Микробиология, 2021, T. 90, № 6, стр. 627-659

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ПЛАСТИКАХ

В настоящее время 80% применяемых пластмасс ‒ материалы на основе термопластичных полимеров, так называемых термопластов или термопластиков, состояние которых обратимо меняется с твердого на вязкое с повышением температуры. На основе примерно 10–15 разновидностей промышленных полимеров производится более 4000 марок конструкционных термопластиков (Мельникова, 2013). В рамках этого обзора мы собираемся рассмотреть характеристики пяти видов термопластиков, на которые приходится основная часть производства: полиэтилена, полипропилена, поливинилхлорида, полиэтилентерефталата и полистирола. Их основные свойства представлены в табл. 1.

Таблица 1.

Характеристики основных видов пластиков

Пластик	Структурная формула	Способ изготовления	Молекулярная масса, Да	Т плавления, °C	Т стеклования, °C	Степень кристалличности, %	Область применения
Полиэтилен низкой плотности (ПЭНП)		Полимеризация этилена при давлении 100‒288 МПа	80 000‒500 000	103‒110	‒50‒120	50‒60	Упаковочные материалы, пленка, тара; трубы для канализации, дренажа, водо- и газоснабжения; электроизоляционный материал; термоклей; корпуса для лодок, вездеходов, деталей технической аппаратуры, предметов домашнего обихода; термоизоляция; полигоны переработки отходов, накопители жидких и твердых веществ, способных загрязнять почву и грунтовые воды (ПЭВП)
Полиэтилен высокой плотности (ПЭВП)		Полимеризация этилена при давлении 0.1‒0.495 МПа	80 000‒300 000	130‒137	‒50‒120	75‒85
Полипропилен (ПП) изотактический		Полимеризация пропилена	300 000‒700 000	172	‒10	73‒75	Упаковочные материалы, пленки, волокна, тара, трубы, детали технической аппаратуры, пластиковая посуда, предметы домашнего обихода, нетканые материалы электро-, вибро- и шумоизоляция, строительный клей, замазки, уплотняющие мастики, дорожные покрытия, липкие ленты, лабораторное оборудование (наконечники для пипеток и центрифужные пробирки)
Поливинил- хлорид		Полимеризация винилхлорида	9000‒170  000	150‒220	75‒80	<10	Электроизоляция проводов  и кабелей, строительные материалы (листы, трубы, оконные рамы, плeнки для натяжных потолков, линолеум), искусственная кожа, обувные пластикаты, мебельная кромка, моющеся обои, “виниловые” грампластинки
Полиэтилен- терефталат (ПЭТ)		Поликонденсация этиленгликоля с терефталевой кислотой или переэтерификация диметилтерефталата и этиленгликоля	15 000‒20 000	260	69‒70	2.1‒65	Волокно, в том числе для одежных тканей, материал для армирования автомобильных шин и других резинотехнических изделий, тара для напитков и пищевых продуктов, прозрачный строительный материал
Полистирол (ПС)		Полимеризация стирола (винилбензола) в среде бензола	50 000‒300 000	240	100	30‒35	Одноразовая посуда, детские игрушки, строительные материалы, медицинcкие инструменты, чашки Петри

Источники: Мельникова, 2013; Брацыхин, Шульгина, 1982; Химия и технология синтетических высокомолекулярных соединений, 1967; Lohse, 2000; Modern Polyesters: chemistry and technology, 2003; Бартнев, Френкель, 1990; Сажин и соавт., 1986).

Около 90% объема производства термопластов составляют материалы на основе полиолефинов (полиэтилены, полипропилен), полистиролы, поливинилхлориды; они выдерживают постоянные внешние напряжения до 10–15 МПа и температуры до 80 ± 20°С. Около 9% объема производства составляют материалы на основе полиэтилентерефталата, полиамидов, поликарбоната, полиформальдегида и др. Более прочные и термостойкие, они выдерживают разрушающее напряжение до 140 ± 20 МПа и температуры до 150°С (Мельникова, 2013).

Мономером полиэтилена (ПЭ) является этилен. В зависимости от метода получения производят несколько типов полиэтилена: полиэтилен низкой плотности (ПЭНП), полиэтилен высокой плотности (ПЭВП), сверхвысокомолекулярный полиэтилен (СВМПЭ). ПЭНП отличается сильно разветвленными цепями со степенью полимеризации ~50 000, плотностью 910‒935 кг/м³ и степенью кристалличности 50‒60%. ПЭВП представляет собой плотный полимер, молекулы которого линейны и степень полимеризации составляет до 300 000, с плотностью 930‒970 кг/м³ и степенью кристалличности 70‒85% (Галыгин и соавт., 2012). Основной причиной, вызывающей различия в свойствах ПЭНП и ПЭВП, является разветвленность макромолекул: чем больше разветвлений в цепи, тем выше эластичность и меньше кристалличность полимера. Полиэтилены как низкой (ПЭНП), так и высокой плотности (ПЭВП) широко используются и востребованы практически на всех промышленных, сельскохозяйственных или бытовых рынках, главным образом, для упаковки товаров. Доля СВМПЭ в общей продукции чрезвычайно мала, но он заслуживает упоминания как весьма интересный материал, находящий все большее применение. СВМПЭ получают на металлоорганических катализаторах, его молекулярная масса более от 1.5 до 8 млн Да. Он обладает исключительной прочностью, морозостойкостью, физиологически инертен: применяется для изготовления высокопрочных технических изделий, таких как броня. СВМПЭ применяется в эндопротезировании; он также обладает исключительно низким коэффициентом трения и используется для производства искусственных “ледовых” покрытий (Захаров и соавт., 2009; Кудряшовa, 2020) .

Полипропилен (ПП) также относится к полиолефинам, то есть линейным углеводородам c общей формулой C_nH_2n. Это высокомолекулярный продукт полимеризации пропилена при низком и среднем давлении 0.3–10 МПа и температуре 80°С на стереоспецифических катализаторах Циглера‒Натта. В промышленности для производства пропилена используют продукты переработки нефти, а также природные углеводородные газы. В зависимости от способа полимеризации образуются полимеры разного стереоизомерного состава. Изотактический и синдиотактический полимеры имеют регулярно построенные цепи, располагающиеся вдоль спирали, а для атактического пластика характерна структура со стерически нерегулярной последовательностью метильных групп (Arutchelvi et al., 2008). Полипропилен – менее плотный и более твердый, чем полиэтилен, пластик, широко использующийся для производства упаковочных материалов, разнообразных товаров широкого потребления, нетканых материалов (в том числе медицинских масок), лабораторного оборудования (наконечников для пипеток и микроцентрифужных пробирок).

Поливинилхлорид (ПВХ) получают путем полимеризации винилхлорида; ему свойственна высокая химическая стойкость (устойчивость при воздействии щелочей, многих кислот и органических растворителей). Этот полимер состоит из линейных или малоразветвленных макромолекул. При низкой морозостойкости (‒15°С) ПВХ является хорошим диэлектриком и находит широкое применение при изготовлении кабелей и изоляционных материалов; его используют также в производстве труб, линолеума, оконных рам, натяжных потолков и многого другого. ПВХ непосредственно для изготовления изделий не используется. Изделия изготавливают из композиционных материалов на его основе: винипласта и пластиката. Они содержат термостабилизаторы, смазки, пигменты или красители, минеральные наполнители, эластомер; пластикат к тому же содержит 30–90 массовых частей пластификатора (например, эфиров фталевой, фосфорной, себациновой или адипиновой кислот). Эти материалы используются для изготовления химической аппаратуры и коммуникаций, вентиляционных воздуховодов, труб, строительных деталей. Из прозрачного винипласта изготовляют объемную тару для пищевых продуктов, бутылки и др. Пластикат используют для изготовления изоляции и оболочек для электропроводов и кабелей, для производства шлангов, линолеума и плиток для полов, материалов для облицовки стен и обивки мебели, искусственной кожи. Прозрачные гибкие трубки из пластиката применяют в системах переливания крови и жизнеобеспечения в медицинской технике (Мельникова, 2013).

Полиэтилентерефталат (ПЭТ) представляет собой cложный эфир – продукт поликонденсации этиленгликоля с терефталевой кислотой или переэтерификации диметилтерефталата и этиленгликоля. Структура ПЭТ состоит из линейных алифатических и ароматических фрагментов. Такое чередование кристаллических и аморфных участков обеспечивает основные свойства ПЭТ: твердость и ударопрочность, прозрачность, крайне низкую газопроницаемость, водопоглощение и пластичность в холодном и нагретом состояниях (Шевлик и соавт., 2016). ПЭТ устойчив в диапазоне температур от ‒40 до 60°С, отличается низким коэффициентом трения и низкой гигроскопичностью. Разлагается под действием УФ-излучения (Мельникова, 2013). Основным промышленным способом получения ПЭТ является использование нефтехимических продуктов. Высокая прочность и износостойкость ПЭТ объясняются высоким содержанием ароматических терефталатных звеньев, которые ограничивают подвижность полимерных цепей (Marten et al., 2005). ПЭТ широко используется для производства тары для жидкостей и других продуктов широкого пользования, волокон и тканей (одежда).

Полистирол (ПС) – это синтетический полимер, состоящий из молекул ароматического углеводорода стирола. Химическая формула полистирола (C₈H₈)_n; из химических элементов он включает только углерод и водород. Степень полимеризации промышленно выпускаемых полистиролов n = 600‒2500. Фенильные группы препятствуют упорядоченному расположению макромолекул и формированию кристаллических образований. Полистирол является гомополимером с молекулярной массой 100 000–400 000 г/моль. Его трудно деполимеризовать, так как вновь образованная σ‑связь “углерод‒углерод” прочнее, чем π-связь винильной группы. На свойства пластика влияет характер расположения фенильных групп относительно зигзагообразной углеродной цепи. Полистирол ‒ жесткий хрупкий аморфный полимер с высокой степенью оптического светопропускания и невысокой механической прочностью. Полистирол имеет низкую плотность (1060 кг/м³), отличные диэлектрические свойства и хорошую морозостойкость (до −40°C). Стандартный коммерческий полистирол является атактическим, в котором фенильные группы случайным образом расположены по обеим сторонам полимерной цепи. Такое случайное расположение предотвращает образование кристаллических участков, и полимер является аморфным с температурой стеклования T_g около 90°C. Из полистирола изготавливают одноразовую посуду, упаковки, одноразовое лабораторное оборудование (чашки Петри), медицинские инструменты и стройматериалы.

Таким образом, все перечисленные пластики широко используются в самых различных областях деятельности человека. Несмотря на разные строение и структуру, их объединяет общее свойство: устойчивость к внешним воздействиям, в том числе и к биологическим факторам. Тем не менее, сейчас достоверно известно, что достаточно большое количество микроорганизмов способно разрушать пластики, используя их компоненты в качестве энергетических субстратов и источника углерода. Однако нерастворимость субстратов, крайне низкая скорость процессов, нестандартизированный состав пластиков, различная форма образцов заставляет исследователей использовать разнообразные методы детекции и количественной оценки процесса микробной деструкции пластиков.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРОБНОГО РАЗЛОЖЕНИЯ ПЛАСТИКОВ

Все рассматриваемые в этом обзоре наиболее широко используемые пластики нерастворимы в воде. Взаимодействие микроорганизмов с субстратом происходит на границе раздела фаз, и поэтому их биодеградации предшествует образование биопленок. Роль биопленок в разложении биопластиков подробно рассмотрена в недавнем обзоре В.К. Плакунова и соавт. (2020). Также ряд работ посвящен анализу микробного состава биопленок, образующихся на поверхности образцов различных видов пластика при инкубации их в природных местообитаниях. Так, например, был проанализирован состав биопленок, развивавшихся на образцах ПС во время их инкубации в воде Черного моря и оборотной воде нефтехимического производства в течение 60 сут, и выявлена его специфичность к материалу образцов (Турова и соавт., 2020). Одновременно было отмечено изменение состояния ПС (Лаптев и др., 2019).

Существует два принципиально разных подхода к исследованию процесса разложения пластика микроорганизмами: 1) тестирование чистых культур на способность к разложению пластика; 2) инкубация образцов пластика в присутствии природных проб или непосредственно в природных местообитаниях – почве, компосте, мусорных полигонах, воде или осадках водоемов. В последнем случае упор делается на естественный отбор штаммов, обладающих искомыми активностями.

Собственно процесс биодеградации пластиков предлагается разделить на четыре этапа (Sharma, 2018; Montazer et al., 2019):

1) биодетериорацию, состоящую в изменении свойств полимера и облегчающую его дальнейшее разложение;

2) биофрагментацию, которая приводит к гидролизу и фрагментации углеродных цепей полимера, а также к выделению промежуточных продуктов разложения;

3) биоассимиляцию, при которой мелкие углеводородные фрагменты-метаболиты метаболизируются клетками и включаются в биомассу микроорганизмов;

4) минерализацию, которая сопровождает полное разрушение пластика до СО₂ и воды.

Для каждого из этапов существует набор методов, позволяющих достоверно зарегистрировать происходящие с пластиком изменения. Основные методы детекции микробной биодеградации пластиков представлены в табл. 2.

Первичную информацию об изменениях, происходящих на поверхности пластика, можно получить с помощью различных видов микроскопии. Наиболее часто используется сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) отмытых от клеток образцов, в сравнении с контрольными образцами, инкубировавшимися в отсутствие микроорганизмов. Может быть использована атомно-силовая микроскопия и другие подходы, позволяющие изучить поверхность полимера. Используются и другие методы, позволяющие определить изменения в структуре пластика, например, проверка образцов пластика, инкубированных в присутствии микробных культур, на изменение его механических свойств (прочность на разрыв, удлинение при разрыве, модуль упругости и предел текучести).

Биофрагментация регистрируется по уменьшению средней молекулярной массы углеродных цепей полимера (M_n) и расширению молекулярно-массового распределения, определяемых с помощью гель-проникающей хроматографии, а также путем регистрации промежуточных продуктов разложения пластика, для чего используются спектрофотометрия, ГХ-МС, ВЭЖХ, ИК-спектроскопия с преобразованием Фурье и ядерный магнитный резонанс. В частности, ИК-спектроскопия (FTIR, Fourier-transform infrared spectroscopy) позволяет получить данные о содержании в образце различных связей между атомами, таких как С‒С, С‒Cl, С‒О, С=О и т.д. Изменение спектра может свидетельствовать о процессах окисления, дехлорирования (в случае ПВХ), разрушения цепей полимера. Термогравиметрический анализ позволяет оценить термостабильность пластика, которая теоретически будет снижаться при уменьшении и разрыве цепей полимера, но увеличиваться при разрушении или вымывании пластификаторов.

На этом и последующих этапах используется также наиболее прямой метод определения разложения пластика микроорганизмами – гравиметрический, для чего образцы пластика должны быть тщательно отмыты от ассоциированных с ними клеток.

Для некоторых пластиков, например, для ПЭТ, может быть использован ряд спектрофотометрических методов, основанных на обнаружении изменения оптической плотности культуральной жидкости, как напрямую, вследствие образования соединений, поглощающих свет, так и с применением индикатора, реагирующего на изменения pH (Pirillo et al., 2021).

Биоассимиляция пластика определяется по увеличению выхода биомассы клеток в культуре, растущей в присутствии пластика, например, по определению количества образовавшегося клеточного белка в сравнении с контролем.

Наконец, минерализация пластика определяется по количеству образовавшегося СО₂ или, в случае анаэробного процесса, продуктов терминальных восстановительных реакций ‒ СН₄, H₂S, восстановленных соединений азота и пр.

В качестве вспомогательного метода, позволяющего провести скрининг изолятов, можно использовать тест на чашке с агаром, в котором полимер диспергируется в виде взвеси очень мелких частиц (порошка). Вокруг колонии микроорганизма, разрушающего пластик, образуется зона просветления.

Наконец, высокоточным методом является использование пластиков, меченых ¹⁴С-радиоактивными изотопами (Silelicki et al., 1978), и определение метки в образовавшихся продуктах ‒ ¹⁴CO₂ или ¹⁴CH₄. На этот метод не влияет присутствие биоразлагаемых примесей или добавок в полимере, однако его применение ограничивается сложностью проведения и стоимостью синтеза радиоактивно меченых полимеров.

Как правило, исследователи используют комплекс методов (Müller, 2005; Lucas et al., 2008; Ru et al., 2020), позволяющих зафиксировать изменения полимера, состояние микробной культуры, образование промежуточных или конечных продуктов разложения пластика.

ПРИМЕРЫ БИОДЕГРАДАЦИИ ПЛАСТИКОВ МИКРООРГАНИЗМАМИ

Несмотря на трудоемкость исследований и сложность получения достоверных результатов, в последние два десятилетия появилось большое количество экспериментальных работ, демонстрирующих микробную деградацию пластиков с помощью перечисленных в предыдущем разделе методов. Здесь мы приведем лишь некоторые из них.

Так, биодеградация полиэтилена микроорганизмами была описана в ряде работ, опубликованных за последние 30 лет, и сейчас является одной из основных тем исследований в области разложения пластиков (Shah et al., 2008; Ammala et al., 2011; Sen, Raut 2015; Harrison et al., 2018); общепризнанным является тот факт, что процесс биодеградации в нормальных условиях протекает чрезвычайно медленно. Известно, что ПЭ, имеющий простую линейную структуру, чрезвычайно устойчив к биоразложению. Низкая скорость биоразложения ПЭ связана также с его высокой гидрофобностью (в состав молекул входят только ‒CH₂ группы) и высокой молекулярной массой (более 30 кДа), что препятствует его транспорту непосредственно в клетки (Orr et al., 2004; Sivan et al., 2006). Было показано, что в случае, когда ПЭ был единственным источником энергии для микроорганизмов, фрагменты меньшего размера использовались быстрее, чем более крупные (Kawai et al., 2004). Также сообщалось, что для достижения значимой степени биоразложения за разумный период времени средняя молекулярная масса полиэтилена должна быть ниже 5000 Да (Reddy et al., 2009). Разветвленная структура делает цепи ПЭНП более доступными, а третичные атомы углерода в местах разветвления ‒ более уязвимыми для атаки. Молярная масса ПЭВП намного выше, что, возможно, затрудняет доступ микроорганизмов и их ферментов к полимерным цепям (Sudhakar et al., 2008; Fontanella et al., 2010). Показано, что структурные вариации полиэтиленовых полимеров, образующиеся во время полимеризации и последующей обработки, такие как ненасыщенные двойные углерод-углеродные связи, карбонильные группы и гидропероксидные группы (Ojeda et al., 2011), первыми потребляются бактериями, что приводит к быстрому росту микроорганизмов. Если для первых двух этапов, биоразрушения (биодетериорации) и биофрагментации ПЭ, было приведено достаточно фактов и доказательств их именно микробного происхождения (Albertsson, Karlsson, 1990; Ammala et al., 2011), то доказательства биоассимиляции и полной минерализации ПЭ весьма немногочисленны (Yang et al., 2014; Sen, Raut, 2016; Montazer et al., 2019).

В табл. 3 приведены примеры исследования разложения ПЭ, представленные в различных публикациях. Из-за большого разнообразия используемых полиэтиленовых материалов и широкого диапазона условий культивирования сравнение различных результатов биодеградации зачастую весьма затруднено. Это подчеркивает необходимость стандартизированных методов и протоколов для систематического изучения биоразложения синтетических пластмасс, как это было предложено Montazer и соавт. (Montazer et al., 2020).

О процессе деградации полипропилена известно очень мало. Очевидно, однако, что длинные молекулы, высокоупорядоченная структура, отсутствие групп, доступных для окисления, а также наличие боковой метильной группы затрудняют деградацию ПП (Jeon, Kim, 2016). Как правило, при инкубации образцов ПП с микроорганизмами отмечают уменьшение массы пластика, однако значения могут варьировать от 0.43% за 12 мес. (Arkatkar et al., 2009) до 6.4% за 40 сут (Auta et al., 2018) для чистого ПП и бактериальных культур, и от 1.4% за 3 мес. (Sheik et al., 2015) до 18% за 12 мес. для ПП, содержащего катализатор, и культур различных микромицетов ‒ Phanerochaete chrysosporium, Engyodontium album (Jeyakumar et al., 2013). Биоразложение ПП оценивают по образованию биопленок, увеличению содержания белка или АТФ в культуре по сравнению с контролем без пластика, по уменьшению молекулярной массы полимера, увеличению степени гидрофильности поверхности, изменению ИК-спектров.

Проблема изучения биодеградации отходов поливинилхлорида (ПВХ) связана с высоким содержанием в типичных бытовых изделиях из этого материала различных добавок: пластификаторов, термостабилизаторов, антипиренов, биоцидов, доля которых может доходить до 50‒75%. Хорошо известна способность многих микроорганизмов расти на питательных средах с пластификаторами в качестве единственного источника углерода и энергии (Berk et al., 1957; Booth et al., 1968; Webb et al., 2000; Nakamiya et al., 2005; Sabev et al., 2006; Das et al., 2012). Поэтому снижение веса пластика под воздействием микроорганизмов, или изменение таких физических свойств как гибкость и прочность на разрыв может быть связано не столько с разрушением цепей ПВХ, сколько с уменьшением доли добавок (Luzia et al., 2020; Ru et al., 2020). Решить эту проблему можно либо используя чистый порошок ПВХ (Wu et al., 2017) или пластинки чистого ПВХ, получаемые исследователями в лаборатории растворением коммерческого препарата в тетрагидрофуране (Kirbas et al., 1999; Ali et al., 2014; Khatoon et al., 2019), либо прибегая к дополнительным методам анализа. Среди них наиболее часто применяют ИК-спектроскопию, термогравиметрический анализ и гель-проникающую хроматографию (Raddadi, Fava, 2019).

Высокая прочность и износостойкость ПЭТ объясняются высоким содержанием ароматических терефталатных звеньев, которые ограничивают подвижность полимерных цепей (Marten et al., 2005) и делают ПЭТ чрезвычайно устойчивым к микробной деградации (Andredy, 1994; Zheng et al., 2005; Müller, 2006; Tokiwa et al., 2009). Степень кристалличности таких синтетических полимеров, которая обычно превышает 30‒40% (Liu et al., 2004; Lee et al., 2013), а также гидрофобность поверхности в значительной степени влияют на их биоразлагаемость, так как воздействие ферментов микроорганизмов происходит, прежде всего, на аморфные участки пластика и имеет наиболее важное значение при первичной адгезии потенциальных деструкторов (Urgun-Demirtas et al., 2007; Wang et al., 2016).

Несмотря на аморфность полистирола, действие ферментов на полимер крайне затруднено, поскольку его молекулы имеют высокую молекулярную массу и неполярны, а сам полимер нерастворим в воде (Motta et al., 2009). Кроме того, боковые фенильные группы, неупорядоченно распределенные в пространстве, очень устойчивы к биоразложению (Atlas, Barta, 1987). Сведения о микробном разрушении ПС противоречивы. Так, ряд исследователей считает, что полистирол устойчив к действию микроорганизмов. Например, выделенные из почвы чистые культуры Microbacterium sp. NA23, Paenibacillus urinalis NA26, Bacillus sp. NB6, Pseudomonas aeruginosa NB26 не показали активности по отношению к пленке ПС в течение 8 мес. (Atiq et al., 2010), а лист ПС, закопанный в почву на 32 года, не имел признаков деградации (Otake et al., 1995). Другие исследователи отмечают, что полистирол разрушается микроорганизмами очень медленно, так как на 75% состоит из ароматических соединений и имеет высокую молекулярную массу. Гидрофобный характер ПС способствует его устойчивости к гидролизу, а также влияет на способность микроорганизмов прикрепиться к его поверхности. Высокая молекулярная масса и плохая растворимость в воде не позволяют микробным клеткам транспортировать ПС через клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану для метаболизма. Образуемые микроорганизмами экзоферменты не могут проникнуть внутрь полимера и действуют на поверхности. В исследованиях по биодеградации ПС чаще всего применяются визуальные наблюдения за изменениями поверхности образца и его цвета, а также за появлением и развитием микробных биообрастаний с использованием флуоресцентной (для оценки жизнеспособности микробных клеток) и сканирующей электронной микроскопии; гравиметрия; детекция образовавшихся интермедиатов путем спектрофотометрии (для ароматических соединений), газовой хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и инфракрасной спектроскопии Фурье; оценка потребления и выделения газов.

Таким образом, несмотря на большие методические сложности, ряд разработанных специально для решения задачи разложения пластика методов позволяет достоверно продемонстрировать процесс деструкции основных видов пластиков, осуществляемых бактериями и грибами. Аналогичная информация об участии в этих процессах архей пока отсутствует. К сожалению, из-за различий между используемыми субстратами, а также формы образцов (пленки, порошок, гранулы и пр.) результаты невозможно сравнивать между собой. Очередной задачей исследователей является создание единого протокола исследования разложения пластиков, который должен будет решить эту задачу.

РАЗНООБРАЗИЕ СВОБОДНОЖИВУЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИХ ПРОЦЕСС БИОДЕГРАДАЦИИ ПЛАСТИКОВ

Несмотря на то, что процесс разложения пластиков идет очень медленно, способность осуществлять его была найдена у многих бактерий и микромицетов.

Микроорганизмы, разлагающие ПЭ и другие виды пластика, чаще всего выделяли из почвы, мусорных полигонов, компоста, морской воды и активного ила (Montazer et al., 2020). Так, описана биофрагментация и использование в качестве источника углерода и энергии ПЭНП, не подвергавшегося предварительной обработке, штаммами Pseudomonas putida, Acinetobacter pittii и Micrococcus luteus (Montazer et al., 2019). Процесс сопровождался образованием алканов и накоплением в клетках биоразлагаемых полимеров – полигидроксиалканоатов. Известно более чем 20 родов бактерий, для которых показана возможность биодеградации различных типов ПЭ (Ghatge et al., 2020). Бактерии, способные к разложению ПЭ, и скорости осуществляемого процесса представлены в табл. 2. Способность разлагать ПЭ была обнаружена также у грибов родов Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Gliocladium, Mortierella, Mucor, Penicillium, Zalerion (El-Shafei et al., 1998; Yamada-Onodera et al., 2001; Volke-Sepúlveda et al., 2002; Bonhomme et al., 2003; Manzur et al., 2004; Koutny et al., 2006; Hasan et al., 2007; Ahebnazar et al., 2010; Nowak et al., 2011; Pramila, Ramesh, 2011; Sheik et al., 2015; Paco et al., 2017). Грибы обладают мощной ферментативной системой и способностью выживать в жестких условиях окружающей среды при низком содержании питательных веществ и влаги. Помимо этого, они обладают способностью широко распространять гифы, которые могут проникать в трещины и углубления в пластике (Jeyakumar et al., 2013).

Для бактерий родов Bacillus spp. (Sudhakar et al., 2008; Abrusci et al., 2013), Rhodococcus spp. (Bonhomme et al., 2003; Gilan et al., 2004; Fontanella et al., 2010) и Pseudomonas spp. (Rajandas et al., 2012), а также для грибов родов Aspergillus и Fusarium (Hasan et al., 2007; Sahebnazar et al., 2010), была показана деполимеризация ПЭ после различных видов предварительной обработки, такой как ультрафиолетовое облучение (УФ) и/или термическая обработка, которая делает углеродные цепи полимера чувствительными к биоразложению (Ammala et al., 2011).

Сообщения об успешной микробной деградации полипропилена весьма немногочислены. Так, было показано, что консорциум бактерий (Aneurinibacillus aneurinilyticus, Brevibacillus sp., B. agri, and B. brevi), выделенных из водоочистных сооружений и мусорных полигонов, за 140 сут инкубации при 50°С уменьшил массу ПП-гранул на 44%, а пленок ‒ на 56% (Skariyachan et al., 2008). Гравиметрические показатели были подтверждены данными ИК-спектроскопии Фурье, СЭМ и рядом других методов. Рост на минеральной среде с ПП как единственным источником углерода и энергии, сопровождавшийся уменьшением массы ПП, был показан для Bacillus cereus и Sporosarcina globispora (Auta et al., 2017). Однако основная часть положительных результатов по микробной деградации ПП была получена в результате предобработки пластика и будет освещена ниже.

Исследование способности грибов и бактерий к разложению ПВХ оказалась затруднена присутствием в этом пластике пластификаторов, которые могут являться истинными субстратами растущих на ПВХ микроорганизмов (Kirbas et al., 1999; Webb et al., 2000; Peciulyte, 2002; Sabev et al., 2006). В опытах с чистым ПВХ была продемонстрирована активность Phanerocheate chrysosporium, Lentinus tigrinus, Aspergillus niger и A. sydowii, подтвержденная увеличением биомассы грибов, выделением СО₂ и сканирующей электронной микроскопией образца (Ali et al., 2014). Авторы продемонстрировали рост гриба на среде с пластиком, снижение массы лишенного пластификаторов и примесей полимера на 31% за 2 мес., минерализацию (к четвертой неделе выделение СО₂ составило 13.74 мг/л), а также сопутствующее росту биомассы усиление активности пероксидазы. Источником грибов, способных разлагать ПВХ, может быть загрязненная этим пластиком почва. Недавно было показано, что подобные условия привели к селекции штаммов Mucor sp. и Penicillium sp., способных расти на среде с ПВХ и, основываясь на результатах ИК-спектрометрии, вызвать частичное разрушение пластика (Pardo-Rodríguez, Zorro-Mateus, 2021).

Бактерий, участвующих в повреждении изделий из ПВХ, начали изучать одновременно с грибами. В одной из первых работ выделенные с поверхности пластиковых изделий представители родов Pseudomonas, Brevibacterium и Achromobacter в лабораторных условиях снижали на 20% вес и уменьшали гибкость ПВХ с пластификатором ди-изо-октилсебацинатом (Booth et al., 1968). Тем не менее, работ о воздействии бактерий на ПВХ значительно меньше, чем о воздействии грибов, и многие из имеющихся связаны с утилизацией пластификаторов. Наибольший интерес представляет исследование биодеградации пленок ПВХ культурами Bacillus flexus и Pseudomonas citronellolis. Обе культуры за 45 сут инкубации вызвали фрагментацию пленок ПВХ, изменение данных ИК-спектроскопии, уменьшение термостабильности и снижение M_n примерно на 10%, а P. citronellosis вызывал уменьшение гравиметрического веса образцов ПВХ нa 19% в течение 30 сут (Giacomucci et al., 2019). Авторы отмечают, что используемые ими пленки содержали до 30% различных добавок (цитраты, адипаты и полиадипаты, эпоксидированное соевое масло, Zn), и полученные результаты позволяют предполагать разрушение как цепей полимера, так и добавок. Искусственный консорциум из Pseudomonas otitidis, Bacillus aerius, B. cereus и Acanthopleurobacter pedis вносили в экспериментальные образцы почвы с погруженными в нее пластиковыми пленками (Anwar et al., 2016). По сравнению с контрольными почвенными образцами добавление консорциума не только привело к значительному повреждению поверхности пластика (данные СЭМ) и изменению профилей ИК- и УФ-спектроскопии, но также к снижению M_n на 78.5% (с 72.65 до 15.63 кДа за 9 мес.; до 66.61 кДа в контроле), что указывает на разрушение цепей полимера. Этот исключительный результат сильно выбивается из результатов аналогичных работ и требует дополнительного подтверждения.

Разложением ПЭТ занимаются много и активно, и наиболее выдающиеся результаты, достигнутые с помощью использования ПЭТ-разлагающих ферментов, будут изложены в соответствующем разделе обзора. Нельзя не упомянуть, однако, наиболее известный микроорганизм, эффективно разлагающий ПЭТ – Ideonella sakaiensis (Yoshida et al., 2016). I. sakaiensis вызывает практически полную дегредацию пленок PЭТ за 6 нед. инкубации при 30°С. Однако основными источниками ферментов, разлагающих ПЭТ, в настоящее время являются термофильные актинобактерии, выделяемые из компоста и развивающиеся при температуре 50‒60°С, способствующей деградации полимерного субстрата, – Thermomonospora fusca (Kleeberg et al., 1998), Thermobifida alba (Hu et al., 2010), Saccharomonospora viridis (Kawai et al., 2014), Thermomonospora kurvata (Wei et al., 2014).

Данных по разложению полистирола микроорганизмами довольно много, но они противоречивы и трудно поддаются сравнению из-за различий в структуре полимера и разных методов детекции его разложения. Так, при том, что большинство клеток Rhodococcus ruber прикрепилось к субстрату (ПС) в течение нескольких часов, 0.8% снижение массы полимера было отмечено лишь после 8 нед. культивирования (Mor, Sivan, 2008). Из проб, полученных с полей орошения в Индии, были выделены два штамма бактерий Exiguobacterium sibiricum и Exiguobacterium undae, способных использовать твердый прозрачный ПС и гранулы ПС как источник углерода и энергии (Chauhan et al., 2018). С помощью атомно-силовой микроскопии было показано, что поверхность становится более шероховатой, что приводит к снижению ее гидрофобности. ИК-спектроскопия Фурье показала, что образуются окисленные группировки в молекулах, а гравиметрия подтвердила убыль массы ПС на 0.4% за 30 сут. Однако штамм Bacillus paralicheniformis, выделенный из Аравийского моря, был способен разрушать 34% по массе пленки ПС за 60 сут (Kumar et al., 2021). Для грибов рода Curvularia было показано, что гифы “прилипают” к поверхности атактического полистирола и проникают в нее; при этом потеря массы составила 2‒5% за 2‒3 мес. (Motta et al., 2009). При инкубации Enterobacter sp., Citrobacter sedlakii, Alcaligenes sp., Brevundimonas diminuta с ПС как единственным источником углерода и энергии показали до 12% убыли субстрата за месяц. Установлено, что грибы бурой гнили Gloeophyllum striatum и Gloeophyllum trabeum способны атаковать ПС с помощью реакций Фентона при участии гидрохинона, при этом после 20 сут инкубации происходит существенная деполимеризация ПС и снижение молекулярной массы почти на 50% (Krueger et al., 2015). Факт биодеградации лигнополистирола грибами белой гнили Pleurotus ostreatus, Phanerochaete chrysosporium и Trametes versicolor был отмечен еще в 1992 г. (Milstein et al., 1992). Восьминедельная инкубация Cephalosporium sp. с ПС привела к потере массы пластика на 2.17 ± 0.16%, а с Mucor sp. ‒ на 1.81 ± 0.13%, что было дополнительно подтверждено регистрацией изменений поверхности ПС от гладкой к шероховатой, снижением рН среды, появлением интермедиатов и снижением молекулярной массы (Chaudhary et al., 2019).

Наряду с исследованием чистых культур, микробное разложение ПС исследовалось и для природных ассоциаций микроорганизмов. Присутствие ПС вызывало сукцессию микробного сообщества активного ила в аэробных и анаэробных условиях (Wei et al., 2020). Микроорганизмы активного ила образовывали на кубиках ПС биопленки, увеличивающиеся с первой по девятую недели инкубации. Сканирующая электронная микроскопия и рентгеноспектроскопия выявили изменения в структуре ПС, а ИК-спектроскопия с преобразованием Фурье показала появление в среде интермедиатов неизвестного состава. При добавлении двух типов меченого изотопом ¹⁴C полистирола (α- и β-¹⁴C) к почве и активному илу сточных вод оказалось, что через 8 нед. только 0.01% ПС окислился до ¹⁴CO₂, а через 75 сут общий уровень конверсии составил 0.7% (Giullet et al., 1974). Невысокие активности зафиксированы при деградации ¹⁴C-ПС смешанными культурами 17 штаммов лигнинразрушающих грибов, а также микробными сообществами ила, различных почв, навоза и мусорной свалки (от 0.04 до 3.0% за 16 нед.) (Sielicki et al., 1978; Kaplan et al., 1979). Существенно более высокие скорости деградации пенополистирола выявили в образцах с мусорной свалки Саримукти, Индонезия, где убыль массы пеноПС за 7 нед. инкубации составила 18.23% (Hidayat et al., 2020). СЭМ показала образование пор на поверхности пластика, а ИК-спектроскопия Фурье подтвердила образование более простых функциональных групп в молекулах и появление C‒O-групп. Предполагается, что в разложении пенополистирола участвовали бактерии родов Pseudomonas и Bacillus.

МИКРООРГАНИЗМЫ-СИМБИОНТЫ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ, РАЗЛАГАЮЩИЕ ПЛАСТИК

Известно, что ряд беспозвоночных животных может потреблять пластики, и в последние годы интерес к этому явлению, а также к микробиомам кишечника этих организмов резко возрос. Первое упоминание о том, что некоторые насекомые могут оставлять отверстия в полиэтиленовой упаковке относится к 2007 г. (Riudavets et al., 2007). Позднее из кишечника Plodia interpunctella (южной амбарной огнeвки) были выделены штаммы Enterobacter asburiae и Bacillus sp., способные разрушать ПЭ в виде пленки за 60 сут на 6 и 10% соответственно, с уменьшением молекулярного веса остаточного ПЭ.

Описана способность личинок большой восковой моли Galleria mellonella быстро разлагать полиэтилен (убыль массы составила 13% за 14 ч) с образованием этиленгликоля (по данным Фурье-инфракрасной спектроскопии). Из кишечника личинок G. mellonella был выделен штамм Enterobacter sp., вызывающий изменения физических и химических свойств пленки ПЭ, зарегистрированные методами Фурье-инфракрасной спектроскопии, ЖХ-MС, СЭM и AСM после 31 сут инкубации (Ren et al., 2019). Личинки G. mellonella проявили также способность к деградации ПС (Lou et al., 2020): происходила значительная потеря массы пластика, появление C=O и C‒O-групп в молекулах и образование длинноцепочечных жирных кислот. Изучение состава микробиоты кишечника личинок G. mellonella показало, что при употреблении пластика в кишечнике начинают доминировать представители родов Bacillus и Serratia. При этом разрушение ПС отдельными выделенными штаммами шло менее эффективно, чем кишечным сообществом в целом.

Позднее была описана биодеградация ПЭ и других пластиков личинками различных насекомых, таких как мучной хрущак Tenebrio molitor (Billen et al., 2020), тeмный хрущак Tenebrio obscurus (Brandon et al., 2018; Peng et al., 2019), супер хрущак Zophobas atratus (Peng et al., 2020), малая пчелиная огневка Achroia grisella (Kundungal et al., 2019), а также улитками Achatina fulita (Song et al., 2020). Из кишечника личинок T. molitor были выделены штаммы Acinetobacter sp. и Bacillus sp., способные к росту на ПЭНП только в кокультуре; при этом масса ПЭНП за 30 сут снижалась на 18% (Yin et al., 2020).

Интересные результаты показаны для личинок мучного хрущака T. molitor, способных расти, используя в качестве корма порошок ПВХ (Peng et al., 2020). Происходила частичная деградация цепей полимера до небольших хлорорганических соединений, и снижение M_n на 33.4‒36.4%. Однако полная минерализации пластика шла очень медленно. Подобная активность Tenebrio molitor была продемонстрирована также для полиэтилена и полистирола (Wu et al., 2019). Важно отметить, что добавление в корм антибиотика значительно снижало эффективность биодеградации, что свидетельствует о роли микробиома кишечника личинок в этом процессе. Анализ вариабельных фрагментов генов 16S рРНК кишечного сообщества личинок показало преимущественное развитие на корме из ПВХ представителей семейств Streptococcaceae (в основном род Lactococcus), Spiroplasmataceae, Enterobacteriaceae и Clostridiaceae, не доминировавших на стандартном корме из отрубей.

Способность разрушать ПС была изучена для личинок двух разновидностей мучного хрущака (T. molitor и T. obscurus) и их микробиоты (Yang et al., 2015a, 2015b; Peng et al., 2019). По данным радиоизотопного анализа за 24 ч 47.7% меченого ¹³С пеноПС минерализовалось до CO₂, 49.2% выделялось с фекалиями, и небольшая часть встраивалась в липиды. С помощью ГХ-МС были зарегистрированы следующие интермедиаты разложения полистирола: пентанон, 4-гидрокси-4-метилбензен, 2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-метанол, оксалат, бутил-6-этилокт-3-ил-эфир, фенол, 2,4-бис(1,1-диметилэтил), 1,2-бензендикарбоксилат, бутил-2-метилпропиловый эфир. Микробное сообщество кишечника личинок при употреблении в пищу пеноПС претерпевало значительную сукцессию: от преобладания молочнокислых и энтеробактерий к доминированию стрептококков, а затем спироплазм и энтерококков. Важная роль кишечной микробиоты в процессе деградации пеноПС была доказана подавлением ее активности с помощью антибиотиков, что практически прекращало разложение пластика. Из кишечника личинок были выделены и идентифицированы 30 изолятов, которые затем инкубировали как чистые культуры в течение 28 сут в присутствии ПС. Значимый прирост числа клеток показали штаммы Bacillus cereus, Enterobacter hormaechei, Enterococcus gallinarum, Enterococcus faecalis, Chryseobacterium sp., Exiguobacterium sp.; при росте последнего организма на ПС в течение 60 сут в культуральной жидкости с помощью ГХ были выявлены многочисленные пики интермедиатов, а пластик потерял около 7.5% массы.

Личинка Zophobas atratus потребляла в сутки 0.58 г ‒ в 4 раза больше, чем личинки мучного хрущака. С помощью различных методов анализа было доказано, что в ee кишечнике происходит деполимеризация ПС и образование низкомолекулярных интермедиатов, при этом 36.7% углерода пеноПС минерализуется до CO₂ в течение 16 сут (Yang et al., 2020). Из кишечника личинки Zophobas atratus был выделен штамм Pseudomonas aeruginosa, способный к деградации ПС, и показано, что в процессе разрушения ПС повышается экспрессия сериновой гидролазы (Kim et al., 2020). Личинки жука Plesiophthalmus davidis за 14 сут потребили 34.27 ± 4.04 мг пеноПС на личинку и выжили, питаясь только этим пластиком. После 20 сут инкубации накопительных культур кишечной микробиоты этого насекомого с ПС наблюдали образование биопленок на поверхности пластика и ее морфологические изменения (образование полостей). ИК-спектроскопия Фурье показала появление C‒O-связей в молекулах. Анализ микробного сообщества показал, что в кишечнике в значительных количествах присутствовала Serratia marcescens; при кормлении личинок ПС в течение 2-х нед. ее количество увеличивалось в 6 раз (Woo et al., 2020).

Недавно была исследована способность широко распространенного вида улитки Achatina fulica перерабатывать пеноПС (Song et al., 2020). Улитка потребляла18.5 ± 2.9 мг ПС в течение 4 нед., выделяла микропластик с суммарной потерей массы в среднем на 30.7%. Аналитические методы подтвердили изменение молекулярной массы остаточного ПС и образование окисленных групп в молекулах. Анализ микробного сообщества с помощью высокопроизводительного секвенирования генов 16S рРНК выявил существенные сдвиги в сторону увеличения представителей семейств Enterobacteriaceae, Sphingobacteriaceae и Aeromonadaceae, что указывает на их возможное участие в процессе биодеградации.

МЕХАНИЗМЫ МИКРОБНОЙ ДЕГРАДАЦИИ ПЛАСТИКОВ

Полиэтилен и другие пластики, содержащие только углерод-углеродные связи в основной цепи, очень устойчивы к внешним воздействиям, в том числе и к микробному разложению (Wei, Zimmermann, 2017); тем не менее, у микроорганизмов существует целый ряд механизмов, приводящих к их деградации (Sheel, Pant, 2018). В процессе микробной биодеградации ПЭ, как правило, происходит биофрагментация полимера микробными ферментами с последующей биоассимиляцией получившихся мелких (с молярной массой меньше 500 г/моль) фрагментов (Bonhomme et al., 2003; Montazer et al., 2019).

В настоящее время известны две группы ферментов, участвующих в разложении ПЭ, и обе они задействованы в разложении других трудноразлагаемых полимеров – углеводородов и лигнина. В первом случае это алкангидроксилазы (Yoon et al., 2012; Jeon, Kim, 2015; Gravouil et al., 2017) и монооксигеназы (Jeon, Kim, 2015; Moreno, Rojo, 2019), во втором ‒ лакказы (Santo et al., 2013; Sheel, Pant, 2018) и марганецпероксидаза (Iiyoshi et al., 1998; Mukherjee, Kundu, 2014).

Алкангидроксилазы (EC 1.14.15.3) являются ключевыми ферментами, участвующими в аэробном разложении алканов бактериями (Monahan et al., 2020). Начальная стадия включает гидроксилирование связей C‒C с образованием первичных или вторичных спиртов, которые затем окисляются до альдегидов или кетонов, а затем до карбоновых кислот. Карбоксилированные н-алканы аналогичны жирным кислотам, которые могут катаболизироваться бактериями через систему β-окисления. C помощью транскриптомного анализа было показано, что у Rhodococcus ruber в присутствии ПЭ экспрессируются ферменты деградации алканов и пути β-окисления жирных кислот (Gravouil et al., 2017). Полная система алкангидроксилаз из Pseudomonas aeruginosa, выделенного с загрязненного нефтью пляжа, была экспрессирована в E. coli, в результате чего 19.3% низкомолекулярного ПЭ (low-molecular weight polyethylene, LMWPE) за 80 сут было минерализовано до СО₂ (Yoon et al., 2012). Для многих микроорганизмов, разлагающих ПЭ, также была показана их способность использовать линейные н-алканы, такие как парафин (C₄₄H₉₀, Mw = 618). Было обнаружено, что линейные молекулы парафина потребляются несколькими микроорганизмами в течение 20 сут (Haines and Alexander, 1975). Однако ни о разрыве связей C‒C в основной цепи полиэтиленовых полимеров, ни об образовании продуктов гидролиза карбоновых кислот с длинной углеродной цепью не сообщалось (Eubeler et al., 2010; Yoon et al., 2012; Jeon, Kim, 2015; Gewert, 2015).

К ферментам, участвующим в разложении лигнина, относятся марганецпероксидаза (ЕС 1.11.1.13), лигнинпероксидазы (EC 1.11.1.14) и лакказы (EC 1.10.3.2), и для них также установлено участие в разложении ПЭ (Restrepo-Florez et al., 2014; Krueger et al., 2015). Внеклеточная медь-зависимая лакказа из Rhodococcus ruber вызывала снижение среднего молекулярного веса и Mn облученного УФ полиэтилена, увеличивая содержание карбонильных групп в полимере (Santo et al., 2013). Еще одним ферментом, участвующим в биодеградации синтетических пластиков, в том числе ПЭ, является марганецпероксидаза (ЕС 1.11.1.13). Показано, что лигнин-разлагающие грибы Phanerochaete chrysosporium и Trametes versicolor и штамм IZU-154, а также частично очищенная марганецпероксидаза из P. chrysosporium вызывали деградацию ПЭ, причем процесс стимулировался ионами Mn (Iiyoshi et al., 1998). Также была продемонстрирована способность этого фермента осуществлять биодеградацию предварительно облученного ультрафиолетом ПЭ (Mukherjee, Kundu, 2014). Есть указания на существование подобных механизмов и у бактерий. Так, у Bacillus cereus была показана стимуляция синтеза лакказы и марганецпероксидазы при инкубации с ПЭ, предварительно подвергнутым УФ-облучению (Sowmya et al., 2014). Показано, что лигнинпероксидаза Streptomyces sp. вызывала деградацию ПЭ после термообработки (Pometto et al., 1992).

Таким образом, эти и некоторые другие экспериментальные данные указывают на участие перечисленных ферментов в разложении полиэтилена. Следует отметить, однако, что в большинстве случаев пластик предварительно подвергался УФ или термообработке, что делало его более доступным для действия ферментов.

Сведения о механизмах деградации ПП отсутствуют. Информации о механизмах разложения ПВХ также практически нет; однако было показано, что разложение ПВХ P. chrysosporium основывается на действии пероксидазы (Khatoon et al., 2019). При этом видимые повреждения поверхности пластика (данные СЭМ) и изменение профиля ИК-спектроскопии были значительно более выражены при обработке ПВХ раствором очищенной пероксидазы из P. chrysosporium, чем при инкубации пластика в присутствии культуры.

Механизмы деструкции ПЭТ активно изучаются; его биодеградация осуществляется путем ограниченного ферментативного гидролиза сложноэфирной связи полимерной основы. Ферменты бактерий и грибов вызывают гидролиз сложноэфирных связей в составе ПЭТ до образования терефталата и этиленгликоля. Промежуточными продуктами ферментативного гидролиза также являются моно-(2-гидроксиэтил) терефталат и бис-(2-гидроксиэтил) терефталат (Vertommen et al., 2005; Ronkvist et al., 2009), которые также могут разрушаться до терефталата и этиленгликоля под действием эстераз (Austin et al., 2018; Мaurya et al., 2020). При этом активность ПЭТ-гидролаз подвергается ингибированию промежуточными продуктами MHET и BHET, что показано на примере полиэфиргидролазы TfCut2 из Thermobifida fusca (Barth et al., 2015a).

Среди основных ПЭТ-гидролизующих ферментов выделяют гидролазы, кутиназы, ПЭТазу, выделенную из Ideonella sakaiensis, сходную по своей природе с кутиназами, а также липазы и эстеразы, образуемые различными грибами и бактериями (табл. 5).

Кутиназы (E.C. 3.1.1.74) имеют широкую субстратную специфичность и проявляют гидролитическую активность как в отношении нерастворимых триглицеридов (типичные субстраты липаз), так и растворимых сложных эфиров (субстраты эстераз) (Taniguchi, 2019). Среди продуцентов кутиназ, которые гидролизуют ПЭТ, описаны представители Fusarium solani, Thermobifida fusca, Thermobifida cellulolysilitica, Humicola insolens и Pseudomonas mendocina. Ферментативный гидролиз ПЭТ при участии кутиназ относят к так называемой поверхностной эрозии синтетических полимеров (Zhang et al., 2004; Wei et al., 2014). В отличие от других ферментов, разлагающих биополимеры, (например, целлюлозу или полигидроксиалканоаты), специфические связывающие домены, ответственные за адсорбцию клеток к субстрату, в кутиназах отсутствуют (Chen et al., 2013; Wei et al., 2014). Их адсорбция на поверхности ПЭТ определяется гидрофобными участками, находящимися в непосредственной близости от каталитического центра фермента, что было показано на примере нескольких кутиназ Thermobifida (Herrero Acero et al., 2011). Авторы показали, что именно различия в электростатических и гидрофобных свойствах поверхности кутиназ из T. cellulolysilitica и T. fusca определяют различия в их гидролитической активности, что приводит к высоким выходам продуктов гидролиза у T. fusca. Кутиназы более активны в отношении биоразложения ПЭТ, среди них много термостабильных ферментов, которые способны вызывать значительную потерю веса аморфных ПЭТ-пленок (Wei et al., 2016). Кутиназы из гриба Fusarium solani и бактерии Pseudomonas mendocina действуют при 50°C, а кутиназа, выделенная из гриба Humilica insolens, проявляет термостабильность в диапазоне 70‒80°C, однако их активность в 10 раз выше при использовании ПЭТ с 7% кристалличности, чем при использовании пластика с 35% кристалличности (Ronkvist et al., 2009).

Фермент ПЭТаза (ПЭТ-гидролаза; ЕС 3.1.1.101) из Ideonella sakaiensis 201-F6 (Yoshida et al., 2016), сходен по данным секвенирования с кутиназами, но имеет более широкий активный центр с дополнительными дисульфидными мостиками (Kawai et al., 2020). Этот фермент проявляет наивысшую гидролитическую активность в отношении ПЭТ с низкой кристалличностью при температуре окружающей среды, но он не термоустойчив, что отличает его от других кутиназ, которые проявляют высокую термостабильность.

Ферменты эстеразы (3.1) действуют на границе раздела между водной средой и нерастворимыми в воде субстратами. На примере эстеразы Clostridium botulinum обнаружена важная роль цинк-связывающего домена в ПЭТ-гидролитической активности этих анаэробных бактерий, отличающая эти ферменты от кутиназ аэробных микроорганизмов (Biundo et al., 2018; Kawai et al., 2019). Генная инженерия и введение определенных мутаций по этому участку эстераз облегчали адсорбцию Clostridium botulinum на ПЭТ и повышали гидролитическую активность (Biundo et al., 2016). Эстеразы гидролизуют сложные эфиры с алифатической областью с преимущественно более короткой цепью по сравнению с теми, которые подвергаются действию липаз (Freddi et al., 2011). Поэтому лишь незначительное число эстераз, таких как п-нитробензилэстераза, выделенная из Bacillus subtilis (BsEstB), способны участвовать в гидролизе ПЭТ (Ribitsch et al., 2011). Эстеразы обладают меньшим потенциалом для поверхностного гидролиза сложных полиэфиров, чем кутиназы или липазы, однако эстераза Thermobifida Thh_Est обладает активностью для поверхностного гидролиза ПЭТ, сравнимой с кутиназами из того же рода (Ribitsch et al., 2012).

Липазы (ЕС 3.1.1.3) проявляют низкую активность в отношении биодеградации ПЭТ из-за ограниченной доступности к субстрату (Zimmermann, Billig, 2011). Имеются данные о деградации ПЭТ липазами из дрожжей Candida cylindracea, мицелиального гриба Aspergillus oryzae и бактерии Pseudomonas sp. (Wang et al., 2008; Ma et al., 2012; Maurya et al., 2020).

Для полиэстеразы, выявленной у Penicillium citrinum, была показана частичная биодеградация ПЭТ и модельного субстрата бис-(бензоилоксиэтил) терефталата (3ПЭТ) с высвобождением продуктов разложения моно-(2-гидроксиэтил) терефталата и бис-(2-гидроксиэтил) терефталата, однако количество терефталиевой кислоты было незначительным (Liebminger et al., 2007). Среди известных своей ПЭТ-гидролазной активностью отмечают рекомбинантную термостабильную полиэстеразу из дрожжей Saccharomonospora viridis AHK190 (Kawai et al., 2014), рекомбинантную эстеразу, выделенную исходно из Thermobifida halotolerans и способную деполимеризовать ПЭТ с образованием TA и MHEТ (Ribitsch et al., 2012), а также нитробензилэстеразу из Bacillus subtilis (Ribitsch et al., 2011).

Имеется некоторое количество работ, посвященное механизмам разложения ПС. Слабыми участками полимерной цепи полистирола являются третичные атомы углерода, присоединенные к фенильным группам. Именно они уязвимы для атаки свободных радикалов, и ряд химических реакций может здесь привести к разрыву цепи и инициировать образование карбонильных групп (Niessner, Gausepohl, 2003). Образование карбонильных групп, а также пероксидных групп ускоряет деградацию полимера (Meekum, Kenharaj, 2002; Botelho et al., 2004).

Первыми этапами процесса могут быть ферментативная деполимеризация, воздействие агрессивных метаболитов микроорганизмов и химическая реакция полимера с имеющимися в нем добавками (Milstein et al., 1992; Mooney et al., 2006; Krueger et al., 2015; Tischler et al., 2015; Ho et al., 2018; Chauhun et al., 2018). Предполагается, что растущие на поверхности полистирола микроорганизмы должны образовывать ферменты или выделять агрессивные метаболиты, способствующие разложению полимера на олигомеры и мономеры, однако пока неизвестно ни одного микробного фермента, который мог бы разлагать ПС. Предполагают, что это могут быть грибные лигнинпероксидазы. Сильное деградирующее действие на полимерные материалы оказывают выделяемые плесневыми грибами органические кислоты (лимонная, щавелевая, янтарная, уксусная, глюконовая, молочная, фумаровая). При совместном развитии нескольких видов плесневых грибов они могут обмениваться производимыми органическими кислотами, тем самым обеспечиваются подходящие жизненные условия на ПС даже для таких грибов, для которых этот полимер непригоден при развитии в виде чистой культуры.

На втором этапе происходит биодеградация олиго- и мономеров, в частности стирола. Преобладающим путем окисления является путь боковой цепи стирола (так называемый “верхний” путь) (Oelschlaegel et al., 2018). Стирол в аэробных условиях непосредственно окисляется монооксигеназой стирола с образованием эпоксида стирола, который затем окисляется до фенилацетальдегида изомеразой оксида стирола. Далее эта молекула катаболизируется в фенилуксусную кислоту дегидрогеназой. Фенилуксусная кислота преобразуется в фенилацетил-КоА с помощью лигазы и затем подвергается деароматизации в нескольких ферментативных реакциях, чтобы окончательно войти в ЦТК через образование ацетил-КoA и сукцинил-КoA (изучено у представителей родов Pseudomonas, Xanthobacter, Rhodococcus, Corynebacterium).

Pseudomonas putida CA-3 может накапливать полигидроксиалканоаты при выращивании на стироле (O’Leary et al., 2005), используя оригинальный путь биодеградации (“нижний” путь). Он включает окисление ароматического кольца с последующим вступлением в цикл β-окисления и превращением в ацетил-КоА. Ацетил-КоА может затем либо входить в ЦТК, либо в путь биосинтеза жирных кислот de novo, который даст в качестве конечного продукта полигидроксиалканоаты средней длины. У уже упоминавшегося штамма Bacillus paralicheniformis, выделенного из донных отложений Аравийского моря и способного разрушать 34% от общей массы пленки ПС за 60 сут, были идентифицированы гены, кодирующие ферменты монооксигеназу, диоксигеназу, пероксидазу, эстеразу и гидролазу, участвующие в деградации ПС.

Гены, отвечающие за окисление боковой цепи, часто располагаются в одном консервативном генном кластере, обозначаемом styABC (D). Гены styA и styB кодируют монооксигеназный комплекс, обуслoвливающий деградацию стирола. Монооксигеназа стирола представляет собой двухкомпонентный флавопротеин, который катализирует НАДН-и ФАД-зависимое эпоксидирование стирола до оксида стирола. StyA является монооксигеназой, а StyB функционирует как флавин-адениндинуклеотидредуктаза для снабжения StyA необходимыми электронами. Ген styC кодирует изомеразу стирола, а styD – фенилацетальдегиддегидрогеназу (Oelschlaegel et al., 2012; Morrison et al., 2013; Crabo et al., 2017; Oeleschlaegel et al., 2018).

ПУТИ ИНТЕНСИФИКАЦИИ ПРОЦЕССА БИОДЕГРАДАЦИИ ПЛАСТИКОВ

Исследование процесса разложения пластиков неизменно сопровождается поисками путей его ускорения. Скорость разложения полимера микроорганизмами в первую очередь зависит от площади контактной поверхности, поэтому для ускорения процесса деградации используются тонкие полимерные пленки или порошок (Montazer et al., 2020).

Для ускорения процесса деградации часто используют различные физические воздействия на пластик, меняющие его структуру и делающие ее более доступной для биодеградации. Наиболее часто используют ультрафиолетовое излучение (УФ) и термическую обработку. Так, было показано, что скорость биодеградации ПЭНП может быть увеличена путем его предварительной фото- или термической обработки (Volke-Sepúlveda et al., 2002; Chatterjee et al., 2010). Под влиянием этих воздействий меняется степень кристалличности ПЭ и его морфологические особенности, снижается размер полимерной цепи, образуются окисленные группы, такие как карбоксил, карбонил и гидроксил, что ускоряет процесс разложения полимера микроорганизмами (Albertsson, 1980; Hadad et al., 2005, Esmaeili et al., 2013). Продолжительность УФ обработки должна составлять не менее 250 ч, а температуры (70‒80°С) ‒ не менее суток (Yamada-Onodera et al. 2001; Abrusci et al., 2011, Montazer et al., 2019).

Аналогичные эффекты УФ облучения и термической обработки наблюдаются и при разложении ПЭТ. Его сложноэфирные связи, более подверженные биоразложению, например, микробными эстеразами или липазами, оказываются экранированы ароматическими группами, вследствие чего вся структура пластика остается устойчивой к биоразложению (Webb et al., 2013). Дополнительные воздействия, такие как УФ облучение, а также термическая обработка, значительно усиливают действие микробных гидролитических ферментов (Wei, Zimmermann, 2017).

Образованию карбонильных групп в ПЭ способствует предобработка кислотой, что повышает степень биодеградации полимера. При исследовании микробного разложения ПЭНП использовалась предобработка его порошка 65%-ым раствором азотной кислоты в течение 10 сут (Rajandas et al., 2012) или 99% раствором азотной кислоты в течение 6 сут (Hasan et al., 2007). В обоих случаях, согласно данным Фурье-инфракрасной спектроскопии, было показано увеличение биодеградации ПЭ. Было также показано, что при сочетании фотоокисления и химической предобработки под действием азотной кислоты наблюдали синергетический эффект повышения скорости биодеградации (Hasan et al., 2007).

Активно исследуется влияние температуры культивирования на процесс разложения полимеров. Так, сообщается о высокой способности к деградации пластика термофильными бактериальными консорциумами Brevibacillus spp. и Aneurinibacillus sp. (Skariyachan et al., 2008). При сравнении процесса деградации ПЭ Pseudomonas aeruginosa при 7, 23, 37 и 44°C было показано, что наибольшая убыль субстрата (6.25% за 30 сут) происходила при 44°C (Tamnou et al., 2021).

В решении проблемы разложения ПЭТ одной из основных задач является поиск микроорганизмов с термостабильными и высокоактивными при повышенных температурах ферментами, поскольку при температуре, выше температуры стеклования (65°C) аморфные части полимера становятся более гибкими и доступными для воздействия гидролитических ферментов (Ronkvist et al., 2009).

Одним из важных препятствий к микробной деградации пластиков является их гидрофобность, затрудняющая контакт клеток с поверхностью пластика. Образование поверхностно-активных веществ бактериями является ключевым фактором при бактериальном разложении ПЭ, поскольку секреция молекул биосурфактанта снижает поверхностное натяжение и облегчает прикрепление бактерий к поверхности ПЭ (Vimala, Mathew, 2016; Журина и соавт., 2020). Также было показано, что добавление 0.05% минерального масла способствует образованию биопленки и повышает биодеградацию ПЭ (Hadad et al., 2005). Установлено, что при разложении ПЭТ гидролитическая активность ПЭТаз может быть увеличена благодаря использованию анионных поверхностно-активных сурфактантов, что позволит анионизированным поверхностям ПЭТ привлекать больше катионных ПЭТаз (Furukawa et al., 2019).

Процесс разложения пластиков ускоряется при использовании смеси субстратов, когда, помимо пластика, в среде присутствует более доступный источник углерода и энергии. Установлено, что смешивание ПЭ с полимерами природного происхождения, такими как крахмал, может повысить его биоразлагаемость. Было показано, что фермент α-амилаза способен разлагать образцы смеси ПЭНП‒крахмал в водном растворе; при этом вес и предел прочности на разрыв образцов полимера после обработки ферментом уменьшаются на 48 и 87% соответственно (Karimi, Biria, 2019). По данным гель-проникающей хроматографии (ГПХ) было выявлено значительное снижение как молярной массы, так и вязкости ПЭНП более чем на 70 и 60% соответственно. Данные этих экспериментов показали, что основная цепь полимера, а также боковые ответвления были расщеплены ферментом, что позволяет предположить, что α-амилаза оказывает смешанный ко-метаболический эффект на биодеградацию ПЭНП в смесях полимер‒крахмал.

Также было замечено, что в бинарных биопленках процессы биоразрушения протекают интенсивнее, когда партнеры составляют трофическую цепь, в которой один штамм может осуществлять первичную модификацию полимерной цепи, а другой ‒ потреблять образующиеся промежуточные продукты. Важной дополнительной функцией одного из компонентов микробной ассоциации может быть способность к образованию биосурфактантов, которые помогают метаболизировать нерастворимые в воде соединения (Плакунов и соавт., 2020). При разложении ПС смешанными культурами (как правило, на первых стадиях разрушения пластика) возможно воздействие на полимер агрессивных продуктов метаболизма (например, кислот), продуцируемых компонентами сообщества, растущими на доступных источниках углерода и энергии и не образующих ферментов прямого воздействия на полимер (Naz et al., 2013; Ho et al., 2018; Chauhan et al., 2018).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Накопление пластиковых отходов в окружающей среде однозначно свидетельствует о том, что природные микробные сообщества не справляются с их разложением. Действительно, все экспериментальные данные свидетельствуют о том, что достоверно регистрируемый процесс разложения пластиков идет очень медленно. Тем не менее, результаты активных и многогранных исследований последних лет свидетельствуют о том, что микроорганизмы и в этой, казалось бы, безнадежной борьбе демонстрируют свое могущество. Прежде всего, поражает разнообразие грибов и бактерий, для которых была доказана способность разлагать различные виды пластиков: это представители разных филумов, при этом имеющих большое количество культивируемых представителей – Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria и др. Можно предположить, что в действительности разнообразие прокариот, разлагающих пластики, гораздо больше. Следует отметить также, что далеко не все экологические ниши были исследованы на предмет присутствия в них микроорганизмов, способных к разложению пластиков, и, возможно, расширение спектра исследуемых местообитаний приведет к выделению новых целевых микроорганизмов. Лишь очень небольшое количество работ посвящено анаэробному разложению пластиков; между тем, эти процессы, безусловно, заслуживают внимания исследователей, так как анаэробные местообитания широко распространены на нашей планете, в том числе и в глубинных, лишенных кислорода слоях мусорных полигонов. Необыкновенно интересные результаты были получены при исследовании беспозвоночных животных, которые с помощью микробных симбионтов усваивают труднодоступные субстраты, например, воска. Можно предположить, что таких симбиотических сообществ существует гораздо больше, причем в местообитаниях самого разного типа. Среди биотопов, перспективных для поиска новых микроорганизмов, способных к разложению пластиков, можно назвать экстремальные местообитания, где на пластики будут воздействовать и физико-химические факторы, и устойчивые к этим факторам микроорганизмы.

Примером успешного исследования механизмов разложения пластиков можно считать быстро продвигающиеся исследования ферментов, вызывающих разложение ПЭТ. Рекомбинантные ПЭТазы демонстрируют высокую скорость разложения полимерного субстрата, причем важным фактором является их термостабильность, позволяющая вести процесс при высоких температурах. Этот несомненный успех дает возможность надеяться на создание в недалеком будущем технологии ферментативной переработки ПЭТ.

Можно предположить, что в ближайшие годы количество работ, посвященных микробному разложению пластиков, будет только увеличиваться. Это обусловливает необходимость разработки единых протоколов исследования процессов биодеградации пластиков, что позволит ученым из разных стран действовать единым образом при решении этой очень трудной и важной задачи.