Микробиология, 2022, T. 91, № 3, стр. 274-284

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Бактерии и условия их культивирования. Зеленую серную бактерию Chlorobaculum limnaeum штамм С (бывшая Chlorobium limicola штамм C) из коллекции кафедры микробиологии Московского государственного университета культивировали в фототрофных условиях на среде Ларсена (Larsen, 1952) с NaHCO₃ (3 г/л) и Na₂S ∙ 9H₂O (1 г/л). При выращивании бактерий в фотомиксотрофных условиях в качестве источников углерода использовали NaHCO₃ (3 г/л) + ацетат (1 г/л). Культуры выращивали при 25–28°С в 500 мл стеклянных сосудах, полностью заполненных средой.

Приготовление клеточного экстракта. Для получения бесклеточных экстрактов клетки, находящиеся в конце экспоненциальной фазы роста, отделяли от среды центрифугированием (9000 об./мин при 6‒8°С) и отмывали 0.05 М Трис-HCl буфером (рН 7.5). Полученную биомассу ресуспендировали в 7 мл используемого для определения активности фермента буфера и разрушали с помощью Х-пресса (“LKB”, Швеция) при избыточном давлении 10 т/см². Неразрушенные клетки и крупные фрагменты отделяли центрифугированием при 35 000 g в течение часа. Получившейся супернатант использовали для энзиматических исследований. Определение активности ферментов проводили при комнатной температуре. Содержание белка в опытах 0.5‒2.0 мг/мл.

Ассимиляция клетками меченых субстратов. Эксперименты по ассимиляции [¹⁴C]-меченых субстратов суспензиями клеток проводили в медицинских шприцах на свету (2000 лк). Реакцию начинали добавлением NaH¹⁴CO₃ (5 мМ, 0.04 МБк) и останавливали через соответствующие промежутки времени фильтрованием 1 мл клеточной суспензии через нитроцеллюлозные фильтры (0.45 мкм). Фильтры сушили и просчитывали на жидкостном сцинтилляционном счетчике LKB RacBeta модель 1127.

Определение активности ферментов. Активность АТФ-цитратлиазы (EC 2.3.3.8) определяли по окислению НАДН в сопряженной реакции с малатдегидрогеназой. Реакционная смесь содержала 100 мМ Tris-HCl (pH 8.3), 5 мМ дитиотриэтола (DTE), 5 мМ MgCl₂, 3 мМ АТФ, 0.5 мМ КоА, 0.4 мМ НАДН, 1 ед. малатдегидрогеназы и 3 мМ цитрата. Реакция начиналась добавлением цитрата.

Активность цитратсинтазы (EC 4.1.3.1) определяли по оксалоацетат-зависимому выделению КоА из ацетил-КоА. Накопление КоА определяли в реакции с DTNB. Реакционная смесь содержала 100 мМ Трис-HCl (pH 7.8), 1 мМ DTNB, 0.2 мМ ацетил-КоА и 20 мМ цитрата. Реакция начиналась добавлением оксалоацетата.

Активность аконитазы (EC 4.2.1.3) определяли спектрофотометрически по накоплению цис-аконитата при 240 нМ (E₂₄₀ ‒ 3.4 мM^–1 cм^–1). Реакционная смесь содержала 100 мМ Трис-HCl (pH 7.5) и 10 мМ цитрата. Реакция начиналась добавлением клеточного экстракта.

Активность изоцтратдегидрогеназы (EC 1.1.1.42) определяли по изоцитрат-зависимому восстановлению НАДФ. Реакционная смесь содержала 100 мМ Трис-HCl (pH 7.5), 5 мМ DTE, 5 мМ MgCl₂, 1 мМ НАДФ и 10 мМ изоцитрата. Реакция начиналась добавлением изоцитрата.

Активность малатдегидрогеназы (EC 1.1.1.37) определяли по оксалоацетат-зависимому окислению НАДН. Реакционная смесь содержала 100 мМ Трис-HCl (pH 7.8), оксалоацетат 4 мМ, 5 мМ M-gCl₂, 5 мM DTT и 0.3 мM НАДН. Реакция начиналась добавлением оксалоацетата.

Активность фумаратгидратазы (EC 4.2.1.2) измерялась спектрофотометрически при 240 нМ (E₂₄₀ ‒ 2.440 M^–1 cм^–1). Реакционная смесь содержала 100 мМ Трис-HCl (pH 7.8), 30 мМ малата. Реакция начиналась добавлением клеточного экстракта.

Активность сукцинатдегидрогеназы (EC 1.3.5.1) определяли спектрофотометрически по сукцинат-зависимому восстановлению феррицианида при 420 нм (E₄₂₀ ‒ 1.09 мM^–1 cм^–1). Реакционная смесь содержала 100 мМ Трис-HCl (pH 7.5), 2.5 мМ феррицианида, 0.5 мМ сукцината. Реакция начиналась добавлением сукцината.

Активность изоцитратлиазы (EC 4.1.3.1) определяли спектрофотометрически по накоплению гидразона глиоксилата при 324 нм (E₃₂₄ гидразона глиоксилата ‒ 17 мM^–1 cм^–1). Реакционная смесь содержала 100 мМ Трис-HCl (pH 7.5), 5 мМ MgCl₂, 5 мМ фенилгидразина, 1 мМ изоцитрата. Реакция начиналась добавлением изоцитрата.

Активность 2-оксоглутаратдегидрогеназы (EC 1.2.4.2) определяли спектрофотометрически по восстановлению НАД при 340 нм (E₃₄₀ ‒ 6.22 мM^–1 cм^–1). Реакционная смесь содержала 100 мМ Трис-HCl (pH 7.5), 5 мМ MgCl₂, 1 мМ НАД, 0.5 мМ КоА, 10 мM DTE, 0.5 мM TPP и 5 мМ 2‑ок-соглутарата. Реакция начиналась добавлением 2-оксоглутарата.

Активность 2-оксоглутаратсинтазы (EC 1.2.7.3), пируватсинтазы (EC 1.2.7.1) и фумаратредуктазы измеряли спектрофотометрически по восстановлению метилвиологена при 578 нм (Е₅₇₈ – 8 × 10³ M^–1 cм^–1). Реакцию проводили в анаэробных условиях с N₂ в газовой фазе. Реакционная смесь для КоА-зависимых 2-оксоглутарат- и пируватсинтазы содержала: 100 мМ Трис-HCl (pH 7.8), 4 мМ DTE, 2 мМ MgCl₂, 0.5 мМ CoA, 2 мM MV и 3 мМ 2-оксоглутарата или пирувата. Реакционная смесь для фумаратредуктазы содержала: 100 мМ Трис-HCl (pH 7.8), 4 мМ DTE, 2 мМ MgCl₂, 2 мM MV и 1 мМ фумарата. Дитионит был добавлен шприцем из 5 мМ раствора до появления слабой фиолетовой окраски. Реакции начиналась добавлением 2-оксоглутарата, пирувата или фумарата.

Определение сульфида проводили по модифицированному методу, описанному ранее (Trueper, Schlegel, 1964). Белок измеряли по методу Лоури, используя бычий сывороточный альбумин в качестве контроля.

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей. Сравнительный анализ генов 16S рРНК, aclB и gltA проводили с использованием баз данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и PATRIC v.3.6.11. Редактирование и трансляцию секвенированных последовательностей проводили с помощью редактора BioEdit (Hall, 1999). Последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий с помощью программы CLUSTALW v 1.75 (Thompson et al., 1994). Построение филогенетических деревьев исследуемых бактерий проводили с использованием алгоритма neighbor-joining (Saitou, Nei, 1987), реализованного в пакете программ TREECONW (Van de Peer, De Wachter, 1994) и алгоритма Maximum Likelihood, реализованного в пакете программ MEGA11 v 11.0.8.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Активность ферментов, принимающих участие в автотрофной ассимиляции CO₂ у Cba. limnaeum С. Автотрофная ассимиляция СО₂ у Cba. limnaeum С происходит при участии четырех реакций карбоксилирования: пируватсинтазы, 2-оксоглутаратсинтазы, изоцитратдегидрогеназы и ФЕП-карбоксилазы (табл. 1). При выращивании Cba. limnaeum С в фотомиксотрофных условиях на среде, содержащей в качестве источников углерода бикарбонат и ацетат в качестве дополнительного источника углерода, происходит уменьшение активности пируватсинтазы, 2-оксоглутаратсинтазы и изоцитратдегидрогеназы по сравнению с их активностью у клеток, выросших в фотоавтотрофных условиях. В этих условиях Cba. limnaeum С включают ацетат в углеродный метаболизм в качестве готового строительного блока, снижая нагрузку на систему фиксации СО₂. Активность ФЕП-карбоксилазы в этих условиях напротив увеличивается. Это объясняется ее участием в процессе ассимиляции экзогенного ацетата в фотомиксотрофных условиях (рис. 1).

В дополнение к ферментам цикла Арнона‒Бюкенана в клетках Cba. limnaeum, выросших как в фотоавтотрофных, так и фотомиксотрофных условиях на среде с ацетатом в качестве дополнительного источника углерода, детектируется активность цитратсиназы (табл. 1). Этот фермент отсутствует в классическом варианте цикла (рис. 1).

Рост, окисление сульфида и ассимиляция CO₂ зелеными серными бактериями Cba. limnaem C в фотоавтотрофных и фотомиксотрофных условиях. Cba. limnaeum С. способен к фотоавтотрофному росту на среде, содержащей СО₂ в качестве источника углерода и H₂S, как донора электронов, и к фотомиксотрофному на среде с ацетатом, в качестве дополнительного источника углерода. При росте в фотомиксотрофных условиях урожай клеток Cba. limnaeum увеличивается на 30‒40%. Напротив, скорость фиксации СО₂ и окисления сульфида снижается примерно в этой же пропорции (табл. 2). Эти данные служат дополнительным доказательством того, что ацетат в этих условиях включается в метаболизм клеток Cba. limnaeum в качестве готового строительного блока, что снижает потребность клеток в СО₂ и, следовательно, в сульфиде, как доноре электронов.

Механизм действия фторацетата на ассимиляцию СО₂. Характерной особенностью процесса автотрофной ассимиляции СО₂ у зеленых серных бактерий является его высокая чувствительность к действию фторацетата. Фторацетат в фотоавтотрофных условиях выращивания клеток штамма Cba. limnaeum С более чем на 90% ингибирует фиксацию СО₂, окисление сульфида и рост бактерий (табл. 2 и 3). Минимальная концентрация фторацетата, достаточная для 50% подавления автотрофной ассимиляции СО₂ (IC₅₀), равна 2 × 10^–6 М и, соответственно, 5 × 10^–6 М для полного подавления фиксации СО₂ (рис. 2). Наиболее вероятной мишенью ингибирующего действия фторацетата является аконитаза. Этот фермент является обязательным участником процесса ассимиляции СО₂ в цикле Арнона‑Бюкенана (рис. 1). Истинным ингибитором аконитазаы является не фторацетат, а фторцитрат (Villafranca, Platus, 1973; Proudfoot et al., 2006). У зеленых серных бактерий он может синтезироваться в цитратсинтазной реакции: фторацетил-КоА + оксалоацетат → 2-фторцитрат + + КоА, что, в свою очередь, предполагает наличие у штамма Cba. limnaeum С цитратсинтазы, катализирующей реакцию синтеза фторцитрата, как эндогенного ингибитора аконитазы. Активность цитратсинтазы обнаруживается в клетках Cba. limnaeum С, выросших как в фотоавтотрофных, так и в фотомиксотрофных условиях (табл. 1). Однако эта реакция отсутствует в классическом варианте цикла Арнона‑Бюкенана (рис. 1), что не позволяет адекватно интерпретировать механизм ингибирования фторацетатом фиксации СО₂ у зеленых серных бактерий, оставаясь в рамках общепринятых представлений о механизме этого процесса. Наличие у штамма Cba. limnaeum С цитратсинтазы, катализирующей реакцию синтеза фторцитрата, как эндогенного ингибитора аконитазы, объясняет высокую чувствительность ассимиляции СО₂ у зеленых серных бактерий к действию фторацетата.

Рис. 1.

Механизм автотрофной фиксации СО₂ у зеленых серных бактерий (adapted from Evans M.C.W., Buchanan B.B., Arnon D.I., 1966). 1 ‒ АТФ-цитратлиаза; 2 ‒ малатдегидрогеназа; 3 ‒ фумаратгидратаза; 4 ‒ фумаратредуктаза; 5 ‒ сукцинил-КоА синтаза; 6 ‒ ферредоксин-зависимая кетоглутаратсинтаза; 7 ‒ изоцитратдегидрогеназа; 8 ‒ аконитатгидратаза; 9 ‒ ферредоксин-зависимая пируватсинтаза; 10 ‒ ФЕП-синтаза; 11 ‒ФЕП-карбоксилаза.

Рис. 2.

Действие фторацетата на ассимиляцию бикарбоната.

Ацетат снимает ингибирующее действие фторацетата на автотрофную ассимиляцию СО₂ (табл. 2 и 3). Линейная зависимость восстановления скорости фиксации СО₂ от концентрации ацетата в присутствии фторацетата указывает на конкурентный характер их взаимодействия (рис. 3). Конкуренция между ацетатом и фторацетатом может осуществляться либо на уровне их транспорта в клетки бактерий, либо в процессе их метаболизма. В пользу первого предположения свидетельствует тот факт, что пируват, получаемый в результате карбоксилирования экзогенного ацетата в пируватсинтазной реакции (рис. 1, табл. 1), и также другие продукты функционирования цикла Арнона‑Бюкенана ‒ 2-оксоглутарат, сукцинат, фумарат, малат, цитрат (данные не показаны) ‒ не восстанавливали фиксации СО₂ в присутствии фторацетата. Конкуренция ацетата и фторацетата за общую транспортную систему приводит к радикальному снижению внутриклеточной концентрации фторацетата, используемого в качестве субстрата для синтеза фторцитрата. В результате полностью блокируется синтез фторцитрата как эндогенного ингибитора аконитазы, и, как следствие, рост бактерий и их способность к автотрофной ассимиляции СО₂ полностью восстанавливаются.

Рис. 3.

Снятие ингибирующего действия фторацетата ацетатом.

Наличие цитратсинтазы у Cba. limnaeum С и ее отсутствие в каноническом варианте цикла Арнона‑Бюкенана (рис. 1) послужило мотивом для дополнительных филогенетических исследований гена цитратсинтазы зеленых серных бактерий, принадлежащих к филуму Chlorobi.

Филогенетический анализ генов 16S рРНК, АТФ-цитратлиазы и цитратсинтазы зеленых серных бактерий. В базе данных PATRIC в настоящее время представлено 655 геномов бактерий филума Chlorobi. Однако большинство из них (585 геномов) получено для некультивируемых микроорганизмов в результате анализа метагеномов, поэтому точность идентификации этих микроорганизмов и полнота аннотации их геномов недостаточны для анализа. При этом из оставшихся 70 геномов культивируемых бактерий, только для 38 аннотированы гены 16S рРНК. Эти геномы и были использованы для филогенетического анализа вместе с ранее полученными нами для штаммов зеленых серных бактерий С, Х, L и M (Кеппен и совт., 2008; Турова и соавт., 2013).

Анализ геномов всех исследованных культивируемых зеленых серных бактерий свидетельствуют о наличии в них не только гена АТФ-цитратлиазы, детерминирующего ключевой фермент цикла Арнона‑Бюкенана, но и гена цитратсинтазы, детерминирующего фермент, не участвующий в общепринятом варианте цикла. Для всех анализируемых геномов зеленых серных бактерий было выявлено присутствие как aclAB ‒ генов обеих субъединиц АТФ-цитратлиазы, так и генов gltA цитратсинтазы (рис. 4 и 5). Топологии филогенетических деревьев, построенных на основании сравнения аминокислотных последовательностей транслированных генов АТФ-цитратлиазы (aclB) и цитратсинтазы (gltA) и нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК зеленых серных бактерий, соответствовали родовой структуре семейства Chlorobiaceae. При этом положение на филогенетических “АТФ-цитратлиазном” и “цитратсинтазном” деревьях зеленых серных бактерий С, Х, L и M штаммов соответствовало их идентификации на основании анализа генов 16S рРНК как представителей видов Cba. limnaeum, Cba. parvum и Cba. macestae, а топологии всех построенных деревьев в общем виде были конгруэнтны. При этом гены цитратсинтазы у представителей филума Chlorobi имеют общее происхождение, а их филогения соответствует таксономической структуре подразделения, основанной на анализе генов 16S рРНК (Alexander et al., 2002; Imhoff, 2003), и, следовательно, их эволюция происходила параллельно эволюции генов 16S рРНК. Коэволюция генов цитратсинтазы штаммов С, X, L и M с генами 16S рРНК характерна для так называемых “генов домашнего хозяйства” (“housekeeping genes”), т.е. генов, облигатно необходимых для жизнедеятельности данного конкретного филогенетического подразделения, филогения которого также соответствует “рибосомной”. Таким образом, проведенный филогенетический анализ подтверждает необходимость генов цитратсинтазы, также как и генов АТФ-цитратлиазы, для жизнедеятельности зеленых серных бактерий. Принимая во внимание результаты геномного анализа, можно предположить, что у зеленых серных бактерий цитратсинтаза (EC 2.3.3.1) включена в систему автотрофной ассимиляции СО₂ как обязательный участник этого процесса.

Рис. 4.

Филогенетические деревья, основанные на сравнении нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК и транслированных аминокислотных последовательностей генов АТФ-цитратлиазы (aclB) культивируемых зеленых серных бактерий (филум Chlorobi). Шкала показывает количество нуклеотидных/аминокислотных замен. Точки ветвления сколлапсированы для значений бутстреп-анализа не превышающих 70%.

Рис. 5.

Филогенетические деревья, основанные на сравнении нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК и транслированных аминокислотных последовательностей генов цитратсинтазы (gltA) культивируемых зеленых серных бактерий (филум Chlorobi). Шкала показывает количество нуклеотидных/аминокислотных замен. Точки ветвления сколлапсированы для значений бутстреп-анализа не превышающих 70%.

Обнаружение генов цитратсинтазы во всех исследованных нами геномах зеленых серных бактерий, их коэволюция с генами 16S рРНК, выявление активности этого фермента в клетках штамма С Cba. limnaeum, а также невозможность объяснения механизма ингибирующего действия фторацетата в рамках канонических представлений (Evans et al., 1966) дали основания предложить новый механизм ассимиляции углекислоты у зеленых серных бактерий (рис. 6).

Рис. 6.

Механизм автотрофной ассимиляции СО₂ у штамма С Cba. limnaeum. 1 ‒ АТФ-цитратлиаза; 2 ‒ малатдегидрогеназа; 3 ‒ фумаратгидратаза; 4 ‒ фумаратредуктаза; 5 ‒ сукцинил-КоА синтаза; 6 ‒ ферредоксин-зависимая 2-оксоглутаратсинтаза; 7 ‒ изоцитратдегидрогеназа; 8 ‒ аконитатгидратаза; 9 ‒ ферредоксин-зависимая пируватсинтаза; 10 ‒ пируваткиназа; 11 ‒ ФЕП-карбоксилаза; 12 ‒ цитратсинтаза. I ‒ обращенный цикл трикарбоновых кислот; II – синтез субстратов для построения клетки с использованием ацетил-КоА, синтезированного в обращенном ЦТК.

В соответствии с полученными данными, автотрофная ассимиляция СО₂ у зеленых серных бактерий происходит при участии двух топологически независимых ферментных комплексов: обращенного цикла трикарбоновых кислот (комплекс I), единственным продуктом активности которого является ацетил-КоА, и нециклического ферментного комплекса ферментов (комплекс II), при участии которого из ацетил-КоА, синтезированного в комплексе I, происходит синтез соединений, необходимых для построения клеток (рис. 6). Цитратсинтаза – фермент, объединяющий комплекс I и комплекс II в единую систему автотрофной ассимиляции СО₂, и ацетил-КоА, единственный субстрат, которым обмениваются оба комплекса. Комплекс I включает две реакции карбоксилирования (2-оксоглутаратсинтазу и изоцитратдегидрогеназу), комплекс II ‒ две дополнительные реакции карбоксилирования (пируватсинтазу и ФЕП-карбоксилазу). Синтез 2-оксоглутарата, используемого для синтеза большого числа аминокислот, происходит в результате декарбоксилирования изоцитрата, синтезированного внутри комплекса II. Реакция реализуется при участии изоцитратдегидрогеназы, функционирующей в обратном направлении, по сравнению с изоцитратдегидрогеназой в составе комплекса I. В результате этой реакции в энергетический метаболизм бактерий возвращается один восстановительный эквивалент.

Одновременное функционирование ферментных комплексов, имеющих различные функции, но использующих аналогичный (или похожий) набор ферментов возможно только при обеспечении локализации их субстратов внутри комплексов, где они синтезируются. Вопрос о способах такой локализации остается открытым, однако можно предположить, что она может обеспечиваться организацией соответствующих топологически обособленных мультиферментых комплексов. Хотя экспериментальное подтверждение этой гипотезы представляется чрезвычайно сложной задачей, в настоящее время растет количество данных, указывающих на активное вовлечение таких комплексов в метаболизм бактерий (Sweetlove, Fernie, 2018). Объединение ферментов, катализирующих последовательные реакции в метаболических путях, в мультиферментные комплексы может существенно облегчить регуляцию метаболизма, а также обеспечить эффективное функционирование ферментов, создавая высокие локальные концентрации их субстратов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы благодарят А.В. Лебединского за плодотворную дискуссию в процессе написания статьи.