingopyxis panaciterrae и Ensifer morelensis, относящиеся к классу Alphaproteobacteria; Pseudomonas peli (Gammaproteobacteria); Microcella putealis и Arthrobacter ginsengisoli (Actinobacteria); Bacillus cereus (Firmicutes, Bacilli) и Pedobacter quisquiliarum (Bacteroidetes, Sphingobacteriia).

На среде с целлюлозой, являющейся наиболее сложно метаболизируемым субстратом из используемых, выделены культуры Lysobacter prati (Gammaproteobacteria); Paenarthrobacter aurescens (Actinobacteria, порядок Micrococcales); Metabacillus indicus (Firmicutes, класс Bacilli).

Из образцов с территории действующего шламохранилища были выделены преимущественно культуры актинобактерий, порядок Micrococcales (представители родов Actinotalea, Arthrobacter, Citricoccus, Microbacterium, Microcella, Micrococcus, Paenarthrobacter), а также виды рода Bacillus.

При выделении на богатой среде при рН 11 не обнаружено существенных отличий по составу высеваемых микроорганизмов между материалом действующей и старой карты шламонакопителя. Большую часть изолятов составляли представители актинобактерий. В том числе выделены виды рода Oerskovia (Actinobacteria; Micrococcales), а также бациллы B. aequororis, B. halmapalus, B. zhangzhouensis, которые не выделялись на средах с более низким pH и являются алкалофилами.

У чистых культур, выделенных на твин-80, целлюлозе, пептоне и крахмале в качестве источника углерода, определяли соответствующую гидролитическую активность. Также проводили скрининг на наличие гидролитических активностей у культур, выделенных на богатой среде с рН 11.

Целлюлазная активность изолятов. Изученные образцы характеризовались высоким содержанием целлюлозолитических бактерий. Их максимальная численность была отмечена в грунте старого содового озера (рН 8), отобранном с глубины 5 см – 1.27 × 109 КОЕ/г. Образцы грунта прибрежной зоны действующего шламохранилища (рН 8), содержащие ризосферу растений, также характеризовались высоким количеством микроорганизмов, утилизирующих полисахариды (до 8.4 × 108 КОЕ/г). Очевидно, что их обилие связано с наличием в среде полисахаридов растительного происхождения.

На агаризованной среде Пфеннига с целлюлозой как источником углерода было выделено 11 изолятов. Первоначально проводили качественную оценку целлюлазной активности выделенных культур. Максимальная зона лизиса отмечена у изолятов 11-Ц (9 мм) и 6-Ц (10 мм). В результате секвенирования генов 16S рРНК штамм 11-Ц идентифицирован как Microbacterium pygmaeum, а штамм 6-Ц как Paenarthrobacter aurescens (табл. 1).

Был проведен скрининг изолятов, выделенных на щелочной среде с рН 11, на наличие целлюлозолитической активности. Максимальная активность целлюлазы (размер зоны просветления 8 мм) была обнаружена у изолята 13-ДБ, идентифицированного как Oerskovia enterophila (табл. 2). Значительная зона лизиса (6 мм) была отмечена у изолятов 3-ДБ и 10-ДБ, идентифицированных как O. paurometabola и O. jenensis соответственно.

Определяли активность целлюлазы в клеточной биомассе и в культуральной жидкости наиболее активных изолятов (табл. 3). В супернатанте максимальная целлюлозолитическая активность (0.49 ммоль/(л сут)) выявлена у изолята 11-Ц. Целлюлазная активность, достигающая 0.47 ммоль/(л сут), также была отмечена у образцов, выделенных из грунта старой карты содового шламохранилища. Максимальная активность целлюлазы (0.17 ммоль/(мг сут)), ассоциированной с клеточной биомассой, была выявлена у изолята 8-Ц, идентифицированного как Metabacillus indicus.

Таблица 3.

Целлюлозолитическая активность культуральной жидкости и биомассы штаммов, выделенных на селективной среде с целлюлозой

Изолят Организм Целлюлозолитическая активность
супернатант, ммоль/(л сут)/биомасса, мг/мл биомасса,
ммоль/(мг сут)
1-Ц Lysobacter prati 0.47/6.7 0.17
6-Ц Paenarthrobacter aurescens 0.41/8.9 0.10
8-Ц Metabacillus indicus 0.41/7.3 0.17
11-Ц Microbacterium pygmaeum 0.49/13.8 0.07

Амилазная активность изолятов. При скрининге изолятов, выделенных на среде с крахмалом как единственным источником углерода, у всех изученных образцов была определена амилолитическая активность. Численность микроорганизмов, утилизирующих крахмал, была максимальна в образцах грунта старой карты содового шламохранилища с глубины 5 см (рН 8) и достигала 3.31 × 109 КОЕ/г. Также значительное количество бактерий отмечено в образцах ризосферы растений из грунта прибрежной части действующего шламохранилища (рН 8).

Наибольшая активность амилазы была отмечена в образцах культуральной жидкости (табл. 4). Максимальная активность, равная 30.32 мкмоль/(л  мин), определена у изолята Ensifer morelensis 26-К. Наибольшая амилолитическая активность (20.03 мкмоль/(мг мин)), ассоциированная с клетками, установлена у культуры Paenisporasarcina quisquiliarum.

Таблица 4.

Амилолитическая активность культуральной жидкости и биомассы штаммов, выделенных на селективной среде с крахмалом

Изолят Организм Амилолитическая активность
супернатант, мкмоль/(л мин)/биомасса, мг/мл биомасса,
мкмоль/(мг мин)
3-К Ensifer morelensis 14.71/5.4 4.33
4-К Paenisporasarcina quisquiliarum 14.83/3.7 20.03
5-К Micricella putealis 11.76/3.9 14.36
6-К Actinotalea fermentans 10.98/10.3 4.51
7-К Micricella putealis 11.05/4.7 15.94
8-К Sphingopyxis panaciterrae 16.10/6.1 4.40
9-К Pedobacter quisquiliarum 17.38/5.2 12.19
10-К Arthrobacter agilis 16.11/5.8 2.36
13-К Pseudomonas peli 10.05/4.5 9.96
14-К Pseudomonas peli 10.21/5.1 11.88
19-К Bacillus vietnamensis 10.77/7.5 3.93
21-К Micricella putealis 13.19/7.5 3.06
24-К Bacillus cereus 10.58/10.8 2.21
25-К Bacillus aquimaris 10.37/7.1 4.91
26-К Ensifer morelensis 30.32/7.6 11.81
27-К Paenarthrobacter nitroquajacolicus 14.71/3.7 8.65
28-К Bacillus toyonensis 10.23/10.6 11.34
29-К Arthrobacter ginsengisoli 14.91/7.1 10.55

Высокую амилазную активность, как внеклеточную (14.7 мкмоль/(л мин)), так и ассоциированную с клетками (8.65 мкмоль/(л мин)), проявил штамм Paenarthrobacter nitroquajacolicus. Рост данного изолята наблюдали при рН 6–10 и 0.5–50 г/л NaCl. Максимальное количество жизнеспособных клеток содержала культура, выращенная с 5 г/л NaCl в среде при рН 10. Наибольшая активность амилазы отмечена при рН 6 и 50 г/л NaCl. Данный изолят может быть отнесен к экстремотолерантным микроорганизмам, т.к. была показана его способность к росту на среде с высокими рН и концентрацией соли, но оптимум роста был приближен к нормальным физиологическим условиям.

Изоляты, выделенные на щелочной среде (рН 11), также были исследованы на амилолитическую активность (табл. 5). Максимальная активность внеклеточной амилазы, отмеченная у изолята 16‑ДБ, идентифицированного как Microbacterium kitamiense, при рН 8 достигала 23.15 мкмоль/(л мин). Диапазон роста данного изолята находился в пределах рН 7–11 и 0.5–100 г/л NaCl. Максимальное количество жизнеспособных клеток и наибольшая активность амилазы (48.21 мкмоль/(л мин)) отмечены в культуре, выращенной при 5 г/л NaCl и рН 10.

Таблица 5.

Активность амилазы и липазы штаммов, выделенных на богатой среде с рН 11

Изолят Организм Амилолитическая активность Липолитическая активность
супернатант, мкмоль/(л мин)/ биомасса, мг/мл биомасса,
мкмоль/(мг мин) 		супернатант, мкмоль/(л мин)/ биомасса, мг/мл биомасса,
мкмоль/(мг мин)
3-ДБ Oerskovia paurometabola 18.91/16.5 2.96 1.15/3.7 2.37
4-ДБ Brevibacterium pityocampae 22.06/5.5 8.67 1.20/7.0 1.17
5-ДБ Bacillus aequororis 20.69/5.8 11.80 0.95/4.6 1.85
9-ДБ Microcella putealis 19.52/20.1 2.69 1.45/4.4 1.50
10-ДБ Oerskovia jenensis 20.05/6.7 11.11 1.16/5.7 1.68
12-ДБ Bacillus aequororis 19.56/6.9 7.93 1.09/4.3 1.97
13-ДБ Oerskovia enterophila 18.92/8.4 7.23 1.44/8.0 0.88
16-ДБ Microbacterium kitamiense 23.15/12.1 3.95 1.46/3.6 2.62

Культуры Bacilus aequororis и Oerskovia jenensis проявили высокую активность амилазы, ассоциированной с клетками, которая достигала 11.8 мкмоль/(мг мин).

Липазная активность изолятов. У бактериальных культур, выделенных на среде с твин-80, исследована липолитическая активность культуральной жидкости и биомассы (табл. 6). Из всех изученных образцов шламохранилища выделены изоляты, обладающие липолитической активностью. Максимальная численность микроорганизмов, достигающая 5.7 × 109 КОЕ/г, установлена в образцах техногенных поверхностных образований прибрежной зоны действующего шламохранилища. Отмечена липазная активность в культуральной жидкости 6-ти изолятов. Наибольшую активность проявил изолят, идентифицированный как Pseudomonas peli. Активность липазы, связанной с клетками, проявили 17 бактериальных культур. Высокая липолитическая активность отмечена у штаммов P. peli, а также Pseudoxanthomonas mexicana и Pseudoxanthomonas putridarboris.

Таблица 6.

Липолитическая активность культуральной жидкости и биомассы штаммов, выделенных на селективной среде с твин-80

Изолят Организм Липолитическая активность
супернатант, мкмоль/(л мин)/ биомасса, мг/мл биомасса,
мкмоль/(мг мин)
3-Т Pseudomonas peli 0.83/1.9 2.97
4-Т Sphingopyxis chelensis – 0.19
5-Т Bosea lathyri – 0.18
8-Т Bacillus aquimaris – 0.12
9-Т Metabacillus litoralis – 0.13
10-Т Exiguobacterium undae – 0.14
11-Т Ensifer morelensis – 0.18
12-Т Citricoccus zhacaieasis – 0.18
13-Т Ensifer morelensis 0.34/3.4 0.33
14-Т Pseudomonas peli 0.78/4.5 1.36
15-Т Pseudomonas peli 0.74/3.2 2.24
16-Т Pseudoxanthomonas mexicana 0.25/2.3 0.54
17-Т Pseudoxanthomonas putridae – 0.41

Изучено влияние pH и концентрации NaCl на рост наиболее перспективного изолята P. peli, проявившего активность внеклеточной и ассоциированной с клетками липазы. Было выявлено, что изолят был способен к росту при рН 7–10 и 0.5–50 г/л NaCl. Максимальное количество жизнеспособных микроорганизмов (1.2 × 106 КОЕ/г) содержала культура, выращенная на среде с 5 г/л NaCl и рН 7. Таким образом, выделенный штамм является алкалотолерантным и галотолерантным. Активность внеклеточной липазы возрастала с увеличением концентрации хлорида натрия и рН. Максимальная активность (12.59 мкмоль/(л мин)) отмечена при 100 г/л NaCl и рН 11. Наименьшую активность внеклеточный фермент проявил при рН 6.

Скрининг изолятов, выделенных на среде с пептоном, глюкозой и дрожжевым экстрактом (рН 11), показал, что все культуры обладают липолитической активностью (табл. 5). Штамм 16-ДБ, идентифицированный как Microbacterium kitamiense, обладал наибольшей активностью липазы, ассоциированной как с биомассой клеток (2.62 мкмоль/(мг мин)), так и с супернатантом (1.46 мкмоль/(л мин)). Как было отмечено выше, данный штамм также проявил максимальную амилолитическую активность.

Протеазная активность изолятов. Для выявления протеолитической активности бактерии высевали штрихом на агаризованную среду с казеинатом натрия и оценивали результаты, измеряя зону просветления, которая образуется при расщеплении казеина. Зона лизиса от края штриха для разных изолятов составляла от 1 до 12 мм. При скрининге изолятов, ранее выделенных на среде с пептоном, у всех изученных образцов была определена протеолитическая активность. Наибольшая активность (зона лизиса 12 мм) отмечена у изолята Arthrobacter halodurans. Также протеазную активность выявили у культур Micrococcus luteus (10 мм), Bacillus amyloliquefaciens (9 мм) и Microcella putealis (7 мм).

Культуры, выделенные и выращенные при рН 11, были исследованы на протеолитическую активность. Наибольшая активность протеазы (зона просветления 15 мм) установлена у Bacilus halmapalus, выделенного из грунта прибрежной части действующего шламохранилища. Изолят Oerskovia jenensis из грунта старого содового озера с глубины 5 см проявил высокую протеолитическую активность (зона просветления 10 мм). Данный изолят также характеризуется высокой активностью целлюлазы.

Таким образом, из образцов грунта, осадков и воды содового шламохранилища г. Березники на среде с селективными субстратами при рН 8 и на богатой среде с рН 11 выделены культуры алкалотолерантных и алкалофильных умеренно галофильных гидролитических бактерий, обладающих активностью амилазы, липазы, протеазы и целлюлазы. Амилазная активность культур, изолированных на среде при рН 11, была сопоставима с таковой изолятов, выделенных на селективных средах. Однако pH-зависимость ферментов этих изолятов различалась. Наибольшую активность амилазы у культур, полученных на среде с рН 11 и 8, отмечали при рН 10 и 6 соответственно. В то же время, удельная активность внеклеточной липазы изолятов P. peli, выделенных при рН 8, была наибольшей при рН 11. Этот факт можно объяснить тем, что большинство известных амилаз наиболее активны в нейтральной и кислой среде (Mc Tigue et al., 1995; Febriani et al., 2019), поэтому для поиска фермента с максимумом активности в щелочной области следует вести выделение культур в экстремально щелочных условиях. Липазы из большинства источников, в том числе липазы псевдомонад (Rios et al., 2018), более активны в щелочной среде, в результате чего для выделения из экстремальных биотопов культур со щелочными липазами может быть использована среда, близкая к нейтральной.

Выделение бактериальных культур, обладающих щелочной амилазой, представляет определенные сложности. Так, из золя щелочного кремнезема, подверженного процессам гниения, было выделено лишь 2 изолята с амилазной активностью – Acinetobacter sp. и Bacillus thuringiensis, но эта активность была невысокой (Ren et al., 2014). Ранее сообщалось о выделении щелочных амилаз из клеток алкалофильных представителей рода Bacillus (Horikoshi, 1999; Saxena et al., 2007; Kubrak et al., 2010). Нами на среде с рН 11 были выделены изоляты Bacillus aequororisi, а также виды, о которых нет упоминания как о продуцентах щелочной амилазы: Brevibacterium pityocampae, Microbacterium kitamiense, Microcella putealis, Oerskovia paurometabola, O. enterophila, O. jenensis.

Таким образом, было показано, что в содовых шламонакопителях развиваются гидролитические бактерии, адаптированные к экстремальным условиям среды. Скрининг гидролитической активности бактериальных изолятов из искусственной щелочной среды позволил выявить наиболее перспективные штаммы, обладающие как внеклеточными, так и связанными с клетками активностями амилазы (Ensifer morelensis, 30.32 мкмоль/(л мин); Paenisporasarcina quisquiliarum, 20.03 мкмоль/(мг мин); Paenarthrobacter nitroquajacolicus 14.7 мкмоль/(л мин) и 8.65 мкмоль/(мг мин)), липазы (Pseudomonas peli, 0.83 мкмоль/(л мин) и 2.97 мкмоль/(мг мин)), протеазы (Arthrobacter halodurans, 12 мм; Micrococcus luteus, 10 мм) и целлюлазы (Microbacterium pygmaeum, 0.49 ммоль/(л сут); Lisobacter prati, 0.47 ммоль/(л сут); Metabacillus indicus, 0.17 ммоль/(мг сут)). Достаточно высокая активность гидролитических ферментов у многих изолятов, выделенных из содового шламохранилища, вероятно, связана с дефицитом органического субстрата. Известно, что повышенная продукция ферментов, осуществляющих гидролиз органических полимеров и других сложных субстратов, в условиях лимитирования по источнику углерода дает экологические преимущества микроорганизмам-продуцентам. При дальнейшей селекции выделенные изоляты будут представлять интерес для биотехнологии как продуценты ферментов, устойчивых в щелочной среде с повышенной минерализацией.

Список литературы

  1. Безбородов А.М., Загустина Н.А. Липазы в реакциях катализа в органическом синтезе (обзор) // Прикл. биохимия и микробиология. 2014. Т. 50. С. 347–373.

  2. Bezborodov A.M., Zagustina N.A. Lipases in catalytic reactions of organic chemistry // Appl. Biochem. Microbiol. 2014. V. 50. P. 313–337.

  3. Блинов С.М., Максимович Н.Г., Найданова Н.Ф., Шлыков В.Г., Потапов С.С. Минералогические основы утилизации отходов ОАО “Березниковский содовый завод” // Минералогия техногенеза. 2003. Т. 4. С. 51–55.

  4. Борзенко С.В., Замана Л.В. Сульфатредукция как фактор формирования содовых вод озера Доронинское (Восточное Забайкалье) // Вестник Томского гос. ун‑та. 2008. № 312. С. 188–193.

  5. Заварзин Г.А., Жилина Т.Н. Cодовые озера – природная модель древней биосферы континента // Природа. 2000. № 2. С. 45–55.

  6. Новожилов Е.В., Пошина Д.Н. Биотехнологии в производстве целлюлозы для химической переработки (обзор) // Химия растительного сырья. 2011. № 3. С. 15–32.

  7. Рандагуруева А.А., Лаврентьева Е.В. Внеклеточная протеазная активность в природных образцах термальных источников Прибайкалья // Известия Иркутского гос. ун-та. Сер. Науки о Земле. 2009. Т. 2. № 2. С. 162–166.

  8. Шилова А.В., Максимов А.Ю., Максимова Ю.Г. Метагеномный анализ родового состава бактериальной флоры грунта, воды и осадков нового и старого шламохранилища ОАО “Сода” (г. Березники, Пермский край) // Биомика. 2018. Т. 10. № 1. С. 24–27.

  9. Шилова А.В., Максимов А.Ю., Максимова Ю.Г. Изменения микробиома как индикатор восстановления природных сред содового шламохранилища АО “Березниковский содовый завод” // Вода и экология: проблемы и решения. 2020. № 1(81). С. 81–94.

  10. Ali S.S., Habib I., Riaz T. Screening and characterization of alkaliphilic bacteria from industrial effluents // Punjab Univ. J. Zool. 2009. V. 24. P. 49–60.

  11. Anish R., Rahman M.S., Rao M. Application of cellulases from an alkalothermophilic Thermomonospora sp. in biopolishing of denims // Biotechnol. Bioeng. 2007. V. 96. P. 48–56.

  12. Atlas R.M. Handbook of Microbiological Media / Ed. Parks L.C. USA: CRC, 1993. 1079 p.

  13. Febriani, Rayyana, Ulya M., Oesman F., Akhmaloka, Iqbalsyah T.M. Low molecular weight alkaline thermostable α-amylase from Geobacillus sp. nov. // Heliyon. 2019. V. 5. e02171.

  14. Grant W.D., Sorokin D.Yu. Distribution and diversity of soda lake alkaliphiles // Extremophiles Handbook / Eds. Horikoshi K., Antranikian G., Bull A., Robb F., Stetler K. Springer-Verlag, Tokyo, 2011. P. 27–54.

  15. Gupta R., Beg Q.K., Lorenz P. Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V. 59. P. 15–32.

  16. Hasan F., Shah A.A., Javed S., Hameed A. Enzymes used in detergents: lipases // Afr. J. Biotechnol. 2010. V. 9. P. 4836–4844.

  17. Horikoshi K. Alkaliphiles: some applications of their products for biotechnology // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. V. 63. P. 735–750.

  18. Jagtap S., Rao M. Purification and properties of a low molecular weight 1,4-β-D-glucan glucohydrolase having one active site for carboxymethyl cellulose and xylan from an alkalothermophilic Thermomonospora sp. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. V. 329. P. 111–116.

  19. Kalwasińska A., Felföldi T., Szab A.J., DejaSikora E., Kosobucki P., Walczak M. Microbial communities associated with the anthropogenic, highly alkaline environment of a saline soda lime // Ant. van Leeuwenhoek. 2017. V. 110. P. 945–962.

  20. Kevbrin V.V. Isolation and cultivation of alkaliphiles // Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology / Eds. Mamo G., Mattiasson B. Springer, Cham, 2019. V. 172. P. 53–84.

  21. Kubrak O.I., Storey J.M., Storey K.B., Lushchak V.I. Production and properties of α-amylase from Bacillus sp. BKL20 // Can. J. Microbiol. 2010. V. 56. P. 279–288.

  22. Margesin R., Feller G., Hämmerle M., Stegner U., Schinner F. A colorimetric method for the determination of lipase activity in soil // Biotechnol. Lett. 2002. V. 24. P. 27–33.

  23. Mc Tigue M.A., Kelly C.T., Doyle E.M., Fogarty W.M. The alkaline amylase of the alkalophilic Bacillus sp. IMD 370 // Enzyme Microb. Technol. 1995. V. 17. P. 570–573.

  24. Oren A. Industrial and environmental applications of halophilic microorganisms // Environ. Technol. 2010. V. 31. P. 825–834.

  25. Ren L., Han Y., Yang S., Tan X., Wang J., Zhao X., Fan J., Dong T., Zhou Z. Isolation, identification and primary application of bacteria from putrid alkaline silica sol // Front. Chem. Sci. Eng. 2014. V. 8. P. 330–339.

  26. Rios N.S., Pinheiro B.B., Pinheiro M.P., Bezerra R.M., Sousa dos Santos J.C., Gonçalves L.R.B. Biotechnological potential of lipases from Pseudomonas: Sources, properties and applications // Process Biochem. 2018. V. 75. P. 99–120.

  27. Roadcap G.S., Sanford R.A., Jin Q., Pardinas J.R., Bethke C.M. Extremely alkaline (pH > 12) ground water hosts diverse microbial community // Ground Water. 2006. V. 44. P. 511–517.

  28. Sarethy I.P., Saxena Y., Kapoor A., Sharma M., Sharma S.K., Gupta V., Gupta S. Alkaliphilic bacteria: applications in industrial biotechnology // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2011. V. 38. P. 769–790.

  29. Saxena R. K., Dutt K., Agarwal L., Nayyar P. A highly thermostable and alkaline amylase from a Bacillus sp. PN5 // Biores. Technol. 2007. V. 98. P. 260–265.

  30. Sharma K.M., Kumar R., Panwar S., Kuma A. Microbial alkaline proteases: Optimization of production parameters and their properties // J. Genet. Eng. Biotechnol. 2017. V. 15. P. 115–126.

  31. Sorokin D.Y., Banciu H.L., Muyzer G. Functional microbiology of soda lakes // Curr. Opin. Microbiol. 2015. V. 25. P. 88–96.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Микробиология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал