Микробиология, 2022, T. 91, № 3, стр. 364-375

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Образцы. Манускрипт Al-adoviah al-Mufradah хранится на компактных полках при температуре 23–25°C и относительной влажности 30–40% в хранилище редких книг NLAI. Пробы для изучения культивируемых микроорганизмов были взяты в десяти разных местах книги, каждая с площади примерно 1 см² (общая площадь 10 см²), в том числе четыре пробы с первой страницы (FP1–FP4), одна проба с передней кромки (FE), две пробы с внутренних страниц (IP1 и IP2) и три пробы с последней страницы книги (EP1–EP3). Пробы из этих областей были собраны с помощью стерильных тампонов и сразу же использованы для биологической культуры (табл. S1 и S2 ). Для метагеномного исследования пробы с этих участков были отобраны повторно с помощью стерильных тампонов и скальпелей. С учетом исторической ценности книги и во избежание физических повреждений, было собрано минимальное количество бумажных фрагментов, только с полей и пустых страниц. Некоторые из этих бумажных фрагментов были использованы для полевой эмиссионной сканирующей электронной микроскопии (ПЭСЭМ). Поскольку материал каждого отдельного фрагмента был непредставителен для выделения ДНК, кусочки бумаги, полученные с десяти участков, объединили в общий образец. До момента выделения ДНК мазки и фрагменты бумаги хранились при –20°C.

ПЭСЭМ. Фрагменты бумаги (диаметром примерно 2–3 мм) помещали на предметное стекло на двустороннюю углеродную клейкую ленту и напыляли слоем золота толщиной примерно 15 нм в устройстве для напыления Quorum Q150T ES. Затем образцы анализировали и фотографировали с помощью ПЭСЭМ (Nova NanoFESEM 450) в режиме высокого вакуума при давлении в камере 0.10 мбар и напряжении 10 кВ, чтобы оценить их возможную колонизацию микробными сообществами и физическую деформацию целлюлозных волокон.

Измерение pH. pH бумаги определяли по методу, предложенному Strlič и соавт., с небольшими изменениями (Strlič et al., 2004). На бумагу наносили каплю дистиллированной воды и к влажной поверхности аккуратно прижимали электрод с плоским наконечником (Metrohm 6, 0253, 100); значение pH фиксировали через 30 с (когда оно стабилизировалось) с помощью pH-метра Metrohm 691 (Швейцария). Окончательный результат определяли как среднее значений, полученных в пяти различных точках.

Культуральные методы. Мазки проб культивировали на среде SDA (Sabouraud Dextrose Agar, “Merck”, Германия) для выделения грибов, на средах R2A (Reasoner’s 2A agar, “Merck”) и TSA (Tryptic Soy Agar, “Merck”) для выделения бактерий и на среде MGM (Modified Growth Medium) с общим содержанием солей 23% для выделения осмофильных и галофильных архей (Nikou et al., 2017). Среда MGM (23%) имела следующий состав (г л^–1): NaCl, 184; MgCl₂ · 6H₂O, 23; MgSO₄, 26.83; KCl, 7.76; NaBr, 0.61; пептон, 5.0; дрожжевой экстракт, 1.0, и агар, 18; pH доводили до 7.5 с помощью Трис-HCl. Для выделения грибов и бактерий чашки инкубировали 7 сут при 28°C, а для выделения архей ‒ 21 сут при 37°C.

После очистки изолятов и их первичной идентификации на основе морфологии колоний, данных микроскопии и биохимических тестов для бактерий (в том числе на каталазу и оксидазу), повторяющиеся штаммы были классифицированы и подсчитаны. Молекулярную идентификацию штаммов проводили путем амплификациии и секвенирования бактериальных генов 16S рРНК и фрагментов ITS грибов. Геномную ДНК изолятов выделяли с помощью специализированных наборов: Gram-positive bacteria mini-prep genomic DNA extraction kit (Iranian Biological Resource Center, IBRC) для бактерий и Plant Mini-Prep genomic DNA Extraction Kit (IBRC) для грибов, в соответствии с протоколом производителя. Качество выделенной ДНК оценивали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. Гены 16S рРНК изолятов бактерий амплифицировали с помощью универсальных праймеров 27F и 1492R; в изолятах грибов участок ITS амплифицировали с праймерами ITS4 и ITS5. Последовательности праймеров приведены в табл. S3 . Реакционная смесь имела следующий состав: 0.25 мкл Taq ДНК полимеразы (1 ед./мкл), 2.5 мкл ПЦР буфера (1×), 1.5 мкл MgCl₂ (2.5 мМ), 2 мкл dNTPs (0.6 мМ), по 0.5 мкл (0.4 мкМ) прямого и обратного праймеров, 1 мкл (20 нг) матрицы ДНК, стерильная деионизованная вода до общего объема 25 мкл. ПЦР проводили при следующих условиях: стартовая денатурация при 95°C (5 мин); 35 циклов денатурации при 94°C (20 с), отжига при 54°C (30 с) и синтеза при 72°C (45 с); заключительная достройка при 72°C (10 мин). Продукты ПЦР выявляли с помощью электрофореза в 1% агарозном геле с маркером 1 kb plus DNA ladder (“Sigma-Aldrich”). Продукты ПЦР очищали с помощью набора для экстракции из геля (IBRC, Иран) согласно инструкции и секвенировали в компании FAZA Biotech (Иран). Полученные последовательности редактировали с помощью программы Chromas Pro и сравнивали с геномными базами данных EzBioCloud и MycoBank для изолятов бактерий и грибов соответственно. Последовательности генов 16S рРНК и фрагментов ITS были выложены в базу данных NCBI (коды доступа приведены в табл. 1 и 2).

Оценка ферментативной активности. Выделенные штаммы были исследованы с точки зрения их способности разрушать основные органические соединения в составе манускрипта (целлюлозу, крахмал и белок). Для оценки целлюлозолитической, амилолитической и протеолитической активности изоляты грибов и бактерий высевали точечно на среды CMC Agar (состав, г л^–1: карбоксиметилцеллюлоза, 0.5; NaNO₃, 0.1; K₂HPO₄, 0.1; MgSO₄, 0.05; дрожжевой экстракт, 0.05; агар, 15), Starch Agar (“Himedia”, Германия) и Skim milk Agar (“Himedia”) соответственно. Чашки с культурами бактерий и грибов инкубировали при 28°C в течение 48 и 72 ч соответственно. Для обнаружения целлюлозолитической активности чашки окрашивали Конго красным (0.01%) и раствором йода по Граму и измеряли зону просветления (гало) вокруг колоний (Kasana et al., 2008). Чашки с крахмальным агаром окрашивали раствором йода по Граму. Амилолитическую и протеолитическую активность оценивали, измеряя диаметр светлой и прозрачной зоны на агаре с крахмалом и с обезжиренным молоком соответственно.

Выделение геномной ДНК из смеси фрагментов бумаги и мазков проводили с помощью коммерческого набора QIAamp Fast DNA Stool Mini-Kit (Germany) в соответствии с инструкцией изготовителя. Результат проверяли электрофорезом в 1.5% агарозном геле.

ПЦР. Для амплификации генов 16S рРНК прокариот и фрагментов ITS грибов использовался двухэтапный протокол ПЦР. На первом этапе проводили ПЦР с геноспецифичными праймерами, а на втором этапе использовали набор праймеров с адапторами (для совместимости матрицы с ячейкой) и индексными последовательностями (уникальными для каждого образца). В первом туре участок V3–V4 генов 16S рРНК бактерий и архей амплифицировали с метагеномными праймерами 0341F/0785R и 0349F/0785R. Фрагмент ITS2 грибов амплифицировали с праймерами ITS3F/ITS4R. Последовательности праймеров приведены в табл. S4 .

В первом туре ПЦР реакционная смесь имела следующий состав: 2.5 мкл буфера для ПЦР (1×), 2.5 мкл MgCl₂ (2.5 мМ), 1.5 мкл dNTPs (0.6 мМ), по 0.75 мкл (0.3 мкМ) прямого и обратного праймеров, 0.2 мкл Taq ДНК полимеразы (1 ед./мкл), 1 мкл (5 нг) матрицы ДНК, стерильная деионизованная вода до общего объема 25 мкл. Реакцию проводили при следующих температурных условиях: начальная денатурация при 95°C (5 мин); 25 циклов денатурации при 95°C (20 с), отжига при 55°C (30 с) и синтеза при 72°C (40 с); завершающая достройка при 72°C (10 мин). Чтобы проверить качество амплификации, продукты первого тура ПЦР анализировали в 1.5% агарозном геле с маркером размеров Gene ruler 50bp (“Thermo Scientific”). Далее продукт первого тура служил матрицей во втором туре ПЦР. Концентрации компонентов и температурные условия во втором туре ПЦР были такими же, как и в первом туре, с тем отличием, что проводилось 15 циклов реакции вместо 25 (последовательности праймеров с бар-кодами приведены в табл. S5 ). Продукты второго тура ПЦР наносили на агарозный гель (1.5%), разделяли электрофорезом, вырезали полосы с ампликонами длиной 480–580 п.н. и очищали их с помощью набора для экстракции из геля (“Qiagen”, Германия) в соответствии с протоколом производителя.

Подготовка библиотек и секвенирование. Концентрацию ДНК в препаратах очищенных ампликонов бактерий и грибов определяли с помощью набора Invitrogen™ Qubit™ dsDNA BR Assay Kit (Великобритания) и приводили к стандарту 10 нг л^–1. Затем препараты отправляли в компанию “Macrogen” (Korea) для секвенирования на платформе Illumina MiSeq 2 × 300.

Обработка и анализ данных секвенирования. Сырые данные FASTQ обрабатывали и анализировали с помощью программного пакета QIIME2-2019.4. После демультиплексирования исходных данных с помощью плагина q2-demux качество прочтений визуализировали на графике Interactive Quality и определяли параметры для удаления шумов. Парные прочтения объединяли командой qiime dada2 denoise-paired. Таксономическую классификацию операционных таксономических единиц (ОТЕ) проводили с помощью q2-feature-classifier, сравнивая репрезентативные последовательности с базами данных Greengenes (v. 13.8) для бактерий и UNITE (v. 8.3) для грибов. Следует отметить, что классификация грибов, используемая в нашей работе, соответствует ссылкам, приведенным в базе данных UNITE (Tedersoo et al., 2018). Необработанные риды FASTQ были выложены в раздел Sequence Read Archive (SRA) базы данных NCBI (номер доступа SRA: PRJNA658545).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Физические характеристики. При анализе образцов бумаги с золотым напылением с помощью ПЭСЭМ в режиме высокого вакуума среди целлюлозных волокон были видны клетки бактерий, конидии и мицелий грибов. По-видимому, присутствие микробного сообщества вызвало разрушение и расслаивание целлюлозных волокон (рис. 1). Среднее значение pH образцов ‒ 4.1.

Рис. 1.

Микрофотографии бумаги из манускрипта Al-adoviah al-Mufradah, полученные с помощью ПЭСЭМ в высоком вакууме с золотым напылением образцов. (а) Общий вид заселения целлюлозных волокон клетками бактерий (белая стрелка), мицелием и спорами грибов (красная стрелка). Видны кристаллы соли (синяя стрелка) и расслоение волокон целлюлозы. Увеличение 4000×. (б) Отдельные клетки бактерий и цепочки клеток; структуры с отростками, напоминающими конидии грибов. Можно отличить клетки бактерий (меньше 1 мкм, белая стрелка) от конидий грибов (красная стрелка). Увеличение 13 000×.

Микробное разнообразие по данным культуральных методов. Из проб, взятых с тестируемых участков, были выделены четыре штамма грибов и 11 штаммов бактерий; эти штаммы идентифицировали молекулярными методами. Следует отметить, что на чашках со средой MGM для выделения осмофильных и галофильных архей роста не наблюдалось, и культивируемых архей выделено не было. Результаты секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и ITS и их сравнения с базами данных EzBioCloud и MycoBank представлены в табл. 1 и 2 соответственно. Число колоний (КОЕ/см²), связанных с изолятами бактерий и грибов в различных местах рукописи приведено в табл. S1 и S2 .

Синтез гидролитических ферментов. Результаты тестов на продукцию ферментов гидролиза (целлюлаз, амилаз и протеаз) выделенными микробными штаммами приведены в табл. 3. Результаты оценивались по диаметру зоны просветления в соответствующих средах культивирования.

Применительно к результатам, полученным нами для изолятов бактерий и грибов (табл. 3), стоит отметить следующее. Три из девяти штаммов рода Bacillus, а именно: B1, B5 и B10 (родственные B. atrophaeus, B. velezensis и B. licheniformis соответственно), производили все три типа ферментов (целлюлазы, амилазы и протеазы). Для трех штаммов Bacillus, а именно: B2 (родственный B. mojavensis), B4 (родственный B. filamentosus) и B11 (B. idriensis), наблюдался синтез двух ферментов: амилазы и протеазы у B2 и целлюлазы и протеазы у B4 и B11. У двух других штаммов рода Bacillus, B8 (B. niacini) и B9 (родственного B. cheonanensis), наблюдался только один тип ферментативной активности: целлюлазная у B8 и протеазная у B9. У штамма B7 (родственного B. humi) гидролитическая активность отсутствовала. Два изолята, представляющих Ac-tinobacteria, B3 (Corynebacterium sanguinis) и B6 (родственный Streptomyces rochei), синтезировали только целлюлазу. Тесты на ферменты гидролиза у изолятов грибов показали, что три штамма (F1, F2 и F3), в том числе два штамма рода Aspergillus (родственные A. versicolor и A. sydowii) и один штамм рода Alternaria (Alt. alternata), проявляли все три типа активности. У изолята F4 (A. niger) был подтвержден синтез целлюлазы, но активности амилаз и протеаз не наблюдалось. Таким образом, подавляющее большинство изолятов бактерий и грибов (за исключением штаммов B2, B7 и B9) могли производить целлюлазу. Протеазная активность наблюдалась у меньшего числа изолятов, и часть штаммов (B3, B6, B7, B8, и F4) не проявляли протеазной активности. Амилазная активность наблюдалась у семи из 15 изолятов (B1, B2, B5, B10, и F1, F2, F3).

Микробное разнообразие по данным высокопроизводительного секвенирования. Результаты секвенирования на платформе Illumina были получены в форме двух файлов FASTQ, представляющих библиотеки грибов и бактерий. Тот факт, что в первом туре ПЦР не наблюдалось амплификации архейных генов 16S рРНК (участок V3–V4) указывает, что этот домен не представлен в составе микробного сообщества манускрипта.

Состав сообщества бактерий по данным секвенирования. После обработки данные по бактериям включали 6589 валидных ридов, которые были отнесены к 63 ОТЕ; в результате таксономической классификации были идентифицированы 20 родов и семь видов. Согласно данным метагеномного секвенирования, сообщество бактерий включало три филума. Самым многочисленным был филум Proteobacteria (74.16% ридов; 41 ОТЕ); за ним следовали Actinobacteria (16.57% ридов; 10 ОТЕ) и Firmicutes (9.12% ридов; 10 ОТЕ). На уровне класса, 70.92% ридов относились к Gammaproteobacteria, 16.57% ридов ‒ к Actinobacteria, 9.12% ридов ‒ к Bacilli и 3.25% ридов ‒ к Alphaproteobacteria. На уровне семейства наиболее многочисленными были Pseudomonadaceae (58.0%), Enterobacteriaceae (11.1%), Micrococcaceae (10.1%), и Bacillaceae (5.9%). Остальные 15% ридов составляли другие семейства бактерий. На уровне рода самыми многочисленными были представители Pseudomonas (58%), а самым многочисленным видом по числу ридов был Pseudomonas stutzeri (55.2%). Состав сообщества бактерий на уровне филумов, семейств и родов представлен на диаграммах рис. 2.

Рис. 2.

Доля в сообществе различных групп бактерий на уровне филумов (a), семейств (б) и родов (в).

Состав сообщества грибов по данным секвенирования. Данные, относящиеся к грибам, после удаления шумов, слияния и фильтрации химер включали 57 353 достоверных прочтений и были отнесены к 139 ОТЕ. Наиболее представленным по числу ридов и ОТЕ был филум Ascomycota: 96.55% ридов; 96 ОТЕ. Кроме того, в сообществе были обнаружены представители филумов Mucoromycota (1.70% ридов; 3 ОТЕ) и Basidiomycota (1.04% ридов; 26 ОТЕ); небольшое число оставшихся ридов были отнесены к Rozellomycota (0.41% ридов; 1 ОТЕ) и Entorrhizomycota (0.003% ридов; 1 ОТЕ). Всего в сообществе грибов было аннотировано 59 семейств, 62 рода и 54 вида. Наиболее представленным семейством оказались Aspergillaceae (92.0%). Наиболее многочисленными таксонами в сообществе оказались Penicillium (58.89%) и Aspergillus (33.02%) на уровне рода и Penicillium polonicum (55.45%) и Aspergillus ruber (22.55%) на уровне вида. Состав сообщества грибов на уровне филумов, семейств и родов представлен на диаграммах рис. 3.

Рис. 3.

Доля в сообществе различных групп грибов на уровне филумов (a), семейств (б) и родов (в).

ОБСУЖДЕНИЕ

Предварительный анализ фрагментов бумаги с помощью ПЭСЭМ выявил сравнительно плотное микробное обсеменение бумажных волокон, в том числе клетки бактерий и структуры грибов (конидии и мицелий). Изображения, полученные при меньшем увеличении, показали отложение кристаллов соли вдоль целлюлозных волокон, что может быть обусловлено процессами производства бумаги, проклейкой и примесями в материалах. Согласно исследованиям биодеградации объектов культурного наследия, некоторые бактерии и грибы, в том числе Aspergillus, Penicillium, Bacillus, Arthrobacter и Streptomyces, могут выделять органические кислоты, которые растворяют материал и образуют отложения соли, видимые на изображениях SEM (Bicchieri et al., 2019).

После предварительной оценки с помощью ПЭСЭМ с нескольких участков бумаги были неинвазивно взяты пробы, чтобы оценить жизнеспособность микроорганизмов. В результате последующего культивирования были выделены штаммы, представляющие сообщества бактерий и грибов. Поиск архей в микробном сообществе манускрипта, как культуральными методами, так и с помощью высокопроизводительного секвенирования, дал отрицательный результат. Данные, приведенные в табл. S1 и S2 , показывают, что плотность культивируемых микроорганизмов на единицу площади (КОЕ/см²) на первой и последней страницах была выше, чем в середине книги, возможно, потому, что эти страницы больше подвергались воздействию пыли и грязных рук.

Как отмечено выше, культуральными методами было выделено девять штаммов рода Bacillus; они были идентифицированы секвенированием генов 16S рРНК. Ранее сообщалось, что различные виды рода Bacillus участвуют в заселении и разрушении культурных артефактов из бумаги (Principi et al., 2011; Piñar et al., 2015). Бактерии этого рода, по-видимому, вносят вклад в развитие пятен фоксинга (Karakasidou et al., 2018), которые обильно присутствуют на исследуемом манускрипте. Среди штаммов, выделенных с манускрипта, был и штамм B. licheniformis. В работе Jacob et al. (2015) описано выделение этой бактерии из бумажных документов XIX в. Согласно этой статье, низкомолекулярные пептиды, синтезирумые B. licheniformis, могут действовать как внутренний фактор, сдерживающий развитие разрушающих сообществ грибков на поверхности бумаги (Jacob et al., 2015). Кроме того, выделение других видов рода Bacillus, в частности, B. atrophaeus, B. idriensis и B. niacini, согласуется с результатами более ранних исследований бактериальных сообществ бумажных объектов и целлюлозных материалов (Suihko, Stackebrandt, 2003; Gutarowska, 2016). Результаты секвенирования на платформе Illumina тоже указывают на присутствие членов рода Bacillus в микробном сообществе (4.9% ридов). За исключением B. muralis, эти риды были аннотированы до уровня семейства или рода, что объясняет более высокое разнообразие видов Bacillus, обнаруженных культуральным методом. B. muralis обнаруживали и в других исследованиях микробных сообществ культурных и исторических артефактов, например, настенных росписей в Испании и Германии (Heyrman et al., 2005), и бумажных манускриптов, например, “Атлантического кодекса” Леонардо да Винчи (Tarsitani et al., 2014).

Кроме того, с манускрипта были выделены и идентифицированы частичным секвенированием еще два вида: Corynebacterium sanguinis и Streptomyces rocheie (Actinobacteria). Наиболее существенное свойство актинобактерий ‒ устойчивый вторичный метаболизм пигментов и органических кислот, которые играют ключевую роль в биодеградации культурного наследия, окрашивая материалы и разрушая органические вещества (Duan et al., 2017). Согласно Jaén-Luchoro et al. (2020), штаммы C. sanguinis ранее выделялись из естественных (водных и промышленных) образцов. Этот вид имеет большое генетическое сходство с C. lipophyloflavum, видом с выраженной способностью к синтезу целлюлазы (Sakthivel et al., 2010; Jaén-Luchoro et al., 2020). В работе Sato et al. штаммы рода Streptomyces были выделены из пятен и поврежденных участков бумажных объектов, затопленных в результате цунами 2011 г. в Японии (Sato et al., 2014). С другой стороны, оценивалась также роль различных видов рода Streptomyces, в том числе S. rocheie, в разрушении древесины и целлюлозных материалов (Lupan et al., 2014). Результаты тестов на синтез ферментов указывают, что выделенные штаммы могут иметь потенциал к разрушению бумажных материалов.

Согласно данным секвенирования на платформе Illumina, самым представленным видом по числу ридов был P. stutzeri. Различные штаммы рода Pseudomonas ранее выделялись из памятников культуры (поверхность фрески) и окружающей воздушной среды (Pangallo et al., 2012); из-за высокой устойчивости к антимикробным биоцидам они могут вызывать вторичный микробный кризис (Bastian et al., 2009). Виды рода Pseudomonas не переносят кислых условий, и ни один из них не способен расти при pH ниже 4.5 (Lalucat et al., 2006). Можно сделать вывод, что в определенный момент манускрипт был заражен этим штаммом. Однако химический распад бумаги и синтез органических кислот вследствие грибковой колонизации привели к тому, что материал приобрел кислую реакцию pH (pH 4.1), и в результате рост и выживание штаммов Pseudomonas стали невозможны. С другой стороны, тот факт, что представители Pseudomonas не формируют спор, тоже повлиял на их плохую выживаемость и на невозможность выделить их культуральными методами.

Присутствие рода Promicromonospora (3.1% ридов) может быть связано с загрязнением среды, где хранилась рукопись, пылью и кутикулами насекомых (Mohammadipanah et al., 2017). Представители рода Arthrobacter (2.9% ридов) ранее идентифицировались в почве, в воздухе старых зданий и на культурных артефактах. Мембраны бактерий рода Arthrobacter содержат каротиноидные пигменты, например β-каротин и α-бактериоруберин. Таким образом, колонизация этими штаммами может привести к обесцвечиванию и развитию фоксинга (Piñar et al., 2015; Duan et al., 2017).

В сообществе были идентифицированы представители родов Escherichia (0.6%) и Enterobacter (0.5%), принадлежащих к семейству Enterobacteriaceae и включающих колиформные бактерии; следовательно, существовала возможность загрязнения манускрипта в результате контакта с грязными руками или фекалиями животных.

В нашей работе был аннотирован (на уровне рода или вида) также ряд других бактерий, которые ранее определялись в работах на бумажных материалах или других объектах культурного наследия, а именно: Carnobacterium и Salinibacterium, 2.9 и 2.0% ридов соответственно (Gutarowska 2016); Microbispora rosea, 1.7% ридов (Karbowska-Berent et al., 2011); Paracoccus marcusii, 1.6% ридов (Lupan et al., 2014); Cellvibrio, 1.21% ридов (Harkawy et al., 2011); Brachybacterium, 1.1% ридов (Zhgun et al., 2020); Virgibacillus picturae, 1.0% ридов (Sterflinger, Piñar, 2013).

Большинство видов рода Aspergillus, выделенных с манускрипта, в том числе A. versicolor, A. niger и A. sydowii, могут расти в условиях низкой доступности воды и играют значимую роль в разрушении архивных и библиотечных материалов, синтезируя ферменты гидролиза (Zghair, 2019). В то же время, результаты секвенирования на платформе Illumina показали, что представители Aspergillus составляли значительную долю сообщества (33.02%). Некоторые виды, идентифицированные этим методом, например, A. ruber (22.55%) и A. penicillioides (0.84%), ранее выделялись с целлюлозных материалов, например, исторических рукописей и музейных предметов из материала dluwang (ткань из коры, изготавливаемая путем отбивания коры тутового дерева); оценивалась их роль в разрушении бумаги и образовании кирпично-красных пятен (Oetari et al., 2016; Liu et al., 2018).

Согласно результатам секвенирования на платформе Illumina, наиболее многочисленным родом грибов был Penicillium (58.89%). Большинство видов рода Penicillium проявляют значительную ферментативную активность и могут разлагать органические вещества. Представители Penicillium выделялись из проб аэрозолей, отобранных в музеях, библиотеках и архивах, так что при наличии подходящих условий для роста они могут представлять собой угрозу для бумажных материалов (Karbowska-Berent et al., 2011; Zhang et al., 2019).

Род Alternaria ‒ еще одна составляющая сообщества грибов, обнаруживаемая как при культивировании, так и секвенированием. Различные виды Alternaria часто обнаруживаются в зонах хранения библиотек и архивов; известно, что они могут быть факторами биоразрушения бумаги и целлюлозных материалов (Mesquita et al., 2009).

Представители Chaetomiaceae, в том числе родов Chaetomium и Chaetomidium, составляли 1.4% ридов. Ранее оба рода выделялись из атмосферы хранилищ (Skóra et al., 2015) и объектов письменного наследия (Gutarowska, 2016). Представители этих родов синтезируют гидролитические ферменты и антибиотики и, таким образом, обладают разрушающей и бактериолитической активностью (Sterflinger, Piñar, 2013; Piñar et al., 2015).

Кроме того, секвенирование на Illumina выявило таксоны Mucor, Trichoderma, Chrysosporium, Acremonium и Scopulariopsis, которые также отмечались в предыдущих исследованиях грибковых сообществ библиотек и архивов (Pinheiro et al., 2011, 2019).

Проведенные тесты ферментативной активности (табл. 3) показали, что большинство микробных изолятов производят целлюлазу и несут риск разрушения объектов из бумаги. Выделение штаммов с протеолитической и амилолитической активностью может быть связано с возможным использованием на поверхности исторических бумаг животных клеев с белковой структурой и крахмальным наполнителем. В то же время, образцы с первой и последней страниц книги (прилегающих к кожаной обложке богатой коллагеном) могут послужить для выделения протеолитических штаммов.

Бумага рукописи имела кислую реакцию (pH 4.1). Под воздействием кислой среды волокна, состоящие из целлюлозных цепочек, регулярно распадаются на меньшие фрагменты. Присутствие закисляющих веществ в бумаге может быть связано с разными факторами, в том числе с абсорбцией загрязняющих веществ из воздуха и окружающей среды (оксиды серы и азота в воздухе, низкокачественные контейнеры) и с внутренними характеристиками бумаги (исходный материал и процесс производства). В то же время, грибы могут выделять соединения с кислой реакцией, чтобы изменить pH субстрата в соответствии со своими потребностями роста (Area, Cheradame, 2011). Некоторые виды Aspergillus (A. niger и A. versicolor) и Penicillium оказались способны значительно снижать pH среды (до 4 единиц pH). Поскольку бумажные материалы очень чувствительны к кислотному гидролизу, тот факт, что обычные виды грибков имеют выраженную способность синтезировать метаболиты с кислой реакцией, подразумевает ключевую роль сообщества грибов в их разрушении (Pinheiro et al., 2019).

Результаты нашей работы показали, что П-ЭСЭМ ‒ подходящий инструмент предварительного скрининга микробного заселения объектов из бумаги. Сравнение результатов, полученных культуральными методами и с помощью высокопроизводительного секвенирования, показало, что последний метод имел преимущество при описании микробного разнообразия исторических документов. С другой стороны, в обнаружении потенциально активных разрушительных штаммов главная роль принадлежит культуральным исследованиям и анализу ферментативной активности. Таким образом, наилучшим выбором было бы сочетать эти подходы для многофакторной оценки микробных сообществ. Вопрос о присутствии архей в микробных сообществах различных объектов исторического наследия и их участии в биоразрушении требует дальнейшего изучения.