1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Микробиология
  4. T. 91, № 4, 2022

Микробиология, 2022, T. 91, № 4, стр. 475-479

Филогения и реклассификация Rhodotorula pinalis как Fellozyma pinalis comb. nov.

А. В. Качалкин a, b, *

a Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
119991 Москва, Россия

b Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН
142290 Пущино, Россия

* E-mail: kachalkin_a@mail.ru

Поступила в редакцию 14.02.2022
После доработки 04.03.2022
Принята к публикации 05.03.2022

Полный текст (PDF)

Аннотация

Дана генетическая характеристика и проведен филогенетический анализ голотипа вида Rhodotorula pinalis, штамм ВКМ Y-2963. Полученные данные для ITS региона и D1/D2 доменов LSU размещены в генбанке NCBI (OM666053). Выявлена конспецифичность подмосковных штаммов Fellozyma sp. КБП 3851 со сфагновых мхов и Rh. pinalis ВКМ Y-2963 с хвойного опада. Полученные данные по филогении показали, что вид Rh. pinalis должен быть отнесен к роду Fellozyma. В данной работе публикуется новая комбинация Fellozyma pinalis comb. nov., зарегистрированная в базе MycoBank MB842988.

Ключевые слова: дрожжи, таксономия, Rhodotorula, Fellozyma, Chrysozymaceae, Pucciniomycotina

В настоящее время насчитывается около 2000 видов дрожжей, которые относятся к аскомицетовым и базидиомицетовым одноклеточным или диморфным грибам (Boekhout et al., 2021a). Систематика дрожжевых грибов, впрочем, как и любой другой группы микроорганизмов, к настоящему времени прошла сложный путь преобразований со сменой основных критериев и подходов к таксономии, и ведущая роль в таксономических исследованиях теперь отводится молекулярному филогенетичекому анализу (Boekhout et al., 2021b). В 2012 году внутренний транскрибируемый спейсер (ITS регион) рРНК был предложен в качестве универсального генетического маркера для грибов (Schoch et al., 2012). Однако еще ранее для многих типовых штаммов дрожжей были сделаны сиквенсы рибосомальных генов и проведены первые масштабные филогенетические исследования (Kurtzman, Robnett, 1998; Fell et al., 2000; Scorzetti et al., 2002). С этого же периода ведущие микробиологические журналы не принимали статьи с описаниями новых видов дрожжей без филогенетических данных по рибосомальным генам.

Текущие таксономические исследования многих групп мицелиальных грибов и дрожжей связаны с анализом генов рРНК (например, Liu et al., 2015a; Wang et al., 2015a; Kachalkin et al., 2019) и с мультигенным подходом для систематики высших таксонов (например, Liu et al., 2015b; Wang et al., 2015b; Li et al., 2020). Данные по ITS регионам широко используются для метабаркодинга грибного населения природных и антропогенных субстратов (например, Tedersoo et al., 2014; Kuznetsova et al., 2021). При метабаркодинге сравнение полученных данных с информацией о референсных штаммах не только дает представление о составе грибных группировок, но и помогают лучше понять разнообразие всего царства грибов, среди которого нам известно не более 5‒10% видов (Boekhout et al., 2021a).

Однако ранее при исследовании многих групп дрожжей, по тем или иным причинам, основной упор был сделан на данные о нуклеотидной последовательности гена большой субъединицы (LSU) рРНК. Особенно это касается аскомицетовых дрожжей, для ряда описанных видов нуклеотидные последовательности ITS региона неизвестны (данные YeastIP, http://genome.jouy.inra.fr/yeastip/). Поэтому в настоящее время требуется дополнительная генетическая характеристика коллекционных штаммов. Например, такая характеристика была сделана для дрожжей из коллекции CBS (Vu et al., 2016). Отсутствие данных о хотя бы одном генетическом маркере в настоящее время делает невозможным ни таксономические исследования, ни современную генетическую характеристику сообществ с помощью метабаркодинга.

Среди дрожжей видом с отсутствующими данными о генетических маркерах является Rhodotorula pinalis (Голубев, 2010), описание которого было сделано на изолятах с хвойного опада Pinus sylvestris. Цель данного исследования – генетическая характеристика и филогенетический анализ голотипа Rh. pinalis ВКМ Y-2963.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для исследования был использован голотип Rh. pinalis, штамм ВКМ Y-2963. Выделение ДНК проводили с применением стеклянной дроби (диаметром 300‒500 мкм) и лизирующего буфера (TrisBase 50 мM, NaCl 250 мM, ЭДТА 50 мM, SDS 0.3%; pH 8), используя гомогенизатор TissueLyser LT (“Qiagen”, Германия) и инкубирование при температуре 65°С. Для амплификации региона гена рРНК, содержащего ITS регион и D1/D2 домены LSU, использовали праймеры ITS1f (5'-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA) и LR5 (5'-TCC TGA GGG AAA CTT CG). Секвенирование ДНК проводили с помощью набора реактивов BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit (“Applied Biosystems”, США) с последующим анализом продуктов реакции на секвенаторе 3130xl Genetic Analyzer (“Applied Biosystems”, США) в ЗАО “Евроген” (Москва). Для секвенирования были использованы праймеры ITS5 и LR5. Полученная в ходе генетического исследования нуклеотидная последовательность размещена в генбанке NCBI под номером OM666053.

Выполнен филогенетический анализ для сравнения нуклеотидных последовательностей генов рРНК, полученных после секвенирования, и данные для типовых штаммов по недавним ревизиям дрожжей подотдела Pucciniomycotina (Wang et al., 2015a, 2015b; Li et al., 2020). Филогенетический анализ (Maximum Likelihood) на основе данных нуклеотидных последовательностей региона ITS1-5.8S-ITS2 и D1/D2 доменов LSU проводился с использованием программы MEGA v.6 (Tamura et al., 2013). GTR модель c гамма-распределением и инвариантными сайтами (G + I) использована в качестве модели нуклеотидных замен. Множественное выравнивание последовательностей выполнено в программе MAFFT v.7 (Katoh et al., 2019).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведенного исследования была получена нуклеотидная последовательность размером 1388 п.н. для штамма ВКМ Y-2963, содержащая ITS регион и D1/D2 домены LSU рДНК. Используя эти данные, был проведен поиск (BLASTn) через генбанк NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) и базу данных MycoID (www.mycobank.org) для обнаружения схожих нуклеотидных последовательностей. Результаты поиска по генбанку NCBI показали сходство 100% с нуклеотидной последовательностью LSU региона штамма Fellozyma sp. КБП 3851 (= (,/gh) КБП Y-6581, CBS 11782, DSM 108826), выделенным в ходе исследования дрожжевого населения сфагновых мхов в Московской области (Качалкин и соавт., 2008). Сравнение ITS регионов штаммов КБП 3851 и ВКМ Y-2963 показало различие в 1 п.н. (сходство 99.8%). Сходство 99.8‒100% ITS региона и D1/D2 доменов рДНК соответствует уровню внутривидовой вариабельности для дрожжей (Vu et al., 2016). Проведенный поиск в базе данных MycoID показал отсутствие культур со сходством 99‒100% по ITS региону со штаммом ВКМ Y-2963. Таким образом, полученные нами результаты указывают, что для типового штамма (голотипа) Rh. pinalis ВКМ Y-2963 в генбанке NCBI и базе MycoID отсутствуют данные о нуклеотидных последовательностях ITS региона и/или D1/D2 доменов LSU, но имеется информация о другом представителе этого вида дрожжей – Fellozyma sp. КБП 3851.

В качестве генетической характеристики вида Rh. pinalis при описании было указано различие по рДНК с близкородственным видом Sporobolomyces inositophilus (нынешнее название Fellozyma inositophila) – четыре нуклеотида в D1/D2 доменах и более 20 нуклеотидов в ITS регионах (Голубев, 2010). Полученные нами результаты показали, что различие по рДНК с типовым штаммом F. inositophila CBS 7310 составляет шесть нуклеотидных замен и шесть делеций в D1/D2 доменах по данным секвенирования 2016 г. (NG_066180) и четыре нуклеотида – по данным 1999 г. (AF189987). Различие между сиквенсами D1/D2 доменов за разные годы для штамма F. inositophila CBS 7310 составляет 0.80% (5 делеций). Используя данные ITS региона, различия Rh. pinalis ВКМ Y-2963 и F. inositophila CBS 7310 составляют 18 замен и 18 делеций по данным секвенирования 2001 г. (AF444559) и 18 замен и 19 делеций – по данным 2016 г. (KY103411). Различие между ITS сиквенсами за разные годы для штамма F. inositophila CBS 7310 составляет 0.16% (одна делеция). Таким образом, приведенная генетическая характеристика в описании вида Rh. pinalis соответствует полученным нами данным для голотипа ВКМ Y-2963. В то же время ситуация с достаточно сильно различающимися сиквенсами D1/D2 доменов для типового штамма F. inositophila CBS 7310 требует прояснения в будущем. Несмотря на это, полученные результаты показывают, что вид Rh. pinalis, действительно, является близкородственным F. inositophila. Различие между штаммами CBS 7310 и ВКМ Y-2963 соответствует межвидовому уровню по данным нуклеотидных последовательностей ITS региона и D1/D2 доменов (Vu et al., 2016).

Монотиповой род Fellozyma был выделен в ходе ревизии полифилетических родов базидиомицетовых дрожжей подотдела Pucciniomycotina: Bensingtonia, Bullera, Rhodosporidium, Rhodotorula, Sporidiobolus и Sporobolomyces и др. (Wang et al., 2015a). С внедрением принципа “Один гриб = одно имя” (McNeill et al., 2012) подобные полифилетические роды подвергаются такономическим ревизиям. Такие таксономеческие изменения базируются на молекулярномом филогенетичеком анализе (например, Liu et al., 2015a; Wang et al., 2015a), но если для того или иного описанного вида дрожжей отсутствуют данные в виде сиквенсов в публично доступном генбанке NCBI, то вид просто не включается в ревизию. Именно такая ситуация и произошла с Rh. pinalis, который должен был бы быть переописан вместе с видом Sp. inositophilus как род Fellozyma (Wang et al., 2015a).

Проведенный филогенетический анализ для представителей семейства Chrysozymaceae, близкородственных к Fellozyma, на основании нуклеотидных последовательностей ITS региона и D1/D2 доменов LSU рДНК показал достоверную поддержку клада (бутстрэп 100%), который объединяет штаммы F. inositophila CBS 7310 и Rh. pinalis ВКМ Y-2963, а также штамм Fellozyma sp. КБП 3851 (рис. 1). Выявленные вариации в сиквенсах F. inositophila CBS 7310 за разные периоды располагаются на начальном участке прочтения нуклеотидных последовательностей, поэтому они не учитывались при филогенетическом анализе. Полученные нами данные по филогении подтверждают, что виды F. inositophila и Rh. pinalis должны быть отнесены к одному роду. В данной работе публикуется новая комбинация для рода Fellozyma.

Рис. 1.

Филогенетический анализ для представителей семейства Chrysozymaceae на основе нуклеотидных последовательностей ITS региона и D1/D2 доменов рДНК. Бутстрэп более 50% (отмечен на древе) получен для 1000 альтернативных построений. В скобках указаны номера нуклеотидных последовательностей для типовых штаммов.

Новая комбинация для рода Fellozyma Q.M. Wang, F.Y. Bai, M. Groenew. & Boekhout.

Fellozyma pinalis (Golubev) Kachalkin, comb. nov. MycoBank MB842988.

Базионим: Rhodotorula pinalis Golubev, Микология и Фитопатология 44(4):310. 2010.

Голотип: ВКМ Y-2963 (хранится в метаболически неактивном состоянии).

New combination for Fellozyma Q.M. Wang, F.Y. Bai, M. Groenew. & Boekhout.

Fellozyma pinalis (Golubev) Kachalkin, comb. nov. MycoBank MB842988.

Basionym: Rhodotorula pinalis Golubev, Mikolo-giya i Fitopatologiya 44(4):310. 2010.

Holotype: VKM Y-2963 (preserved in a metabolically inactive state).

Список литературы

  1. Голубев В.И. Новый вид Rhodotorula, ассимилирующий миоинозит // Микология и фитопатология. 2010. Т. 44. С. 310–313.

  2. Golubev W.I. A new myo-inositol-positive species of the genus Rhodotorula // Mikologiya i Fitopatologiya. 2010. V. 44. P. 310–314.

  3. Качалкин А.В., Глушакова А.М., Юрков А.М., Чернов И.Ю. Особенности дрожжевых группировок в филлосфере сфагновых мхов // Микробиология. 2008. Т. 77. С. 533–541.

  4. Kachalkin A.V., Glushakova A.M., Yurkov A.M., Chernov I.Yu. Characterization of yeast groupings in the phyllosphere of sphagnum mosses // Microbiology. 2008. V. 77. P. 474–481.

  5. Lücking R., Aime M.C., Robbertse B., Miller A.N., Aoki T., Ariyawansa H.A., Cardinali G., Crous P.W., Druzhinina I.S., Geiser D.M., Hawksworth D.L., Hyde K.D., Irinyi L., Jeewon R., Johnston P.R., Kirk P.M., Malosso E., May T.W., Meyer W., Nilsson H.R., Öpik M., Robert V., Stadler M., Thines M., Vu D., Yurkov A.M., Zhang N., Schoch C.L. Fungal taxonomy and sequence-based nomenclature // Nat. Microbiol. 2021. V. 6. P. 540–548.

  6. Boekhout T., Amend A.S., El Baidouri F., Gabaldón T., Geml J., Mittelbach M., Robert V., Tan C.S., Turchetti B., Vu D., Wang Q.-M., Yurkov A. Trends in yeast diversity discovery // Fungal Diversity. 2021a. https://doi.org/10.1007/s13225-021-00494-6

  7. Boekhout T., Aime M.C., Begerow D., Gabaldón T., Heitman J., Kemler M., Khayhan K., Lachance M.-A., Louis E.J., Sun S., Vu D., Yurkov A. The evolving species concepts used for yeasts: from phenotypes and genomes to speciation networks // Fungal Diversity. 2021b. V. 109. P. 27–55.

  8. Fell J.W., Boekhout T., Fonseca A., Scorzetti G., Statzell-Tallman A. Biodiversity and systematics of basidiomycetous yeasts as determined by large-subunit rDNA D1/D2 domain sequence analysis // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. V. 50. P. 1351–1371.

  9. Katoh K., Rozewicki J., Yamada K.D. MAFFT online service: multiple sequence alignment, interactive sequence choice and visualization // Brief. Bioinform. 2019. V. 20. P. 1160–1166.

  10. Kurtzman C.P., Robnett C.J. Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences // Antonie van Leeuwenhoek. 1998. V. 73. P. 331–371.

  11. Kuznetsova T.A., Vecherskii M.V., Khayrullin D.R., Stepankov A.A., Maximova I.A., Kachalkin A.V., Ushakova N.A. Dramatic effect of black soldier fly larvae on fungal community in a compost // J. Sci. Food Agric. 2021. https://doi.org/10.1002/jsfa.11601

  12. Li A.H., Yuan F.X., Groenewald M., Bensch K., Yurkov A.M., Li K., Han P.J., Guo L.D., Aime M.C., Sampaio J.P., Jindamorakot S., Turchetti B., Inacio J., Fungsin B., Wang Q.-M., Bai F.-Y. Diversity and phylogeny of basidiomycetous yeasts from plant leaves and soil: Proposal of two new orders, three new families, eight new genera and one hundred and seven new species // Stud. Mycol. 2020. V. 96. P. 17–140.

  13. Liu X.Z., Wang Q.-M., Göker M., Groenewald M., Kachalkin A.V., Lumbsch H.T., Millanes A.M., Wedin M., Yurkov A.M., Boekhout T., Bai F.-Y. Towards an integrated phylogenetic classification of the Tremellomycetes // Stud. Mycol. 2015a. V. 81. P. 85–147.

  14. Liu X.Z., Wang Q.-M., Theelen B., Groenewald M., Bai F.-Y., Boekhout T. Phylogeny of tremellomycetous yeasts and related dimorphic and filamentous basidiomycetes reconstructed from multiple gene sequence analyses // Stud. Mycol. 2015b. V. 81. P. 1‒26.

  15. McNeill J., Barrie F., Buck W., Demoulin V., Greuter W., Hawksworth D. et al. International Code of Nomenclature for Algae, Fungi, and Plants (Melbourne Code). Königstein: Koeltz Scientific Books, 2012. 208 p.

  16. Schoch C.L., Seifert K.A, Huhndorf S., Robert V., Spouge J.L., Levesque C.A., Chen W., Fungal Barcoding Consortium. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. V. 109. P. 6241–6246.

  17. Scorzetti G., Fell J.W., Fonseca A., Statzell-Tallman A. Systematics of basidiomycetous yeasts: a comparison of large subunit D1/D2 and internal transcribed spacer rDNA regions // FEMS Yeast Res. 2002. V. 2. P. 495–517.

  18. Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., Kumar S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0 // Mol. Biol. Evol. 2013. V. 30. P. 2725–2729.

  19. Tedersoo L., Bahram M., Põlme S., Kõljalg U., Yorou N.S., Wijesundera R., Villarreal Ruiz L., Vasco-Palacios A.M., Thu P.Q., Suija A., Smith M.E., Sharp C., Saluveer E., Saitta A., Rosas M., Riit T., Ratkowsky D., Pritsch K., Põldmaa K., Piepenbring M., Phosri C., Peterson M., Parts K., Pärtel K., Otsing E., Nouhra E., Njouonkou A.L., Nilsson R.H., Morgado L.N., Mayor J., May T.W., Majuakim L., Lodge D.J., Lee S.S., Larsson K.H., Kohout P., Hosaka K., Hiiesalu I., Henkel T.W., Harend H., Guo L.D., Greslebin A., Grelet G., Geml J., Gates G., Dunstan W., Dunk C., Drenkhan R., Dearnaley J., De Kesel A., Dang T., Chen X., Buegger F., Brearley F.Q., Bonito G., Anslan S., Abell S., Abarenkov K. Fungal biogeography. Global diversity and geography of soil fungi // Science. 2014. V. 346. Art. 1256688.

  20. Vu D., Groenewald M., Szöke S., Cardinali G., Eberhardt U., Stielow B., de Vries M., Verkleij G.J., Crous P.W., Boekhout T., Robert V. DNA barcoding analysis of more than 9000 yeast isolates contributes to quantitative thresholds for yeast species and genera delimitation // Stud. Mycol. 2016. V. 85. P. 91–105.

  21. Wang Q.-M., Groenewald M., Takashima M., Theelen B., Han P.J., Liu X.Z., Boekhout T., Bai F.-Y. Phylogeny of yeasts and related filamentous fungi within Pucciniomycotina determined from multigene sequence analyses // Stud. Mycol. 2015b. V. 81. P. 27–53.

  22. Wang Q.-M., Yurkov A.M., Göker M., Lumbsch H.T., Leavitt S.D., Groenewald M., Theelen B., Liu X.Z., Boekhout T., Bai F.-Y. Phylogenetic classification of yeasts and related taxa within Pucciniomycotina // Stud. Mycol. 2015a. V. 81. P. 149–189.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Микробиология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал