Микробиология, 2022, T. 91, № 4, стр. 391-409

Кефирные зерна: структура и функции

Кефирные зерна представляют собой дискретные структуры, состоящие из белка (4‒5%), полисахарида (9‒10%), называемого кефираном, в которых содержится сложная микробиота (Leite et al., 2013: Градова и соавт., 2014). Их можно описать как студенистые белые или слегка желтоватые нерегулярные массы с эластичной консистенцией и размером от 0.3 до 3.5 см в диаметре (рис. 1, 2). Изучение кефирных зерен в микроскопе показало, что поверхности зерен кефира были гладкими, бугристыми и имели желатиновое матричное вещество, которое покрывало скопления клеток сверху в виде тонкой полисахаридной пленки.

Рис. 1.

Кефир и кефирное зерно (по Leitte et al., 2013).

Рис. 2.

Микроструктура кефирных зерен в электронном сканирующем микроскопе (JSM-7600F, Япония): наружный слой кефирного зерна (а); внутренний слой (б) (по Wang et al., 2012).

Микробиота кефирных зерен представлена кокками и короткими и длинными палочками, которые находятся в тесном соседстве с дрожжевыми клетками вытянутой формы. Короткие палочки, предположительно Lactobacillus kefir, расположены ближе к поверхности стромы, а длинные и изогнутые тонкие палочки, такие как Lactobacillus kefiranofaciens ‒ по всему объему матрикса, и концентрация их увеличивается к центру. Кокки, преимущественно, располагаются на поверхности дрожжевых клеток, в то время как палочки находятся в пространстве между дрожжевыми клетками. Дрожжи наиболее прочно связаны со стромой кефирных зерен, они концентрируются как в центре зерна, так и на поверхности. Плотность расположения микробных клеток во внутренней части кефирных зерен ниже, чем на поверхности (Wang et al., 2012). Количество микроорганизмов на поверхности и внутри зерен зависит от их отношения к кислороду, а также связано с различиями значений рН. Внутри зерен очень низкое значение рН, что ингибирует рост лактококков. В связи со слабой адгезирующей способностью лактоккоков L. lactis, многие исследователи при использовании электронной микроскопии не обнаруживали их присутствие в составе кефирных зерен, несмотря на то, что L. lactis определяли как один из доминирующих видов в тех же зернах при использовании других методов выделения (Cheirsilp et al., 2003; Jianzhong et al., 2009).

Точный микробный состав кефирных зерен до сих пор остается спорным. В кефирах на основе зерна было обнаружено до 50 различных видов бактерий и дрожжей, выделенных из кефиров разных мест производства (Pogačić et al., 2013). Наиболее распространенными бактериальными родами в зернах кефира из молока являются МКБ, на долю которых приходится около 37‒90% микробной популяции (Yüksekdag et al., 2004; Miguel et al., 2010; Zanirati et al., 2015), но имеются и уксуснокислые бактерии, дрожжи и грибки (Witthuhn et al., 2005; Yanget al., 2007; Mayoa et al., 2012; Gao et al., 2012, 2013). Различные сообщения (Prado et al., 2001; Kotova et al., 2016) свидетельствуют о том, что микробный состав кефирного зерна в значительной степени зависит от происхождения зерна, местных условий культивирования (табл. 1).

Из молочнокислых бактерий преобладающими видами являются лактобациллы, такие как Lactobacillus paracasei ssp. paracasei, L. acidophilus, L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. plantarum и L. kefiranofaciens, составляющие лишь 20% от общего количества МКБ (Gao et al., 2007; Wang et al., 2012; Zanirati et al., 2015), но встречаются мезофильные гомоферментативные лактококки Lactococcus spр. (Magalhaes et al., 2011; Garofalo et al., 2015), термофилы Streptococcus thermophilus (Simova et al., 2002; Kok-Tas et al., 2012; Guzel-Seydium, 2015), виды гетероферментативных лактобацилл и лейконостоков Leuconostoc spр. ‒ стрептококков, продуцирующих молочную и уксусную кислоты, углекислый газ, этиловый спирт, декстран и ароматические вещества ацетоин и диацетил (Diosma et al., 2014; Walsh et al., 2016). В Китае выделены уксуснокислые бактерии, например, Acetobacter fabarum (Yang et al., 2007; Jianzhong et al., 2009ж Gao et al., 2012), а Acetobacter pasteurianus ‒ из кефиров, выработанных в странах Европы (Франция, Бельгия, Италия, Швейцария (Kok-Tas et al., 2012; Garofalo et al., 2015; Korsak et al., 2015). Уксуснокислые бактерии, выделенные из молочных продуктов, относятся к роду Acetobacter, являются подвижными грамотрицательными палочками, которые располагаются поодиночке, попарно, цепочками. У некоторых штаммов могут присутствовать инволюционные формы: сферические, изогнутые, нитевидные и т.д. Спор и капсул не образуют. Окисляют спирт до уксусной кислоты в аэробных условиях (так называемое уксуснокислое брожение), некоторые могут окислять ацетат и лактат до CO₂ и H₂O, лактозу не гидролизуют (Montaghi et al., 1997).

В составе микробиоты кефиров производства китайских и турецких фирм обнаружены энтерококки Е. durans (Yang et al., 2007; Kesmen, Kacmaz, 2011). Многочисленная группа молочнокислых бактерий рода Enterococcus, включающая Е. durans, ранее относилась к стрептококкам серологической группы D и Е; они колонизируют кишечник человека в первые недели его жизни и являются незаменимой культурой, участвующей в процессах переработки пищи (Сычева, Карташова, 2015).

Кефир отличается от других кисломолочных продуктов тем, что он не является результатом метаболической активности одного или нескольких видов микроорганизмов.

В состав кефирного зерна входят различные виды сбраживающих и не сбраживающих лактозу, спорообразующих и неспорообразующих дрожжей (по разным данным от 4 до 30 разных видов), среди которых наиболее часто упоминаются Kluyveromyces marxianus, Candida kefyr, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces unisporus, Torulospora delbrueckii, Pichia fermentans и синонимы названий этих видов (табл. 2). Однако преобладающими видами являются Saccharomyces cerevisiae, S. uni-sporus, Candida kefyr и Kluyveromyces marxianus ssp. marxianus (Fleet, 1990; Assadi, 2000; Loretan et al., 2003; Witthuhn et al., 2004, 2005; Kok-Tas et al., 2012; Diosma et al., 2014). Особенность, которая отличает кефир от других кисломолочных продуктов, заключается в том, что в зернах кефира содержится много дрожжей (Tamang et al., 2016). Дрожжи признаны играющими ключевую роль в приготовлении ферментированных молочных продуктов, где они обеспечивают необходимые питательные вещества для роста, такие как аминокислоты и витамины, изменяют рН, выделяют этанол и производят CO₂. Дрожжи в кефире изучены менее, чем бактерии, хотя дрожжи в зернах явно обеспечивают среду, благоприятную для роста бактерий кефира, производя метаболиты, которые способствуют аромату и органолептическим свойствам (Farnworth, 2005). Более 23 различных видов дрожжей были выделены из зерен кефира и из ферментированных напитков различного происхождения.

Дифференциация и идентификация микробиома кефирных зерен

Первоначальная дифференциация микроорганизмов сообщества включает комплекс фенотипических признаков, основанных на изучении морфологических и физиолого-биохимических свойств. Наиболее распространенными бактериями в зернах кефира и кефире являются МКБ, на долю которых приходится от 37 до 90% микробной популяции. Эти виды микроорганизмов подразделяются на четыре группы: гомоферментативные и гетероферментативные молочнокислые бактерии и дрожжи, ассимилирующие и не ассимилирующие лактозу (Gao et al., 2012). Анаэробное культивирование при выделении чистых культур бактерий проводили анаэробно при комнатной температуре (21°С) на агаризованной среде MРС в чашках Петри (90 мм). В таких условиях культуры вырастают за 3–5 сут. Чистые анаэробные культуры получали методом истощающего штриха. После посевов чашки помещали в анаэростат, куда вносили газ-пакет. При применении стандартных микробиологических методов высева на агаризованную среду трудно обеспечить необходимую полноту выделения компонентов кефирных зерен. Морфологические характеристики колоний некоторых микроорганизмов могут быть настолько близки, что их легко принять за идентичные культуры, в то время как колонии, мало различающиеся морфологически, могут быть образованы одним и тем же микроорганизмом (Сычева, Карташова, 2015). Так, например, в неоптимальных или неблагоприятных для роста условиях при длительном воздействии физических, химических, биологических стрессов на микроорганизмы наблюдалось выщепление минорных фенотипов (субпопуляций) молочнокислых бактерий, oбразование жизнеспособных некультивируемых форм (Расhomov et al., 2018).

МКБ – филогенетически неродственные микроорганизмы, гетерогенные по морфологии: палочковидные и шаровидные (кокки сферической или эллипсовидной формы), которые характеризуют как грамположительные, не образующие капсул, спор (за исключением сем. Sporolactobacillaceae), не образуют пигмент, кроме Leuconostoc citreum, образующего капсулы и желтый пигмент, не восстанавливают нитраты в нитриты. Каталазо- и оксидазо-отрицательные, лишенные цитохромов, аэро- и кислототолерантные, неподвижные, образующие в качестве конечного метаболита молочную кислоту в различном процентном содержании (Ленглер и соавт., 2005).

Исторически известны бактерии, относящиеся к родам Lactococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Vagococcus, Tetragenococcus, Carnobacterium, Bifodobacterium, но Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, Bifodobacterium формируют ядро этой группы, а в последнее время к ним были добавлены такие рода как Oenococcus, Weissella, Fructobacillus (Ленглер и соавт., 2005; Lahtinen et al., 2012; Стоянова, 2017). Род Lactobacillus по морфологии характеризуются большим разнообразием – от коротких коккообразных до длинных нитевидных палочек от 0.7‒1.1 до 3.0‒8.0 мкм, расположенных единично или собранные в цепочки. Часто длина определяется средой выращивания. Использование биохимического метода идентификации при работе со смешанной популяцией микроорганизмов ограничено еще и тем, что после высева пробы жидкой культуры на плотную питательную среду, для установления соотношения бактерий двух разных видов необходимо выделить чистую культуру и исследовать все колонии, выросшие на поверхности среды, что существенно увеличивает экономические и трудовые затраты. Актуальным вопросом является поиск более эффективного метода для решения поставленной задачи. Молекулярно-генетические методы идентификации зарекомендовали себя как надежные и независящие от внешних факторов.

Для идентификации лактобацилл классические микробиологические методы (по культуральным признакам, морфологии, окраске по Граму, подвижности, наличию каталазы и спектру сбраживаемых углеводов) дополняют молекулярно-генетическими методами на основе анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК, используя программное обеспечение MegAlign 6.00 DNASTAR Inc. Однако высокая стабильность нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК не позволяет однозначно идентифицировать близкородственные виды. Среди лактобацилл встречаются мночисленные виды и подвиды филогенетически близких групп L. casei, L. plantarum, L. buchneri, L. acidophilus, трудно поддающихся точной дифференциации, что приводит к поиску новых генетических маркеров. Для использования анализа нуклеотидной последовательности видовой идентификации рекомендовано идентифицировать маркерные гены, анализ которых позволяет оценить связанность всего генома между микроорганизмами (Blaiotta et al., 2008). Анализ генов groEL, rplB и rpoB позволил выявить высокую полиморфность их нуклеотидных последовательностей у представителей филогенетической группы L. casei и достоверно идентифицировать фенотипические и генетически близкие виды этой группы лактобацилл (Shvetsov et al., 2011). При этом дискриминационная способность данных генов в несколько раз превышает ген 16S рРНК. Нуклеотидные последовательности были анализированы и объединены в общую последовательность в программном обеспечении SeqScape 2.6.0 (“Applied Biosystems”).

К важным дифференцирующим признакам дрожжей относится их способность окислять и сбраживать различные углеводы, в том числе мальтозу, сахарозу, галактозу, трегалозу и др. Дрожжи способны расти в довольно широком диапазоне рН от 3 до 9, при этом предпочитают кислые среды (рН_опт 4.5‒5.5). Дрожжи относятся к осмофильным микроорганизмам, некоторые из них способны выдерживать концентрацию сахаров до 55%, соли ‒ до 8%. По способности к ассимиляции лактозы несколько десятков штаммов дрожжей разных таксономических групп предложено разделить на три группы:

I ‒ использующие лактозу и способные вызывать ее брожение;

II ‒ использующие лактозу путем прямого окисления;

III ‒ не использующие лактозу.

Для сравнения микробного профиля кефирных зерен, наряду с классическими методами выделения чистых культур, был использован метод денатурирующего градиентного гель-электрофореза (DGGE). Данный метод признан наиболее информативным при сравнении микробных сообществ, поскольку он позволяет изучать микробный профиль без выделения чистых культур. При использовании метода DGGE также не было выявлено принципиальных различий микробного профиля между исследованными образцами кефирных зерен (Mayoa et al., 2012). Доминирующими по степени четкости выраженных полосок являлись 7 видов микроорганизмов. Отмечены некоторые различия среди наиболее малочисленных групп микроорганизмов, образующих трудноразличимые полоски. Таким образом, в результате проведенной работы не было выявлено различий в микробных профилях кефирных зерен, используемых на разных молочных производствах России. Об этом свидетельствуют результаты исследований, проводимых как “с выделением чистых культур” и их последующей идентификацией с помощью анализа гена 16S рРНК, так и метода денатурирующего градиентного гель-электрофореза (DGGE) “без выделения чистых культур” (Magalhães et al., 2011; Shevtsov et al., 2011).

Комбинация всех вышеуказанных фено- и генотипических характеристик привела к возникновению нового полифазного метода дифференциации.

С целью молекулярной идентификации выделенных чистых культур бактерий проводили высокопроизводительное секвенирование гена 16S рРНК с бактериальными праймерами. ДНК из образцов выделяли с использованием Fast DNA Spin Kit for Soil (“MP Biomedicals”, США) в соответствии с инструкцией производителя. Коллекции ампликонов 16S рРНК были получены методом ПЦР с универсальными праймерами к V4 региону по ранее описанной методике (Yang et al., 2007; Mayoa et al., 2012). Были использованы следующие праймеры: 515F (5'-GTGBCAGCMGCCGCGGTAA-3' (Стоянова, 2017) и Pro-mod-805R (5'-GACTACNVGGGTMTCTAATCC-3' (Karaçali et al., 2018). Секвенирование проводили на приборе MiSeq system (“Illumina”, США) с использованием набора реагентов, считывающих по 150 нуклеотидов с каждого конца. Демультиплексирование, последующая обработка и анализ полученных сиквенсов были проведены с использованием соответствующих скриптов QIIME 2 программного обеспечения ver. 2019.1. Таблица OTU была составлена в программе SILVAngs (https://ngs.arb-silva.de/silvangs/).

Высокопроизводительное секвенирование дрожжей по области ITS1 комплекса 18S-ITS1-5.8S-ITS2-28S рРНК проводили после амплифицирования ДНК выделенных дрожжей с использованием набора праймеров для ПЦР ITS1F и ITS1R. После амплификации полученные участки очищали магнитными шариками AMPure XP (“Beckman Coulter”, США) и готовили к секвенированию с помощью набора Nextera XT DNA в соответствии с инструкциями производителя (“Illumina”, США).

После каналов UPARSE сиквенсы были собраны, отфильтрованы и дереплицированы. Операционные таксономические единицы (OTUs) были объединены в группы с идентичностью последовательности ≥97%, из которых были удалены химеры. Таксономическая идентичность была присвоена с использованием BLASTn и справочной базы данных Fittings v. 1-2. Таксономия и операционные таксономические единицы были преобразованы в таблицу с помощью программы biom-format V1.3.1 (Fonseca et al., 2007).

Программное обеспечение MEGAN использовалось для получения таксономической классификации микробов и отображения разнообразия кефирного зерна в соответствии с таксономией NCBI (Zamberi et al., 2016). На рис. 3 показан род Lactobacillus как наиболее распространенный (99.03%). Вторым по численности родом в зерне кефира была филлобактерия с общим содержанием 0.11%, за которой следовали ацинетобактер, стрептококк и бактероиды в следовых количествах. На рис. 4 показано разнообразие кефирного зерна на уровне видов, причем наиболее распространенными видами являются Lactobacillus kefiranofaciens, за которыми следует L. kefiri (91.66 и 2.52% соответственно).

Рис. 3.

Таксономическое дерево, полученное в результате анализа MEGAN для кефирного зерна на уровне рода (по Zanirat et al., 2015). Пятно указывает на наиболее распространенный род.

Рис. 4.

Таксономическое дерево, полученное в результате анализа MEGAN для кефирного зерна на уровне вида (по Zamberi et al., 2016). Пятно указывает на наиболее распространенный вид.

Невозможность объективного определения структуры сообщества кефирных зерен на основании выделения чистых культур показана многими авторами, изучающими ассоциативные культуры.

Метаболические и структурные взаимодействия дрожжей и бактерий

Полученные данные по идентификации позволили сделать вывод, что в кефирных зернах основным продуцентом системы могут быть молочнокислые бактерии, относящиеся к физиологической группе, активно использующих лактозу для молочнокислого брожения. Микроорганизмы, относящиеся к другой группе, используют продукты метаболизма лактозы (глюкозу и галактозу) и могут находиться между собой либо в отношениях пассивного антагонизма, либо кооперации. Изучая молочнокислое брожение в динамике развития культур было установлено, что химические превращения в среде изменяются по ходу развития. При сбраживании углеводов ясно можно различить две фазы. В первый период (логарифмическая фаза роста бактерий) идет интенсивный синтез белков и других веществ клетки, которые являются более восстановленными, чем углеводы. В среде накапливаются более окисленные продукты обмена. Вторая фаза характеризуется замедлением биосинтеза, происходит постепенное снижение окислительно-восстановительного потенциала в культуре, что приводит к ускорению передачи протонов на ФГК с последующим восстановлением ее в молочную кислоту. Двухфазность отражает перераспределение окислительно-восстановительных реакций по ходу биосинтеза структурных элементов клетки бактерий ‒ конструктивных процессов и брожения ‒ энергетического процесса. Тесные симбиотические отношения молочнокислых бактерий и дрожжей, стимулирующее действие дрожжей на рост молочнокислых бактерий, показано многими исследователями (Motaghi et al., 1997; Aziza et al., 2012; Стоянова и соавт., 2017).

Сложные взаимодействия между дрожжами и бактериями, а также их зависимость от микробного состава кефирных зерен еще не полностью осознаны. Однако когда бактерии отделяются от зерна, дрожжи не будут расти так эффективно (Cheirsilp et al., 2003; Farnworth, Mainville, 2008; Rattray, O’Connel, 2011). Взаимодействие между дрожжами и МКБ занимает центральное место в широком спектре ферментированных продуктов, в частности, в кефире (Han et al., 2018). Обе группы микроорганизмов естественным образом поддерживают друг друга различными способами.

Усвоение молочной кислоты. Один интересный механизм взаимодействия между дрожжами и МКБ осуществляется в присутствии ассимилирующих молочную кислоту дрожжей. Накопление молочной кислоты повреждает и убивает лактобактерии, даже когда рН культуры поддерживается добавлением щелочных растворов (Katakura et al., 2010). Однако молочная кислота может потребляться в качестве источника углерода дрожжами, не потребляющими лактозу, такими как S. cerevisiae, что приводит к повышению рН и длительному росту лактобактерий. Физиологической особенностью МКБ является их кислотоустойчивость, как следствие характерного для них энергетического обмена. Кислотный стресс вызывает внутриклеточное подкисление, которое снижает активность цитоплазматических ферментов (Miyoshi et al., 2013). Транскриптомные и протеомные исследования показали, что многие МКБ повышают уровень активности гликолитических ферментов при кислотном, термическом и осмотическом стрессах, но без увеличения синтеза молочной кислоты. Хотя исследования, посвященные выяснению механизма образования диацетила, проводятся давно, единого мнения о том, как идет биосинтез этого соединения у молочнокислых бактерий до настоящего времени нет. Один из путей образования диацетила – синтез из L-ацетолактата как одного из промежуточных продуктов метаболизма цитрата. Это соединение нестабильное, выделяется бактериальными клетками в среду, где окислительно декарбоксилируется в диацетил и неокислительно – в ацетоин. Другой путь – через конденсацию ацетальдегида-тиаминпирофосфата и ацетил-КоА не признан большинством исследователей, т.к. не выделены ферменты, катализирующие реакции. Ацетат выделяется во внешнюю с среду, а оксалоацетат декарбоксилируется с образованием пирувата. Диацетил образуется в реакции ацетил-КоА с “активным ацетоальдегидом” (комплекс фермент–оксиэтилтиаминпирофосфат). При восстановлении диацетила ацетоиндегидрогеназой образуется ацетоин (рис. 5).

Рис. 5.

Сбраживание глюкозы у Lactococcus lactis в аэробных условиях (по Miya et al., 2003): ЛДГ – лактатдегидрогеназа; ПДГ – пируватдегидрогеназа; ПФЛ – пируват-формиатлиаза; α-AЛС – α-ацетолактатсинтаза.

Лактобациллы, такие как Lactobacillus plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus и лактококки L. lactis модифицируют метаболизм пирувата за счет молочной кислоты, и, таким образом, увеличивают синтез основных соединений, богатые энергией промежуточные продукты, такие как АТФ и НАД, ЭПС и/или гликоген. Уровень лактатдегидрогеназы (ЛДГ), которая отвечает за синтез молочной кислоты из пирувата, заметно снижается. Пируватоксидаза и фосфатацетилтрансфераза, используемые для синтеза ацетил-коферментаА (ацетил-КоА), индуцируются у Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus и L. rhamnosus в условиях кислотного стресса. Ацетил-КоА перенаправляется на биосинтез жирных кислот, которые могут уcиливать прочность и непроницаемость цитоплазматической мембраны (Leile et al., 2013).

Образование CO₂/удаление O₂. Углекислый газ может обеспечить подходящую атмосферу (пониженное содержание кислорода и повышенное содержание CO₂) для роста Lactobacillus spp. Несмотря на то, что отсутствуют исследования микроорганизмов, выделенных из кефира, исследования других сообществ и микроорганизмов, выделенных из пищи, подтверждают это взаимодействие. Углекислота, вырабатываемая дрожжами, способствует появлению резкого кислого и дрожжевого вкуса кефира (Karaçali et al., 2018).

Обеспечение бактерий питательными веществами. Трофические взаимодействия и обмен метаболитами (перекрестное питание) позволяют нескольким группам микроорганизмов выживать при ограниченных ресурсах. Было показано, что дрожжи помогают бактериям, обеспечивая их витаминами, факторами роста и незаменимыми аминокислотами (Pahva et al., 2010; Ponomarova et al., 2017). Исследования показали (Stadie et al., 2013), что Zygotorulaspora florentina выделяет незаменимые аминокислоты, которые поддерживают рост L. nagelii при совместном культивировании, но не в том случае, если они культивируются как монокультура.

Для изучения деталей перекрестного питания метаболитами между S. cerevisiae и двумя группами МКБ (Lactobacillus plantarum или Lactococcus lactis) были проведены эксперименты, где в модельных системах с использованием комбинированных метаболических и генетических инструментов (Ponomarova et al., 2017) было замечено, что избыток азота в среде культивирования способствует возникновению мутуализма (форма взаимополезного сожительства, когда присутствие партнера становится обязательным условием существования каждого из них) дрожжей с L. lactis. Взаимовлияние между L. lactis и S. cerevisiae легко возникает, когда лактоза является основным источником углерода. Это еще раз подчеркивает тот факт, что состав питательной среды играет важную роль в формировании межвидовых взаимодействий.

Сложные взаимодействия между дрожжами и бактериями, а также их зависимость в кефирных зернах еще не полностью изучены. Однако когда бактерии отделяются от зерна, дрожжи не будут расти так эффективно (Ratarura et al., 2010). Взаимодействие между дрожжами и МКБ занимает центральное место в широком спектре ферментированных продуктов, в том числе в кефире. Разные группы микроорганизмов естественным образом поддерживают друг друга различными способами (Aziza et al., 2012).

Для определения трофических взаимодействий между микробными компонентами представлены исследования физиологической активности выделенных изолятов из кефирных зерен (около 33 изолятов бактерий и 55 изолятов дрожжей). Выявлено присутствие двух физиологических групп молочнокислых бактерий по их способности синтезировать фермент β-галактозидазу, необходимую для сбраживания лактозы, и показано, что выделенные дрожжи не обладали β-галактозидазной активностью, не использовали лактозу, а активно использовали глюкозу и с низкой активностью ‒ галактозу, не образовывали сгусток на молоке. Подход, основанный на оценке физиологической активности выделенных изолятов молочнокислых бактерий, позволяет утверждать, что продуцентом системы микробного сообщества являются молочнокислые бактерии, относящиеся к первой физиологической группе, обладающие β-галактозидазной активностью, использующие лактозу для молочнокислого брожения и быстро закисляющие систему. Присутствие в системе нескольких видов молочнокислых бактерий, обладающих β-галактозидазной активностью, говорит о том, что между бактериями этой группы должны существовать определенные регулирующие факторы развития: либо конкурентные взаимоотношения за субстрат, либо смена основного продуцента в зависимости от условий, в частности, изменение рН среды (Cheirsilp, Radchabut, 2011). Общая схема трофической цепи ассоциативной культуры кефирных зерен, в составе которых входят 3 группы МКБ: синтезирующие и не синтезирующие β‑галактозидазу, с репрессивным синтезом β-галактозидазы группа МКБ, а также уксуснокислые бактерии и дрожжи представлена на рис. 6.

Рис. 6.

Общая схема трофической цепи ассоциативной культуры кефирных зерен, сбраживающих и не сбраживающих лактозу (изменено по Cheirsilp, Radchabut, 2011). 1 – молочнокислые бактерии, синтезирующие β-галактозидазу; 2 – молочнокислые бактерии группы 1, у которых синтез β-галактозидазы репрессирован глюкозой; 3 – молочнокислые бактерии, не синтезирующие β-галактозидазу; 4 – дрожжи; 5 – уксуснокислые бактерии.

В зависимости от среды и условий культивирования микробиота кефирных зерен и кефирной закваски обладает уникальной способностью к саморегуляции. Симбиоз микроорганизмов в кефирных зернах обеспечивает сохранение на всем протяжении года качества кефира и микробного профиля кефирных зерен, лишь с незначительными изменениями соотношений основных групп микроорганизмов. Микробный состав кефира может отличаться от микробного состава кефирных зерен из-за различий в условиях рН, времени культивирования, а также это различие может быть связано с местом нахождения микроорганизмов в зернах. Так, например, молочнокислые бактерии р. Lactococcus, располагающиеся на поверхности кефирных зерен, легко десорбируется в культуральную жидкость и поэтому в кефире их достаточно много (Градова и соавт., 2014).

Ферментация и сохранение кефирных зерен

Основным маркером для оценки симбиотических отношений между различными микроорганизмами является увеличение биомассы кефирного зерна во время ферментации. Ассоциативная микробная культура кефирных зерен является устойчивым высокоорганизованным сообществом, обладающим сложными вертикальными и горизонтальными трофическими связями. Основными продуктами брожения углеводов молока при производстве кефира являются молочная кислота, этанол (в низком содержании) и CO₂, которые придают этому напитку вязкость, кислотность и остроту. Также можно найти второстепенные компоненты, в том числе диацетил, ацетальдегид и аминокислоты, входящие в состав ароматизаторов (Rattray, O’Connel, 2011). Во время брожения зерна увеличиваются в размере и количестве и обычно извлекаются из ферментированного молока и повторно используются. При правильном хранении они могут сохранять свою активность в течение многих лет (Lopitz-Otsoa et al., 2006; Garrote et al., 2010; Rattra, O’Connel, 2011; Leite et al., 2013). Высушенные зерна сохраняют свою активность в течение 12‒18 месяцев, в то время как влажные зерна сохраняют активность в течение 8‒10 дней. Были протестированы различные методы консервирования, при этом замораживание считается лучшим методом. Лиофилизация зерна также была протестирована, но привела к снижению метаболизма лактозы, а также изменениям бактериального профиля, который отличался от исходного профиля зерна (Farnworth et al., 2008). Кефир можно употреблять сразу после отделения зерна или хранить в холодильнике для последующего употребления (Otles et al., 2003). Характеристики ферментированного молока должны сохраняться во время хранения; однако, поскольку может происходить непрерывная метаболическая активность остаточной микробиоты кефира, состав охлажденного кефира может изменяться во время хранения (Gronnevik et al., 2011). Сообщается, что при хранении в холодильнике при температуре 4°C вязкость со временем резко снижается (Magra et al., 2012), в то время как общий жир, лактоза, сухое вещество и рН остаются постоянными до 14 дней хранения (Vieira et al., 2015), а количество молочной кислоты незначительно увеличивается после 7 дней хранения. Хотя липолитическая активность молочного жира в лабораторных условиях ограничена, он все еще может способствовать выработке свободных жирных кислот (Kim et al., 2002).

На производство кефира влияют несколько факторов: сырье, технология производства, условия хранения кефира и используемых кефирных зерен, которые необходимо оптимизировать параллельно для достижения наилучшего качества продукта. Повышение температуры культивирования с 20 до 30°С приводило к увеличению количества дрожжей (от 7.1 × 10⁶ до 10⁷ КОЕ/г кефирного зерна и от 1.2 × 10⁵ до 1.7 × 10⁶ КОЕ/мл в закваске), уксуснокислых бактерий (от 10⁵ до 10⁷ КОЕ/г в зерне и от 4.2 × 10⁴ до 7.0 × 10⁶ КОЕ/мл в закваске) и незначительно влияло на количество мезофильных молочнокислых бактерий в составе кефирных зернах (Schoevers, Britz, 2003; Хохлачева и соавт., 2006).

Однако в составе закваски более высокая температура ферментации 25°С приводила к быстрому снижению значений рН, что вызывало ингибирование роста гомо- и гетероферментативных молочнокислых стрептококков. В закваске, приготовленной при 25°С, отмечено большее количество молочнокислых палочек, чем в закваске, приготовленной при 18–20°С. В результате исследований было обнаружено, что все штаммы, относящиеся к этому виду, могут активно развиваться в температурном интервале 20‒30°С, а при 35°С культуры развивались очень слабо (Londero et al., 2012). Все штаммы образуют максимальную биомассу при 25°С. Биомасса, образованная при 25°С, превышает биомассу, образованную при 20°С, в 1.3‒1.9 раз, а при 30°С – в 1.2‒1.8 раз (Хамагаева, Ванданова, 2006). При встряхивании в процессе культивирования наблюдались увеличение продукции экзополисахаридов культурами кефирного грибка и существенные различия в качественном и количественном составе зерен. Так, при встряхивании снижалось количество дрожжей и молочнокислых бактерий в кефирных зернах, но при этом значительно увеличивалось содержание углеводов и жиров (Schoevers, Britz, 2003). На основании скрининга полисахарид-синтезирующих молочнокислых бактерий показано, что из 119 исследованных изолятов 60% способны синтезировать экзополисахариды. Из них отобраны 9 изолятов, наиболее активно синтезирующих экзополисахариды. Отмечено повышение активности синтеза экзополисахаридов на среде с сахарозой молочнокислыми бактериями, способными ее сбраживать. Отобраны культуры Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides как наиболее активные продуценты экзополисахаридов при культивировании их на среде с лактозой и сахарозой. При сравнительном исследовании экзополисахаридов из кефирных зерен и синтезированных монокультурами методами ИК-спектроскопии и методом динамического и статистического светорассеивания показана аналогичность структуры ЭПС, но обнаружены различия физико-химических свойств полученных образцов экзополисахаридов с потенциальной пребиотической активностью.

Кефиран ‒ это полисахарид кефирных грибков, который образуется уксуснокислыми бактериями и дрожжами, вовлеченных в процесс сбраживания молока. Он обладает противомикробным и ранозаживляющим свойствами, способностью снижать кровяное давление и уровень холестерина в сыворотке крови. Кефиран в концентрациях 5.9–14.3 г/л способен образовывать криогели, способные плавиться при 37°С, что может найти применение при разработке новых пищевых продуктов. Причем при добавлении сахарозы или фруктозы в разных концентрациях к растворам кефирана можно изменять вязкость полученных гелей (Градова и соавт., 2012; Zavala, 2015). Аэрация при культивировании кефирного зерна в молоке способствовала увеличению продукции экзополисахаридов и вызывала существенные различия в качественном и количественном составе зерен.

Кефирные зерна ‒ это сложный симбиоз нескольких видов микроорганизмов: молочнокислых стрептококков и палочек, уксуснокислых бактерий и дрожжей. С помощью таких зерен можно каждый день получать кефир в домашних условиях. В последнее время популярность среди населения “кефирных зерен” неуклонно растет.

Кефирные зерна увеличивают свою массу в результате роста микроорганизмов и биосинтеза компонентов зерна ‒ белков и полисахаридов. Микробиоту кефирного зерна можно считать биопленкой. Процессы, управляющие образованием биопленки, включают создание поверхности для прочного прикрепления клеток к этой поверхности, межклеточные взаимодействия и рост сложной структуры. Сообщалось о формировании биопленок некоторыми видами и описан ряд генов, которые, как полагают, отвечают за адгезию или образование биопленки. Образование биопленки может помогает клеткам противостоять стрессу окружающей среды, такому как высокие концентрации кислоты и этанола.

Кефир содержит легкоусвояемые белки. Незаменимые минорные кислоты, в изобилии содержащиеся в кефире, регулируют белковый, углеводный и липидный обмен и оказывают положительное влияние на регуляцию массы тела, поддержание иммунного ответа и энергетического баланса. Пептиды проявляют антиоксидантную и антимикробную активность в молочном кефире, полученном в результате протеолиза β-казеина; было обнаружено 236 пептидов, которые проявляли антимикробные, антиоксидантные, ингибирующие ангиотензинпревращающий фермент (АПФ), иммуномодулирующие и антитромботические эффекты (Hamet et al., 2013; Ebner et al., 2015). Выделенный из тибетского кефира и очищенный пептид F3 проявлял антибактериальные свойства в отношении кишечной палочки и золотистого стафилококка (Miao et al., 2016). Идентифицировано 35 пептидов из кефира, приготовленного из коровьего молока, которые проявляли антигипертензивный эффект, опосредованный ингибированием активности АПФ (Amorim et al., 2019). Продукт богат аминокислотами, такими как серин, треонин, аланин, лизин, валин, изолейцин, метиоин, фенилаланин и триптофан, которые играют важную роль в центральной нервной системе, а также содержит метаболиты, которые способствуют перевариванию казеина и усвоению его организмом (Bensmira et al., 2015).

Известно, что пробиотические культуры кефира могут регулировать иммунную систему для подавления вирусных инфекций. Противовирусный механизм кефира включает усиленную продукцию макрофагов, усиленный фагоцитоз, повышенную продукцию с положительной дифференциацией CD4+/CD8+ как биомаркер ответа на лечение, иммуноглобулинов (IgG+ и IgA+), В‑клеток, Т-клеток, нейрофилов, определенная часть которых при необходимости способны вырабатывать антитела. Молочнокислые бактерии из кефира повышают цитотоксичность натуральных клеток-киллеров по отношению к опухолевым клеткам (Yamane et al., 2018). Кефир может действовать как противовоспалительное средство за счет снижения экспрессии интерлейкинов IL-1 и IL-6, синтезируемых макрофагами и T-клетками и стимулирующих иммунный ответ, a интерфероны IFN-α и II типа (IFN-γ) индуцируют антивирусную защиту. Под влиянием чужеродных антигенов вырабатывается повышенное количество цитокинов ‒ медиаторов воспалительного процесса, выполняющих регуляторные функции, которые, в свою очередь, продуцируют повышенное образование IL-6, вызывают активацию Т-лимфоцитов и других иммунных клеток и их миграцию, приводящее к развитию признаков “цитокинового шторма” при коронавирусной инфекции. Поэтому кефир может быть важным ингибитором “цитокиновой бури”, способствующей развитию COVID-19 (Nakagaki et al., 2018; Boyoglu-Barnum et al., 2019; Bornstein et al., 2020).