Микробиология, 2022, T. 91, № 5, стр. 519-536

ЭЛЕКТРОН-ТРАНСПОРТНЫЕ ЦЕПИ, УЧАСТВУЮЩИЕ В ПОГЛОЩЕНИИ КИСЛОРОДА КЛЕТКАМИ МКБ

Восстановление кислорода в электрон-транспортной цепи Lactiplantibacillus plantarum. Электрон-транспортная цепь (ЭТЦ) клеток L. plantarum WCFS1, формируемая в аэробных дыхательных условиях (после добавления в среду гема и менахинона) содержит НАДН-дегидрогеназу (Ndh1), пул менахинонов (витамин K₂) и цитохромов bd-типа. Данный участок ЭТЦ способен активироваться и восстанавливать низкие концентрации кислорода. Однако следует подчеркнуть, что оксидаза bd-типа из клеток L. plantarum WCFS1 не была выделена и очищена для сравнения ее свойств с классическими цитохромоксидазами bd (рис. 1; Brooijmans et al., 2009a).

Рис. 1.

Предполагаемая электрон-транспортная цепь у Lactiplantibacillus plantarum WCFS1, разветвленная на уровне оксидаз. Пунктирные стрелки показывают внеклеточное происхождение менахинона и гема. Ndh – НАДН-дегидрогеназа, MQ – менахинон, MQH₂ – менахинол (по Brooijmans et al., 2009a).

Одной из предложенных классификаций МКБ (табл. 1) является ранжирование видов по их способности к восстановлению кислорода в зависимости от наличия или отсутствия генов cydABCD, кодирующих синтез цитохром bd-оксидазного комплекса (Pedersen et al., 2012). Те МКБ, которые не способны к внутриклеточному восстановлению кислорода, не имеют генов cyd. Необходимо отметить, что близкородственные виды не обязательно находятся в одной категории по наличию ферментов восстановления O₂.

Анализ данных, приведенных в табл. 1, показывает, что для восстановления кислорода представителям семейства Streptococcaceae необходим экзогенный гем в питательной среде, тогда как для основного пула изученных культур МКБ необходимо внесение еще и менахинона. Интересно отметить, что патогенные стрептококки, приспособившись к развитию в организмах животных, утратили гены, необходимые для восстановления кислорода. Этот факт подтверждает предположение, выдвинутое голландской группой (Brooijmans et al., 2009а), что эволюционные предшественники МКБ имели группы генов, кодирующие оксидазы, однако со временем утеряли их вследствие множественных делеций при переходе к преимущественно анаэробному образу жизни. Те же МКБ, которые сохранили способность к аэробному дыханию, рассматривают в настоящее время как потенциально активные пробиотические и стартовые культуры для молочной и мясной промышленности из-за их большей устойчивости к кислородным стрессам.

Гем как вспомогательный компонент электрон-транспортной цепи. Процесс восстановления кислорода у факультативно анаэробной МКБ Lc. lactis можно индуцировать добавлением предшественников гема, что приводит к повышению эффективности роста культуры с удвоением выхода биомассы, а также выживаемости клеток в условиях аэрации. У лактококков улучшается рост в присутствии O₂ и протопорфирина IX в среде из‑за адаптивной перестройки метаболизма с брожения на дыхание (Duwat et al., 2001; Shi et al., 2016). Показано, что ген cydA, кодирующий цитохром d-оксидазу и непосредственно участвующий в поглощении кислорода, а также ген hemZ, кодирующий феррохелатазу (конвертирует протопорфирин IX в гем), экспрессируются в поздней логарифмической стадии роста культур Lc. lactis в аэробных условиях (Duwat et al., 2001).

Как биоактивная молекула, гем может вовлекаться не только в процесс восстановления кислорода. Например, некоторые лактобактерии, включая и те, что неспособны к поглощению O₂, синтезируют активную гем-зависимую каталазу при росте в аэробных условиях в присутствии гематина, защищающую клетки от эндогенного H₂O₂ (Wolf et al., 1991; Frankenberg et al., 2002). Ни один представитель молочнокислых бактерий не способен к синтезу гема, поэтому им необходима транспортная система, обеспечивающая его поглощение. Например, у Lс. lactis эту функцию выполняет оперон fhuDBAR (Gaudu et al., 2003; Pedersen et al., 2012). Затем гему необходимо связаться с мембраной клетки. Он может быть включен в состав белков-шаперонов. Хорошим кандидатом на роль гем-связывающего белка является алкилгидропероксидредуктаза (AhpC, один из ключевых белков окислительного стресса), которая способна защитить внутриклеточный гем от деградации (Lechardeur et al., 2010). Другой комплекс – CydCD, который входит в состав цитохром bd-оксидазы вместе с CydAB, активен в восстановленных условиях и транспортирует цистеин и глутатион, которые могут способствовать взаимодействию CydAB с гемом (Pittman et al., 2005).

Несмотря на то, что гем играет важную роль в реакциях поглощения и элиминации токсичного кислорода (Kumar, Bandyopadhyay, 2005), клеткам необходимо также наличие механизмов, обеспечивающих выведение гема, во избежание токсических эффектов самого гема (Pedersen et al., 2012). Так, Lс. lactis обладает специальной системой оттока гема (HrtRBA), максимальная активность которой наблюдается во время избытка гема, что препятствует накоплению последнего. Следует отметить, что среди многочисленных МКБ, обладающих системами HrtRBA и/или Pef (менее строгая система, выводящая из клеток помимо гема еще и протопорфирин IX), некоторые штаммы не обладают способностью поглощать кислород (Pedersen et al., 2012).

Восстановление кислорода с участием менахинонов. Менахиноны (МХ) – это ассоциированные с мембранами сложные органические соединения с окислительно-восстановительными свойствами, относящиеся к витаминам типа К₂. Они представляют собой нафтоидное кольцо, ковалентно связанное с гидрофобной изопреноидной цепью, состоящей из повторяющихся изопреновых единиц. В качестве центрального компонента ЭТЦ менахиноны переносят электроны от восстановителей (например, дегидрогеназ) к оксидоредуктазам (например, CydAB). Инактивация синтеза нафтоидных колец у Lс. lactis препятствует дальнейшему процессу восстановления кислорода, но только если в комплекс не входит экзогенный менахинонон (Rezaïki et al., 2008; Brooijmans et al., 2009b).

Можно предположить, что каждый тип менахинона выполняет определенную функцию, так как их биосинтез не прекращается даже в отсутствие кислорода. Помимо ЭТЦ с участием CydAB, экзогенные менахиноны переносят электроны от белковых комплексов, таких как нитратредуктазы и фумаратредуктазы, в процессах анаэробного дыхания у L. plantarum (Brooijmans et al., 2009b). Кроме того, менахиноны снижают внутриклеточную концентрацию меди и железа (Rezaïki et al., 2008; Tachon et al., 2009).

Таким образом, молочнокислые бактерии, не способные к синтезу необходимых для восстановления кислорода соединений, используют для активации этого процесса экзогенный гем или, в случае некоторых видов, гем и менахинон (Pedersen et al., 2012; Lin et al., 2016). Активация гемом и/или менахиноном процесса поглощения кислорода уменьшала его негативное воздействие за счет положительной регуляции центрального углеводного и энергетического метаболизмов и сохранения оптимального окислительно-восстановительного баланса, что приводило к улучшению роста и повышению аэротолерантности ряда штаммов МКБ (Siciliano et al., 2019).

ДЕЙСТВИЕ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА НА КЛЕТКИ

Окислительные повреждения клеток. На молекулярном уровне продукты неполного восстановления кислорода или, как их еще называют, активные формы кислорода (${\text{O}}_{2}^{{ \bullet - }},$ ОН^• и Н₂О₂) могут вступать в реакции с белками, липидами и нуклеиновыми кислотами. Супероксид анион-радикал имеет умеренный окислительный потенциал и может взаимодействовать с полифенолами, аскорбатом и катехоламинами, а также с молекулами нуклеиновых кислот (Fridovich, 1998). Кроме того, ${\text{O}}_{2}^{{ \bullet - }},$ быстро диффундирующий в клетки, повреждает белки, содержащие [Fe-S]-кластеры, например, фумаразу или фумаратредуктазу (Amanatidou et al., 2001). Воздействие H₂O₂ приводит к карбонилированию белков и непосредственному окислению цистеиновых остатков в белковых молекулах, вызывая, таким образом, инактивацию многих ферментов (Storz, Imlay, 1999; Arcanjo et al., 2019). Пероксид водорода также может вступать в реакцию с катионами, такими как Fe²⁺ и Cu⁺, и приводить к образованию ОН^• по реакции Фентона (Duwat et al., 1995; Fridovich, 1998). Гидроксил-радикал, образуемый в реакции супероксид анион-радикала с пероксидом водорода, является сильным и весьма реакционноспособным окислительным агентом, который может окислять большинство органических соединений и разрывать (а также модифицировать) цепи ДНК и РНК, особенно опасно его воздействие на гемопротеины и липиды (Czapski, 1984; Fridovich, 1998; Kang et al., 2013).

Активные формы кислорода у бифидо- и лактобактерий могут образовываться через НАД(Ф)Н-оксидазные системы (рис. 2). В частности, у Bifidobacterium bifidum основным продуцентом H₂O₂ является дигидрооротатдегидрогеназа типа b, очищенная из НАДН-оксидазной фракции белков (Satoh et al., 2019), а у B. longum ssp. infantis аэробное образование H₂O₂ обусловлено НАДФН-оксидазой (Tanaka et al., 2018). Многие виды микроорганизмов, в том числе и МКБ, в ходе эволюции сформировали эффективные и тонко регулируемые антиоксидантные системы защиты, такие, как внутриклеточные окислительно-восстановительные циклы с участием тиолов (глутатиона [GSH] и тиоредоксина [TRX]), ферменты антиоксидантной защиты (каталаза и супероксиддисмутаза, которые играют взаимодополняющую и синергичную роль в биохимических путях удаления АФК) и электрон-транспортные цепи восстановления кислорода (с участием гема и/или менахинона). Эти системы защищают клетки от окислительных стрессов, уменьшая потенциальные повреждения макромолекул от АФК, и помогают поддерживать оптимальный окислительно-восстановительный потенциал, что способствует защите клеток и от многочисленных иных стрессовых воздействий в окружающей среде – осмотических, кислотных, температурных и т.д. (Zhang, Li, 2013).

Рис. 2.

Антиоксидантные системы в клетках молочнокислых бактерий. АФК – активные формы кислорода, GSH – глутатион, TRX – тиоредоксин (по Zhang, Li, 2013).

Влияние окислительных стрессов на метаболизм МКБ. Многие последствия влияния кислорода и его активных форм заметны и на метаболическом уровне. Например, Lс. lactis в анаэробных условиях способен преобразовывать различные углеводы в молочную кислоту. В этих условиях две молекулы НАДН, полученные в ходе окисления глицеральдегид-3-фосфата, окисляются, чтобы способствовать превращению пирувата в молочную кислоту под действием лактатдегидрогеназы. Соотношение НАДН/НАД⁺ играет определяющую роль в контроле сдвига от молочнокислого к смешанному брожению у Lс. lactis (Garrigues et al., 1997). Пируватдегидрогеназный комплекс катализирует восстановление НАД⁺ при окислении пирувата. Функционирование этого пути также подтверждается накоплением ацетата. Кроме того, ацетатный путь производит одну молекулу АТФ, что энергетически выгодно по сравнению с образованием молочной кислоты (Vido et al., 2004; Rezaïki et al., 2008). Таким образом, уменьшение содержания НАДН в клетке коррелирует со снижением образования лактата в условиях дыхания по сравнению с брожением.

При культивировании пробиотических МКБ Lactobacillus acidophilus и Bifidobacterium spp. в присутствии кислорода (5‒21%) образование молочной кислоты клетками L. acidophilus уменьшалось с возрастанием концентрации O₂, как и соотношение лактат/ацетат для бифидобактерий; специфические активности НАДН-оксидазы и НАДН-пероксидазы в аэробных условиях у многих МКБ были существенно выше, чем при анаэробиозе (Talwalkar, Kailasapathy, 2003).

Исследования, проведенные на L. plantarum, показали, что, в дополнение к использованию O₂ (через цитохром bd-оксидазу), эта бактерия может также использовать фумарат и нитрат в качестве акцепторов электронов. Такое анаэробное дыхание по-прежнему требует гема в качестве кофактора. Инактивация НАДН-дегидрогеназы у L. plantarum делает невозможным аэробное дыхание, однако при этом не влияет на анаэробное нитратное дыхание, что говорит о наличии других доноров электронов при анаэробном метаболизме (Pedersen et al., 2012).

Анализируя энергетический метаболизм Lc. lactis (рис. 3), можно предположить, что ингибирование молочнокислого брожения (обычно гомоферментативного) в процессе дыхания и в присутствии гема способствует окислению НАДН в цепи переноса электронов с помощью цитохром bd-оксидазы (Arioli et al., 2013).

Рис. 3.

Упрощенное представление гомоферментативного и гетероферментативного видов молочнокислого брожения и гем-зависимого дыхания у Lc. lactis IL1403 (по Arioli et al., 2013). Стрелки показывают метаболические потоки. Глюкоза катаболизируется до пирувата посредством гликолиза с образованием АТФ и НАДН. Регенерация НАД⁺ происходит во время зависящего от гема дыхания. Избыток пирувата может метаболизироваться пируватформиатлиазой (ПФЛ), пируватдегидрогеназой (ПДГ) и ацетолактатсинтазой (АЛС). Также показана анаплеротическая реакция, катализируемая пируваткарбоксилазой (ПК). Ген субъединицы I цитохромоксидазы обозначен как cydA. ЛДГ – лактатдегидрогеназа.

Таким образом, можно сделать вывод, что в аэробных условиях НАДН-оксидаза и НАДН-пероксидаза (см. табл. 2) конкурируют с лактатдегидрогеназой (ЛДГ) в отношении НАДН (Murphy, Condon, 1984). Следовательно, синтез молочной кислоты при аэробиозе уменьшается, и гликолитический поток смещается в сторону продукции ацетата, этанола, ацетоина, диацетила и CO₂ (смешанное брожение) под действием пируватдегидрогеназы, пируват-формиат-лиазы и α-ацетолактатсинтазы (рис. 3).

Эти изменения также приводят к образованию пероксида водорода, который вызывает замедление роста культур Lс. lactis и даже их гибель. Концентрация около 0.2 мМ H₂O₂ ингибирует рост этой бактерии на 50%, а концентрации свыше 1.15 мМ могут поставить под угрозу жизнеспособность клеток (Duwat et al., 1999). Хотя НАДН-пероксидаза (табл. 2) способствует уменьшению содержания пероксида водорода в клетках, ее роль в противодействии пероксидным стрессам в целом невелика (в 10‒30 раз ниже, чем у НАДН-оксидазы), поэтому высокие концентрации H₂O₂ часто вызывают гибель клеток МКБ (Condon, 1987; Maresca et al., 2018).

В целом, определение метаболитов и анализ метаболических потоков L. paracasei показал, что в аэробных условиях метаболизм пирувата переключается с образования молочной кислоты на синтез ацетата для обеспечения процесса роста клеток достаточной энергией при высоких скоростях поглощения кислорода. Когда культуры достигают стационарной фазы роста в таких условиях, происходит значительное подавление поглощения и последующего метаболизма глюкозы из-за накопления в клетках АФК, которые ингибируют ключевой фермент гликолиза – глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу; синтез молочной кислоты также продолжает снижаться. Необходимо отметить, что внутриклеточный восстановительный баланс на примере L. paracasei сильно зависит от ацетил-КоА (ацетат/этанол) в экспоненциальной фазе роста и от ацетоина (ацетоин/2,3-бутандиол) в стационарной фазе роста (Tian et al., 2018).

ФЕРМЕНТЫ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ В КЛЕТКАХ МКБ

НАДН-оксидаза/НАДН-пероксидаза. Наиболее распространенным ферментативным механизмом устойчивости к окислительным стрессам, который был обнаружен у многих МКБ, является наличие в клетках НАДН-оксидазной и НАДН-пероксидазной системы (Condon, 1987). Вначале кислород может удаляться из клеток за счет функционирования НАДН-оксидазы, которая использует O₂ для окисления НАДН в НАД⁺, что приводит к увеличению внутриклеточной концентрации H₂O₂. Пероксид водорода, в свою очередь, разлагается НАДН-пероксидазой, и в результате образуется H₂O. Это было показано у аэротолерантных штаммов L. casei, обладающих мощной НАДН-пероксидазой (Npr), которая играет решающую роль в механизмах противодействия пероксидным стрессам (Naraki et al., 2020).

Было показано, что при высокой скорости гликолиза в аэробной культуре Lс. lactis subsp. lactis ATCC 19435 (не имеющей НАДН-пероксидазную активность, но содержащей НАДН-оксидазу) образующийся в качестве конечного продукта гликолиза пируват взаимодействует в ходе неферментативной реакции с пероксидом водорода, образуя ацетат, CO₂ и Н₂О (van Niel et al., 2002). Таким образом, это можно рассматривать в качестве альтернативного способа защиты лактококков от внутриклеточного пероксида водорода, накопление которого в культурах резко снижает их скорость роста (Miyoshi et al., 2003).

НАДН-оксидазы (NOX, кодируемые генами noxE, nox2 и/или nox), как правило, относятся к флавопротеинам и участвуют в обеспечении аэротолерантности микроаэробных МКБ (Tachon et al., 2010, 2011; Jänsch et al., 2011; Derr et al., 2012). NOX, в основном, отвечает за быстрое удаление кислорода и играет важную роль в поддержании внутриклеточного окислительно-восстановительного баланса (Tachon et al., 2010; Naraki et al., 2020).

Было обнаружено, что в делеционных штаммах МКБ по гену nox наблюдалось повышенное содержание СОД и глутатионредуктазы. В связи с этим устойчивость к окислительному и кислотному стрессам у таких мутантных штаммов была лучше (Jänsch et al., 2011). Интересно, что действие НАДН-оксидазы связано с использованием клетками сахаров. Мутанты F. sanfranciscensis с подавленной экспрессией гена nox не росли на питательной среде МRС в аэробных условиях, если в среду дополнительно не добавляли фруктозу (Zhang, Li, 2013).

Супероксиддисмутаза (CОД) является металлоферментом, который катализирует реакцию дисмутации супероксидного анион-радикала в пероксид водорода и молекулярный кислород: ${\text{2O}}_{2}^{{ \bullet - }}$ + 2H⁺ → → H₂O₂ + O₂ (McCord, Fridovich, 1969). Существуют четыре типа фермента, которые отличаются по наличию атомов металла в активном центре: железо-содержащие (Fe-СОД), марганец-содержащие (Mn-СОД), медь/цинк-содержащие (Cu/Zn-СОД) и никель-содержащие (Ni-СОД). СОД присутствует у большинства организмов, некоторые бактерии (например, E. coli) могут обладать одновременно несколькими типами СОД (Bruno-Bárcena et al., 2004). Подавляющее большинство строго анаэробных микроорганизмов содержат в клетках Fe-СОД. У многих представителей родов Streptococcus и Lactococcus удаление супероксидного анион-радикала происходит, в основном, за счет функционирования Mn-СОД, однако большинство лактобацилл лишены супероксиддисмутазной активности (Bruno-Bárcena et al., 2004; Marques Da Silva et al., 2019).

Важная роль СОД в обеспечении выживаемости клеток МКБ в условиях сильных кислородных стрессов была показана, в частности, на L. sake. Штамм NCFB 2813, обладавший в 10‒20 раз (в зависимости от фазы роста культуры) более высокой активностью СОД по сравнению со штаммом DSM 6333, показывал повышенную скорость роста в присутствии 90% О₂, а концентрация ${\text{O}}_{2}^{{ \bullet - }}$ в цитозоле клеток этого аэротолерантного штамма была в 9‒10 раз ниже, чем у кислород-чувствительного (Amanatidou et al., 2001).

Mn-содержащая СОД так же способна обеспечивать дополнительную защиту от пероксидного стресса (Serata et al., 2018). Так, экспрессия гена sodA, кодирующего Mn-СОД S. thermophilus, в клетках L. gasseri и L. acidophilus значительно повышала их устойчивость к H₂O₂ (Bruno-Bárcena et al., 2004). Известно, что негативные эффекты пероксида водорода на рост и выживаемость клеток в значительной степени зависят от наличия “свободного” растворимого железа в виде Fe(II), которое может высвобождаться из лабильных [4Fe-4S]-кластеров белков, окисляемых супероксидными радикалами (Flint et al., 1993; Keyer, Imlay, 1996; Bruno-Bárcena et al., 2004). Ион железа Fe²⁺ реагирует с пероксидом водорода с образованием крайне реакционноспособного гидроксил-радикала (ОН^•) по реакции Фентона. Непрерывное образование ОН^• требует поступления Fe(II), которое может образовываться также через восстановление Fe(III) с помощью ${\text{O}}_{2}^{{ \bullet - }},$ а СОД, удаляя супероксид-радикал, препятствует формированию восстановительного цикла железа (Bruno-Bárcena et al., 2004). Восстановление Fe(III) может также осуществляться за счет различных восстановителей – глутатиона, тиоредоксина, флавоферментов и т.д. (Halliwell, Gutteridge, 1990; Kakhlon, Cabantchik, 2002; Petrat et al., 2003).

Таким образом, защита клеток молочнокислых бактерий от АФК и их аэротолерантность может быть достигнута: дисмутацией ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$ посредством СОД, удалением H₂O₂ благодаря каталазе и/или гидропероксидазе, включением свободного железа в форме Fe(II) в железо-хелатирующий агент или в железо-связывающие белки (например, белок Dpr у грамположительных бактерий), наличием белков-протекторов для [Fe-S]-кластеров и функционированием репарационных механизмов для удаления повреждений макромолекул клетки (Bruno-Bárcena et al., 2004).

Каталаза играет важную роль в снижении негативных эффектов пероксидного стресса на клетку путем разложения пероксида водорода в реакции 2H₂O₂ → 2H₂O + O₂. Известно два типа каталаз: гем-зависимые (истинные каталазы) и марганец-содержащие (псевдокаталазы). Активная гем-зависимая каталаза гомотетрамерной структуры обнаружена у многих видов МКБ, но лишь при условии наличия гема или гематина в питательной среде. Каталазам второго типа для проявления активности не требуется наличие гема или гематина, но такие Mn-содержащие каталазы (MnKat), обладающие гексамерной структурой, у молочнокислых бактерий встречаются достаточно редко (Noonpakdee et al., 2004; Glorieux, Calderon, 2017).

Наличие каталазы у промышленных штаммов МКБ является одним из полезных свойств для получения заквасок, используемых в пищевой промышленности (Zotta et al., 2017), однако такая необходимая при производстве многих ферментированных мясных продуктов стартовая культура, как L. rhamnosus, не обладает каталазной активностью (An et al., 2010). В связи с этим создано большое количество рекомбинантных штаммов стартовых культур МКБ, устойчивых к длительному аэробиозу. В качестве примера можно привести каталазо-отрицательный штамм L. plantarum TISTR850, в котором был клонирован и экспрессирован под сильным промотором ген katA, кодирующий гем-зависимую каталазу из L. sakei SR911. Полученный рекомбинантный штамм L. plantarum с высокой каталазной активностью, сохранявший жизнеспособность в течение 60 ч в условиях аэрации и при дефиците глюкозы, использовали для снижения процесса окисления липидов при хранении ферментированных мясных продуктов (Noonpakdee et al., 2004). Гетерологичная экспрессия гена katA из L. sakei YSI8 в клетках L. rhamnosus приводила к чрезвычайному усилению устойчивости к пероксидному стрессу у рекомбинантного штамма, вплоть до 10⁴ раз по сравнению с исходным штаммом для клеток из стационарной фазы роста (An et al., 2010). Аналогичные эксперименты были проведены также на L. casei MCJΔ1, трансформированной плазмидами с геном katE из L. plantarum или L. brevis, кодирующим гем-зависимую каталазу. Выживаемость рекомбинантных штаммов при 1-часовой инкубации с 2 мМ H₂O₂ оказалась в 270‒300 раз выше, чем у исходного каталазо-отрицательного штамма, а в условиях 96-часовой аэрации культур – в 146‒190 раз выше, что свидетельствует о важной роли каталазы в обеспечении аэротолерантности клеток (Lin et al., 2016).

Создание рекомбинантных штаммов лактобацилл с гетерологичной экспрессией негемовой каталазы дает большое преимущество в том, что в этом случае не требуется добавлять гем в питательную среду для синтеза клетками активного фермента. К настоящему времени удалось показать, как можно защитить один вид МКБ от повреждающего воздействия Н₂О₂ и повысить устойчивость к аэрации с помощью синтеза гетерологичной каталазы другим видом-партнером в смешанной культуре. Эти эксперименты были проделаны на смешанных культурах продуцирующей пероксид водорода, но чувствительной к нему L. bulgaricus, и L. casei, в клетках которой был экспрессирован ген, кодирующий негемовую Mn-содержащую каталазу из L. plantarum ATCC 14431 (Rochat et al., 2006).

Аналогичные подходы применяют и в случае бифидобактерий, которые, как правило, чувствительны к различным окислительным стрессам. Так, гетерологичная экспрессия гена LpKatL, кодирующего гем-зависимую каталазу у L. plantarum, в клетках Bifidobacterium longum NCC2705 приводила к быстрому разложению экзогенного H₂O₂ и иных пероксидов, которые образовывались в качестве побочных продуктов при аэробном культивировании (Zuo et al., 2014).

Синтез активной истинной каталазы у некоторых МКБ, как уже указывалось выше, возможен в присутствии экзогенного гема, так как сами МКБ не способны к его синтезу (Noonpakdee et al., 2004; Ricciardi et al., 2018). Но дело в том, что добавление гема в сырье для ферментативных процессов в молочной или мясной промышленности не всегда представляется возможным. Поэтому сегодня все большее применение находят штаммы МКБ, обладающие Mn-содержащей каталазой (Mn-Kat). Этот фермент разлагает Н₂О₂, используя марганец как каталитический редокс-кофактор, таким образом, не испытывая потребности в геме. Субъединицы Mn-содержащих каталаз меньше по размеру, чем таковые у обычных гемовых каталаз (примерно 27 и 60 кДа соответственно), и Mn-Kat более устойчивы к повышенным температурам (Kono, Fridovich, 1983). Важно отметить, что Mn-содержащая каталаза – это цитоплазматический фермент, который не выделяется клетками в культуральную жидкость, и его активность проявляется лишь у штаммов, обладающих высоким внутриклеточным содержанием Mn (Rochat et al., 2006).

Тиоредоксинредуктаза. С помощью фермента тиоредоксинредуктазы (TR) происходит окисление тиоредоксина (TRX) с использованием НАДФН в качестве кофактора. На протяжении многих лет исследований роли тиоредоксина в клеточном метаболизме было выяснено, что он в качестве дисульфидной оксидоредуктазы играет важную роль в различных восстановительных процессах, таких, как антиоксидантная защита клетки, восстановление белков и биосинтез нуклеиновых кислот (Serrano et al., 2007; Lu, Holmgren, 2014; Jastrząb et al., 2021).

Снижение активности тиоредоксинредуктазной и глутатион-редоксиновой систем имеет большое значение для всех живых организмов. Эти две системы обеспечивают поддержание цитоплазмы в восстановленном состоянии (Scharf et al., 1998). Избыток тиоредоксина у L. plantarum WCFSI увеличивал устойчивость клеток к окислительным стрессам, создаваемым пероксидом водорода или диамидом (Serrano et al., 2007).

Анализ полного генома L. plantarum WCFSI показал, что тиоредоксинредуктазная система у этого микроорганизма состоит из шести открытых рамок считывания. Непосредственно тиоредоксинредуктазу кодируют четыре гена из шести: trxA1 (lp_0236), trxA2 (lp_2270), trxA3 (lp_3437) и trxH (lp_2633). Два других гена, trxB1 (lp_0761) и trxB2 (lp_2585), определены, соответственно, как кодирующие тиоредоксин и нуклеотид-дисульфид-оксидоредуктазу. Эти шесть генов распределены по геному и высоко консервативны у всех исследуемых штаммов L. plantarum, независимо от их местообитаний (Molenaar et al., 2005).

Было показано, что уровни транскрипции гена gapB (гликолитический ген, участвующий в энергетическом метаболизме) и активность глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (ГАФДГ – ключевого фермента гликолиза по своему месторасположению в пути и по количеству связанных с ним регуляторных взаимодействий) у L. plantarum возрастали в несколько раз при сверхэкспрессии гена trxB1 в условиях пероксидного стресса (Serrano et al., 2007). Эта способность предотвращает окисление белка GapB и поддерживает синтез активной формы ГАФДГ. Вероятно, усиленный синтез тиоредоксина у L. plantarum WCFSI защищает ГАФДГ в условиях окислительных стрессов, вызываемых пероксидами. Тиоредоксинредуктазная система (гены trxA2 и trxB1) у L. plantarum WCFSI индуцируется именно пероксидными стрессами и является ключевой в антиоксидантной защите у этого штамма (Serrano et al., 2007).

Исследования, проведенные ван Нилем и соавт. (van Niel et al., 2002), показали, что ГАФДГ у Lc. lactis действительно является наиболее чувствительным для окислительных стрессов (в частности, при обработке клеток 2.2 мМ H₂O₂) белком из всех ферментов гликолиза.

Также тиоредоксинредуктаза была обнаружена в клетках типового вида рода Bifidobacterium – B. bifidum, способной к микроаэробному росту (при 5% O₂), но из-за накопления Н₂О₂ прекращающей рост при концентрациях кислорода свыше 10%. Экспрессия гена, кодирующего эту тиоредоксинредуктазу, индуцировалась кислородом. Интересно, что разложение Н₂О₂ у данной бифидобактерии происходило с участием системы тиоредоксинредуктаза‒алкилгидропероксидредуктаза (Satoh et al., 2019).

Другие белки МКБ, вовлеченные в окислительные стрессы. Еще одним механизмом обеспечения стрессоустойчивости клеток МКБ является поддержание активности белка RecA. Этот белок широко распространен у бактерий, например, в клетках E. coli, где он играет ключевую роль в SOS-ответах и гомологичной рекомбинации (Miller, Kokjohn, 1990; Walker, 1996). На мутантном штамме Lc. lactis с введенным геном recA было показано, что Re-cA обеспечивает устойчивость к окислительному и термическому воздействиям (Duwat et al., 1995). В отсутствиe активности RecA гидроксил-радикалы, образующиеся в реакции Фентона, вызывали в ДНК необратимые повреждения (Miyoshi et al., 2003).

Lactobacillus helveticus, часто применяемая в качестве закваски в молочной промышленности, относится к термотолерантным молочнокислым бактериям, которые не требуют строго анаэробных условий для роста и получают большую часть энергии, осуществляя молочнокислое брожение (Guerzoni et al., 2001). Хотя в присутствии кислорода эти бактерии и образуют пероксид водорода в реакции с НАДH, тем самым уменьшая внутриклеточную концентрацию молекулярного О₂, в их клетках не было обнаружено активностей ключевых ферментов антиоксидантной защиты, таких, как СОД или каталаза (Cappa et al., 2005). Однако клетками Lactobacillus helveticus были выработаны различные способы защиты генома, и одним из наиболее важных является нуклеотид-эксцизионная репарация ДНК при различных стрессовых воздействиях (Goosen, Moolenar, 2001; Cappa et al., 2005).

Белки эндонуклеазного эксцизионного комплекса UvrABC определяют и разрезают поврежденную ДНК в многоступенчатой реакции, обладая способностью восстанавливать единичные одноосновные модификации, массивные нуклеотидные аддукты, нековалентные модификации, а также внутри- и межнитевые кросс-связи (Cappa et al., 2005). Анализ транскрипции гена uvrA, кодирующего субъединицу А эндонуклеазы эксцизии, показал, что воздействие на клетки низкого pH 5.0 или 2.6 мМ H₂O₂ индуцирует резкое увеличение экспрессии гена uvrA через 15 мин после начала стресса, и этот высокий уровень экспрессии поддерживается, по крайней мере, в течение 80 мин, обеспечивая устойчивость L. helveticus к кислотным и окислительным стрессам (Cappa et al., 2005).

Кроме того, у L. helveticus в ответ на пероксидный и температурный стрессы активируется десатуразная система, поглощающая кислород и повышающая содержание ненасыщенных жирных кислот в клеточной мембране, что защищает клетки от токсичных активных форм кислорода и высоких температур (Guerzoni et al., 2001).

В опытах с делеционным по гену rpoN (кодирует альтернативный σ-фактор 54) штаммом L. plantarum было показано, что его чувствительность к пероксиду водорода возросла в 100 раз по сравнению с исходным штаммом. Это связано со снижением экспрессии маннозного оперона фосфотрансферазной системы (ФТС), регулируемой, в частности, σ⁵⁴ и необходимой, в том числе, для получения клеткой энергии при формировании адаптивного ответа на воздействие пероксидов (Stevens et al., 2010).

Интересный механизм антиоксидантной защиты, включающий транспортные белки цистина ABC (кодируются генным кластером cyuABC) и цистатионин γ-лиазу (кодируется геном cgl), был показан для нескольких штаммов L. reuteri: при поглощении экзогенного цистина с помощью белка-транспортера CyuC клетки в аэробных условиях секретировали большое количество восстановительных эквивалентов, представлявших собой тиолы, включая H₂S как продукт разложения цистина и мощный антиоксидант цистеин (Lo et al., 2009). Протеомный анализ L. acidophilus выявил, что в условиях пероксидного стресса в клетках резко возрастает содержание цистеинсинтазы, необходимой для формирования пула цистеина, обеспечивающего стабильность белков, протекание метаболических реакций и функционирование пути восстановления дисульфидов; также в клетках возрастало содержание ферментов репарации ДНК и белков с цистеиновыми остатками в активном центре (Calderini et al., 2017).

ХИМИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ И ВЕЩЕСТВА, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЕ АНТИОКСИДАНТНУЮ ЗАЩИТУ В КЛЕТКАХ МКБ

Глутатион (GSH) – наиболее распространенный и обнаруженный почти у всех живых организмов (Allocati et al., 2012), в том числе и у МКБ (например, у Lc. lactis, L. fermentum ME-3; Kullisaar et al., 2010), небелковый тиол. Он играет важную роль в ответах на многие стрессы (окислительные, кислотные, осмотические), защищая клетку от свободных радикалов и определяя редокс-статус внутриклеточной среды (Kim et al., 2012).

Сравнительный протеомный анализ с использованием клеток Lc. lactis SK11, выращенных с добавлением и без добавления глутатиона, показал, что он стабилизировал ферменты гликолиза, что и объясняло устойчивость клеток Lc. lactis SK11 с высоким содержанием глутатиона к различным стрессам. Это свидетельствует о том, что глутатион может эффективно использоваться в качестве универсального защитного химического вещества для улучшения выживаемости и сохранности молочных заквасочных культур (Zhang, Li, 2013; Al-Madboly et al., 2020).

Помимо защиты клеток МКБ от неблагоприятных воздействий глутатион способствует усилению роста культур Ligilactobacillus salivarius (Lee et al., 2010) или может быть использован в качестве источника серы, как в случае L. reuteri (Lee et al., 2011; Zhang, Li, 2013).

Глутатион синтезируется в клетке либо с помощью двух ферментов, осуществляющих последовательные реакции (глутамин-цистеин-синтетазы и глутатионсинтетазы), либо путем использования бифункционального фермента глутамат-цистеин-лигазы/глутатионсинтетазы (Allocati et al., 2012; Pophaly et al., 2017; Xiong et al., 2018).

Гомологи глутатионредуктазы (GshR) широко представлены в клетках МКБ и являются важными компонентами GSH-зависимых окислительно-восстановительных систем. У L. plantarum было найдено две глутатионредуктазы, которые защищали клетки от воздействия солей желчных кислот (Hamon et al., 2011). Инактивация гена gshR увеличивала накопление дисульфида глутатиона (GSSG) и приводила к снижению устойчивости клеток F. sanfranciscensis к окислительным стрессам (Jänsch et al., 2007).

Предшественники глутатиона (цистеин и γ‑глутамилцистеин) также участвуют в антиоксидантной защите. При использовании экзогенного цистеина возможен аэробный рост F. sanfranciscensis с инактивированной глутатионредуктазой (Jänsch et al., 2007; Zhang, Li, 2013).

Марганец как антиоксидантный агент в клетках МКБ. Как было сказано выше, у некоторых представителей лактобацилл, в частности, у L. plantarum, отсутствует истинная СОД. Но, несмотря на это, данный микроорганизм обладает аэротолерантностью при росте на глюкозе, а при росте на многоатомных спиртах вообще является облигатным аэробом. Защита от токсического эффекта О₂ связана, вероятно, с активным процессом аккумулирования Mn(II) в клетках. Многие представители МКБ проявляют достаточно высокие ростовые потребности к марганцу, который не является необходимым элементом для других гетеротрофных бактерий (Serata et al., 2018). Рост L. plantarum в Mn-дефицитной питательной среде приводил к формированию клеток, которые обладали повышенной чувствительностью к О₂ (Archibald, Fridovich, 1981a).

Необычно высокая внутриклеточная концентрация Mn(II) не является единственной интересной особенностью L. plantarum и, возможно, родственных ей лактобактерий. В частности, у L. plantarum отсутствует потребность в железе. Таким образом, у данной МКБ не происходит образование пероксида водорода в рекциях типа Фентона и Габера‒Вейса. Этот факт, в дополнение к значительному содержанию Mn (~9 мкг/мг белка в экстрактах клеток), может объяснять высокую устойчивость к кислороду L. plantarum, не обладающей активностью СОД (Archibald, Fridovich, 1981a). В ходе так называемого дыхательного роста (аэробиоз в присутствии гема и витамина К₂ в качестве источника менахинона) с внесением марганца в питательную среду культуры L. plantarum достигали наибольшего выхода биомассы (Watanabe et al., 2012).

К внутриклеточному аккумулированию марганца, эффективно удаляющего супероксид-анионы при аэробном росте, способны и представители группы L. casei – L. paracasei. За поглощение марганца у них отвечает система многочисленных Mn-транспортных белков NRAMP-типа (кодируемых генами mntH1 и mntH2) и ABC-типа (кодируемых кластером mtsCBA), подверженных общей регуляции (Serata et al., 2018).

Необходимо отметить, что большинство штаммов молочнокислых бактерий, которые аккумулировали высокие внутриклеточные уровни Mn(II), были лишены активности истинной СОД, хотя и были способны к росту при аэробиозе. Напротив, те лактобациллы, которые обладали СОД-активностью и лучше росли в аэробных условиях, чем в анаэробных, не содержали в клетках Mn(II) в высоких концентрациях (Kono et al., 1976; Archibald, Fridovich, 1981b; Serata et al., 2018). Это говорит о том, что марганец в миллимолярных концентрациях в клетках МКБ может заменять собой СОД и служит для эффективного удаления эндогенного супероксид-аниона, обеспечивая определенный уровень аэротолерантности клеток. Это происходит благодаря взаимодействию супероксид-аниона с марганцем и окислению последнего. В присутствии пирофосфатов (нуклеозидтрифосфаты, динуклеотидные коферменты) трехвалентный марганец стабилизируется и может накапливаться в клетке. В отсутствие таких стабилизирующих хелатирующих агентов образуется MnO²⁺, который тут же распадается на MnO₂, Mn(II) и О₂ (Kono et al., 1976).

По всей видимости, замена функции СОД высокими, вплоть до 25 мМ, концентрациями Mn(II) у ряда штаммов аэротолерантной L. plantarum является адаптацией к существованию в растительном материале, т.к. у штаммов L. plantarum, обитающих в молочных продуктах, не было выявлено высокой внутриклеточной концентрации данного металла (Archibald, Fridovich, 1981b).

ПРИМЕНЕНИЕ АНТИОКСИДАНТНЫХ СВОЙСТВ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ В ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ И МЕДИЦИНЕ

Активные формы кислорода могут вызывать окислительные повреждения макромолекул клетки, а иногда непосредственно приводят к гибели клеток (Kehrer, 1993). Такие болезни, как атеросклероз, различные онкологические заболевания, ожирение, эмфизема, цирроз печени, артрит, болезнь Крона, воспалительные заболевания ЖКТ и др. напрямую соотносятся с окислительными повреждениями клеток соответствующих тканей (Kehrer, 1993; Grajek et al., 2005; LeBlanc et al., 2011; Basu Thakur et al., 2019; Vasquez et al., 2019; Kim et al., 2021). Таким образом, токсическое воздействие АФК играет значимую патологическую роль. Надо также принимать во внимание, что такие окислители, как пероксид водорода и хлорноватистая кислота, вырабатываются врожденной иммунной системой в качестве антимикробных агентов в процессе воспаления (Basu Thakur et al., 2019).

Прием пищи, в состав которой входят антиоксидантные добавки, может уменьшить уровень АФК в тканях и значительно снизить риск окислительных повреждений организма человека и животных. Наиболее известными антиоксидантами являются аскорбиновая кислота (витамин С), токоферол (витамин Е), β-каротин (провитамин А), холекальциферол (витамин D₃), кофермент Q₁₀, каротиноидный пигмент ликопин. К природным антиоксидантам также относят полифенолы – флавин и флавоноиды (часто встречаются в овощах), танины (присутствуют в какао, кофе, чае), антоцианы (присутствуют в красных ягодах), линолевую кислоту (входит в состав многих растительных масел и животных жиров), белковые фракции (в особенности, содержащие казеин, лактоферрин).

Молочнокислые бактерии являются идеальными объектами для доставки ферментов антиоксидантной защиты (в частности, СОД и каталазы) в желудочно-кишечный тракт для предотвращения или лечения различных воспалительных патологических процессов в нем (LeBlanc et al., 2011). Показано, что пробиотическая МКБ L. reuteri, колонизирующая кишечник, обладает сложными регуляторными системами ответа на различные окислительные стрессы, которых нет у E. coli и других энтеробактерий и которые включают, в частности, белок теплового шока Lo18, полифосфаткиназу 2 и уникальный регуляторный белок RsiR (Basu Thakur et al., 2019).

К настоящему времени доказано, что антиканцерогенными, антимикробными, гиполипидемическими, иммуномодуляторными и антиоксидантными свойствами обладают живые клетки и экстракты клеток многих штаммов МКБ, а также, в некоторых случаях, их фракции растворимых экзополисахаридов (Choi et al., 2006; Gao et al., 2013; Guo et al., 2013; Li et al., 2014; Yamamoto et al., 2019; Даниленко и соавт., 2020; Marsova et al., 2020).

L. plantarum C88, выделенная из тофу (традиционного китайского ферментированного пищевого продукта из соевых бобов) и обладающая повышенной ингибиторной активностью в отношении гидроксил-радикала и высокой устойчивостью к пероксиду водорода, предложена как эффективный пробиотик-антиоксидант, в частности, ингибирующий перекисное окисление липидов (Li et al., 2012). Введение клеток штаммов L. plantarum С88 и MA2 (Li et al., 2012; Tang et al., 2016) или L. brevis MG000874 (Noureen et al., 2019) старым мышам, подвергнутым индуцированному D-галактозой окислительному стрессу, приводило к значительному усилению активностей каталазы, СОД и глутатионпероксидазы в сыворотке крови и клетках печени мышей, восстанавливая антиоксидантный статус организма. Пробиотические йогурты и ферментированное молоко, в особенности, содержащие клетки L. casei и L. acidophilus, обладают высоким антиоксидантным потенциалом за счет высвобождения антиоксидантных пептидов в процессе протеолиза (Fardet, Rock, 2018).

Недавними исследованиями было показано, что Limosilactobacillus frumenti увеличивает активности ряда антиоксидантных ферментов и снижает общий уровень активных форм кислорода за счет активации NO-синтазы 1 в эпителиальных клетках тонкого кишечника млекопитающих (Nie et al., 2019). Пробиотические препараты на основе Lactobacillus gasseri усиливают защиту от окислительных стрессов, активируя в клетках млекопитающих редокс-чувствительную сигнальную систему Nrf2/ARE (Kobatake et al., 2017).

МКБ являются неотъемлемой частью микробиоты ЖКТ человека и играют значимую роль для здоровья хозяина. Пробиотические штаммы, ограничивающие накопление чрезмерного количества активных радикалов в тканях хозяина, могут способствовать предотвращению либо контролированию заболеваний, связанных с различными окислительными стрессами. Таким образом, с помощью пробиотических бактериальных штаммов появляется возможность повысить уровень клеточной антиоксидантной защиты хозяина (Guo et al., 2013; Tang et al., 2016). Стоит напомнить, что антиоксидантные активности (ферментативное удаление АФК, ингибирование перекисного окисления липидов и т.д.) являются, как правило, штаммоспецифичными, поэтому для использования МКБ в качестве максимально эффективных медицинских или ветеринарных пробиотических добавок нужно предварительно проводить комплексные исследования большой коллекции штаммов по выявлению необходимых свойств in vitro и оценке их потенциала в профилактике и лечении заболеваний in vivo (Noureen et al., 2019; Poluektova et al., 2021).

Результаты последних исследований свидетельствуют о новых перспективах в использовании пробиотических штаммов МКБ в качестве защитных компонентов в желудочно-кишечной микробной экосистеме для снижения негативных эффектов и последствий окислительных стрессов, а также для оздоровления не только ЖКТ, но и печени, почек, плазмы крови и повышения общего уровня антиоксидантного статуса организма хозяина (Li et al., 2014; Yamamoto et al., 2019; Даниленко и соавт., 2020; Marsova et al., 2020). Кроме того, аэротолерантные МКБ в качестве стартовых культур улучшают органолептические свойства ферментированных продуктов (в частности, за счет образования летучих соединений в процессе аэробного роста) и значительно повышают их рекомендуемые сроки хранения. В целом, антиоксидантные эффекты пробиотиков чрезвычайно широки – от быстрого биохимического удаления высокореакционноспособных активных форм кислорода до индуцирования через различные регуляторные и сигнальные молекулы цитопротекторной и иммунной системы организма хозяина (Guo et al., 2013; Feng, Wang, 2020; Averina et al., 2021).