1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Микробиология
  4. T. 92, № 1, 2023

Микробиология, 2023, T. 92, № 1, стр. 98-102

Гены, кодирующие НАД+-зависимые формиатдегидрогеназы, в таксономии аэробных метилотрофных бактерий рода Ancylobacter

А. А. Чемодурова a, А. С. Решетников a, Н. В. Агафонова a, Н. В. Доронина a, *

a ФИЦ “Пущинский научный центр биологических исследований РАН” Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН
142290 Пущино, Московская обл., Россия

* E-mail: doronina@ibpm.pushchino.ru

Поступила в редакцию 29.04.2022
После доработки 29.05.2022
Принята к публикации 30.05.2022

Полный текст (PDF)

Аннотация

Проведен сравнительный филогенетический анализ генов НАД+-зависимых формиатдегидрогеназ (НАД+–ФДГ), которые обнаружены во всех доступных геномах метилотрофов родов Ancylobacter, Starkeya и Angulomicrobium, а также у других бактерий семейства Xanthobacteraceae (Xanthobacter, Aquabacter, Azorhizobium). Отмечено, что расположение представителей Xanthobacteraceae на дереве, построенном на основании сравнения аминокислотных последовательностей НАД+–ФДГ, коррелирует с филогенией по гену 16S рРНК. Выявлено, что последовательности белка НАД+–ФДГ родов Ancylobacter, Starkeya и Angulomicrobium имеют уровень идентичности 87.8–98.3%, что свидетельствует о высокой консервативности этого белка в пределах данной группы метилотрофов. Впервые анализ функциональных генов НАД+–ФДГ рекомендован в качестве дополнительного критерия для межвидовой дифференциации метилотрофных бактерий рода Ancylobacter.

Ключевые слова: метилотрофы, Ancylobacter, семейство Xanthobacteraceae, НАД+-зависимые формиатдегидрогеназы

НАД+-зависимые формиатдегидрогеназы (НАД+–ФДГ) обнаружены у бактерий, дрожжей, грибов, растений и позвоночных (Alekseeva et al., 2011). У растений, патогенных бактерий и грибов этот фермент является стрессовым белком, у аэробных метилотрофных бактерий (метилотрофов) и дрожжей играет ключевую роль в снабжении клеток энергией (Hatrongjit, Packdibamrung, 2010; Alekseeva et al., 2011). Окисление формиата до CO2, сопряженное восстановлением НАД+ до НАДН, катализируется НАД+–ФДГ и является завершающей стадией цепи реакций прямого С1-окисления у метилотрофов. НАД+–ФДГ относится к надсемейству D-специфических дегидрогеназ 2-оксикислот, имеет гомодимерную структуру, не содержит в активном центре простетических групп и ионов металлов (Shabalin et al., 2010). Данный фермент распространен у метилотрофов с рибулозобисфосфатным путем С1-ассимиляции (Троценко с соавт., 2010). Типичным примером являются представители рода Ancylobacter (семейство Xanthobacteraceae, порядок Hyphomicrobiales), выделяемые из водной среды, донных осадков, активных илов, почвы и растений. В настоящее время род включает 11 валидно описанных видов (https://lpsn.dsmz.de/genus/ancylobacter), очень близких по физиолого-биохимическим, хемотаксономическим свойствам и последовательностям генов 16S рРНК, поэтому актуален поиск новых генетических маркеров, позволяющих осуществить быструю дифференциацию представителей данного рода без привлечения геномного анализа. Известно, что аминокислотные последовательности НАД+–ФДГ довольно консервативны и уровень их сходства у разных организмов составляет ~50%, а у растений эти ферменты имеют до 80% идентичности (Hatrongjit, Packdibamrung, 2010; Alekseeva et al., 2011). Ранее фермент НАД+–ФДГ исследовали только у одного представителя рода Ancylobacter – A. aqua-ticus KNK607M (Nanba et al., 2010), но значение соответствующего функционального гена в таксономии бактерий не рассматривалось.

Цель данной работы – оценка эффективности использования сравнительного анализа последовательностей генов НАД+–ФДГ в таксономии метилотрофных бактерий рода Ancylobacter.

В работе использовали новые метилотрофные изоляты штаммы Ancylobacter sp. VT, Starkeya sp. 3С и 1А, выделенные ранее авторами данной работы, а также ближайший родственник штаммов 3С и 1А – штамм Starkeya sp. HF14-78462, геном которого найден в базе данных NCBI GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) (CACSAS000000000). Поиск последовательностей генов 16S рРНК, белков НАД+–ФДГ и геномов проводили в базах данных NCBI GenBank и JGI (https://img.jgi.doe.gov/), филогенетический анализ осуществляли с помощью пакетов программ BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov), ClustalW (Thompson et al., 1997) и MEGA5 (метод neighbor-joining) (Tamura et al., 2011), надежность построенных деревьев проверена значением “bootstrap” для 1000 деревьев. Средние значения идентичности нуклеотидов (ANI) и ДНК-ДНК гибридизации in silico (dDDH) рассчитывали с использованием программ Species 1.2.1 (Richter, Rosselló-Móra, 2009) и GGDC 2.1 (https://ggdc.dsmz.de/ggdc.php) (Meier-Kolthoff et al., 2013) соответственно. Амплификацию и секвенирование гена НАД+–ФДГ для штамма 1А проводили с использованием “вырожденных” праймеров, разработанных на консервативные аминокислотные участки НАД+–ФДГ. Анализ доступных аминокислотных последовательностей фермента НАД+–ФДГ из A. aquaticus, Starkeya sp. 3C и ряда других гомологичных ФДГ ферментов из NCBI GenBank позволил выделить две консервативные аминокислотные области, на основе которых составлена пара “вырожденных” праймеров fmd (F2-vir); TGCGTTCTYTACGAYGAYСС и fmd (R-vir); TCTTCCGARCCGCCAGTSGCRTT. Амплифицирован участок гена 1170 п.н., кодирующий фермент НАД+–ФДГ из метилотрофного изолята штамма 1А. Секвенирование и анализ полученного фрагмента выявил 99.9% идентичности аминокислотной последовательности с ферментом НАД+–ФДГ из Starkeya sp. 3C.

Гены НАД+–ФДГ выявлены нами у некоторых представителей семейства Xanthobacteraceae – родов Xanthobacter, Aquabacter, Azorhizobium, а также во всех доступных геномах метилотрофных бактерий родов Ancylobacter, Starkeya и Angulomicrobium. Установлено, что распределение представителей Xanthobacteraceae на дереве, построенном на основании сравнения аминокислотных последовательностей НАД+–ФДГ, коррелирует с филогенией по гену 16S рРНК (рис. 1). При этом выявлено несколько кластеров на дереве, построенном по результатам сравнительного анализа последовательностей белков НАД+–ФДГ, объединяющих представителей семейства Xanthobacteraceae: (1) группа Ancylobacter, Starkeya и Angulomicrobium; (2) группа Xanthobacter; (3) группа Aquabacter и Azorhizobium.

В группе (1) сходство между видами на основании сравнения нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК составляет 96.2–98.5%, а аминокислотные последовательности белка НАД+–ФДГ проявляют уровень межвидовой идентичности 87.8–98.3% (табл. 1), что свидетельствует о высокой консервативности белка НАД+–ФДГ у представителей родов Ancylobacter, Starkeya и Angulomicrobium. Поиск ближайших родственников Ancylobacter по сходству НАД+–ФДГ выявил также метилотрофа Pseudomonas sp. 101 (91.3–92.8%) (Filippova et al., 2006), НАД+–ФДГ которого является одной из самых изученных ФДГ среди бактерий (Alekseeva et al., 2011). По всей видимости, данный штамм также является представитем Starkeya или Ancylobacter, однако идентификация, проведенная в 1970-х гг. (коллекция кафедры микробиологии Московского государственного университета) (Egorov et al., 1979), устарела и требует пересмотра.

Интересно, что претенденты на новые виды новые изоляты штаммы 3С, 1А, HF14-78462 (~99.9–100% сходства по гену 16S рРНК) и штамм VT также хорошо дифференцируются на видовом уровне по генам НАД+–ФДГ, что коррелирует с их филогенетическим положением по гену 16S рРНК (рис. 1). Анализ геномов штаммов 3С (VMBP00000000) и VT (JAHCQH000000000) подтверждает принадлежность этих микроорганизмов к новым видам, поскольку значение сходства по генам 16S рРНК, уровень ANI и dDDH составило, соответственно: 99.3–99.4, 86.4 и 28.3% между штаммом 3С и S. novella DSM 506T, и 98.3–98.5, 78.0–80.6 и 22.1–24.0% между штаммом VT и ближайшими представителями рода Ancylobacter, что ниже пороговых значений, принятых для разделения видов (ANI = 95%, dDDH = 70%) (Richter et al., 2009; Chun et al., 2018).

Таким образом, показано, что топология филогенетического дерева по белку НАД+–ФДГ коррелирует с таксономическим положением представителей рода Ancylobacter и семейства Xanthobacteraceae, проведенным на основании сравнения последовательностей генов 16S рРНК. Анализ этих достаточно консервативных функциональных генов может быть рекомендован в качестве дополнительного критерия для межвидовой дифференциации прежде всего бактерий рода Ancylobacter.

Предложение использовать функциональные гены ферментов, вовлеченных в метаболизм метилотрофов, не является уникальным. Известно, что у метилотрофов ген mxaF (кодирует большую субъединицу метанолдегидрогеназы) высоко консервативен и используется в качестве функционального гена для их идентификации в различных средах обитания (McDonald, Murrell, 1997). Также в качестве молекулярных проб применяют гены xoxF (Ramachandran, Walsh, 2015; Taubert et al., 2015), но известные последовательности филогенетически разнообразны, делятся на пять групп (XoxF1−5) (Chistoserdova, 2011), а их идентичность в пределах одной группы ~65–70% (Keltjens et al., 2014). Анализ аминокислотных последовательностей белка НАД+–ФДГ представителей Xanthobacteraceae выявил уровень идентичности в пределах семейства 84.0–98.3%, а среди ближайших родственников обнаружены только Methylocella silvestris BL2T (89–90%) и Rhizobium leguminosarum Vaf10 (84.7–86.7%), однако на дереве они держатся обособленно (табл. 1, рис. 1). Кроме того, представители родов Angulomicrobium и Starkeya по исследуемым генам НАД+–ФДГ образуют единый кластер с представителями Ancylobacter, что согласуется с результатами секвенирования генов 16S рРНК и демонстрирует высокое родство представителей этих трех родов. Таким образом, впервые предложено использовать НАД+–ФДГ в качестве функционального маркерного гена для дальнейшего поиска и идентификации метилотрофов рода Ancylobacter, обнаруживаемых в различных местах обитания.

Таблица 1.

Уровни сходства представителей рода Ancylobacter с ближайшими родственниками на основании сравнения нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и аминокислотных последовательностей белка НАД+–ФДГ, н.д. – нет данных

  Ancylobacter
16S рРНК, % НАД+–ФДГ, %
Xanthobacteraceae Ancylobacter 96.8–98.5 89.0–98.3
Starkeya 97.0–98.0 90.3–96.8
Angulomicrobium 96.2–97.7 87.8–96.0
Xanthobacter 92.1–94.7 87.3–94.8
Azorhizobium 92.9–94.5 84.3–87.5
Aquabacter 92.9–94.6 84.0–85.8
  Pseudomonas sp. 101 н.д. 91.3–92.8
Methylocella silvestris BL2T 90.2–91.3 89.0–90.0
Rhizobium leguminosarum Vaf10 90.6–91.6 84.7–86.7
Рис. 1.

а – филогенетическое положение представителей семейства Xanthobacteraceae на основании сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК; б – филогенетическое положение представителей рода Ancylobacter среди ближайших родственников, основанное на сравнении аминокислотных последовательностей белка НАД+–ФДГ.

Список литературы

  1. Троценко Ю.А., Доронина Н.В., Торгонская М.Л. Аэробные метилобактерии. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 2010. 325 с.

  2. Trotsenko Y.A., Doronina N.V., Torgonskaya M.L. Aerobic Methylobacteria. Pushchino: ONTI PSC RAS, 2010. 325 р.

  3. Alekseeva A.A., Savin S.S., Tishkov V.I. NAD+-dependent formate dehydrogenase from plants // Acta Naturae. 2011. V. 3. № 4(11). P. 38–54.

  4. Chistoserdova L. Modularity of methylotrophy, revisited // Environ. Microbiol. 2011. V. 13. P. 2603–2622.

  5. Chun J., Oren A., Ventosa A., Christensen H., Arahal D.R., da Costa M.S., Rooney A.P., Yi H., Xu X.-W., De Meyer S., Trujillo M.E. Proposed minimal standards for the use of genome data for the taxonomy of prokaryotes // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2018. V. 68. P. 461–466.

  6. Egorov A.M., Avilova T.V., Dikov M.M., Popov V.O., Rodionov Y.V., Berezin I.V. NAD-dependent formate dehydrogenase from methylotrophic bacterium, strain 1: purification and characterization // Eur. J. Biochem. 1979. V. 99. P. 569–576.

  7. Filippova E.V., Filippova E.V., Polyakov K.M., Tikhonova T.V., Boiko K.M., Tishkov V.I., Popov V.O. Crystal structures of complexes of NAD+-dependent formate dehydrogenase from methylotrophic bacterium Pseudomonas sp. 101 with formate // Crystallography Reports. 2006. V. 51. № 4. P. 627–631.

  8. Hatrongjit R., Packdibamrung K. A novel NADP+-dependent formate dehydrogenase from Burkholderia stabilis 15516: screening, purification and characterization // Enzyme and Microbial Technology. 2010. V. 46. №. 7. P. 557–561.

  9. Keltjens J.T., Pol A., Reimann J., Op den Camp H.J. PQQ-dependent methanol dehydrogenases: rareearth elements make a difference // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2014. V. 98. P. 6163–6183.

  10. McDonald I.R., Murrell J.C. The methanol dehydrogenase structural gene mxaF and its use as a functional gene probe for methanotrophs and methylotrophs // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P. 3218–3224.

  11. Meier-Kolthoff J.P., Auch A.F., Klenk H.-P., Göker M. Genome sequence-based species delimitation with confidence intervals and improved distance functions // BMC Bioinformatics. 2013. V. 14. P. 1–14.

  12. Nanba H., Takaoka Y., Hasegawa J. Purification and characterization of formate dehydrogenase from Ancylobacter aquaticus strain KNK607M, and cloning of the gene // Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 2003. V. 67. № 4. P. 720–728.

  13. Ramachandran A., Walsch D.A. Investigation of XoxF methanol dehydrogenases reveals new methylotrophic bacteria in pelagic marine and freshwater ecosystems // FEMS Microbiol. Ecol. 2015. V. 91. P. fiv105.

  14. Richter M., Rosselló-Móra R. Shifting the genomic gold standard for the prokaryotic species definition // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106. P. 19126–19131.

  15. Shabalin I.G., Serov A.E., Skirgello O.E., Timofeev V.I., Samygina V.R., Popov V.O., Tishkov V.I., Kuranova I.P. Recombinant formate dehydrogenase from Arabidopsis thaliana: preparation, crystal growth in microgravity, and preliminary X-ray diffraction study // Crystallography Reports. 2010. V. 55. № 5. P. 806–810.

  16. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods // Mol. Biol. Evol. 2011. V. 28. P. 2731–2739.

  17. Taubert M., Grob C., Howat A.M., Burns O.J., Dixon J.L., Chen Y., Murrell J.C. XoxF encoding an alternative methanol dehydrogenase is widespread in coastal marine environments // Environ. Microbiol. 2015. V. 17. P. 3937–3948.

  18. Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D.G. The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 4876–4882.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Микробиология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал