Микология и фитопатология, 2021, T. 55, № 5, стр. 353-370

ВВЕДЕНИЕ

Черника (Vaccinium myrtillus L.) – ягодный кустарничек, широко распространенный в хвойных и хвойно-широколиственных лесах. Это многолетнее растение произрастает на территории Северной Европы, Азии, Северной Америки, Канады. Среди микроорганизмов, вызывающих заболевания черники, фитопатогенные грибы и грибоподобные организмы составляют значительную часть и играют важную роль. Наиболее широко распространенными считаются микромицеты, развивающиеся на стеблях, среди них такие виды как Diaporthe vaccinii Shear, Topospora myrtilli (Feltg.) Boerema, Monilinia vaccinii-corymbosi (Reade.) Honey, Phytophthora cinnamomi Rands. и др. (Szmagara, 2009; Lombard et al., 2014; Hilário et al., 2020).

Самым вредоносным для черники является гриб Diaporthe vaccinii. Известно, что этот микромицет способен вызывать такие заболевания, как гнили, пятнистости листьев, рак стеблей и приводить к существенным потерям урожая (до 65%) ягод черники (Lombard et al., 2014). Вид D. vaccinii включен в единый перечень карантинных объектов Евразийского экономического союза в первую часть (отсутствующие на территории ЕЭС) (Eurasian economic commission, 2016).

Другой опасный и вредоносный для растений рода Vaccinium микромицет – возбудитель антракноза – гриб Colletotrichum acutatum J.H. Simmonds. Поражает этот фитопатоген не только чернику, голубику, клюкву, клубнику, вызывая гнили их ягод (Wharton, Schilder, 2008; Garrido et al., 2009; Polashock et al., 2009), но и плодовые (Lee et al., 2007) и хвойные деревья (Dingley, Gilmour, 1972). Гриб C. acutatum также входит в единый перечень карантинных объектов ЕЭС, но в его вторую часть (ограниченно распространенные на территории ЕЭС) (Eurasian economic commission, 2016).

При проведении идентификации того или иного возбудителя по симптомам на растении или по морфологическим признакам в чистой культуре, неизбежны ошибки, которые приводят к получению недостоверной информации. Известно, что корректная идентификация большинства грибов до таксонов уровня вида возможна только по молекулярным признакам. К таким грибам относятся и представители родов Diaporthe (Gomes et al., 2013; Udayanga et al., 2014; Gao et al., 2017; Santos et al., 2017) и Colletotrichum (Lee et al., 2007).

Например, длительное время считалось, что Diaporthe vaccinii, вызывающий заболевания черники, повсеместно распространен на территории Северной Америки, Канады, Европы, также сообщалось о находках на территории Китая и Чили (Naraouei-Khandan et al., 2017). Все находки были сделаны в результате идентификации этого гриба по морфологическим признакам спороносных структур или по симптомам на чернике. Однако, по морфологическим признакам D. vaccinii сходен с такими видами, как D. conorum (Desm.) Niessl, D. viticola Nitschke, D. columnaris (D. F. Farr et Castl.) Udayanga et Castl. (Farr et al., 2002b). Методы молекулярной филогении позволили заключить, что значительная часть изолятов из Северной Америки, Польши, Латвии, Нидерландов и все из Германии, которые по морфологическим признакам конидий и пикнид и по связи с питающим растением идентифицировали, как D. vaccinii, являются близкородственным видом D. eres Nitschke (Farr et al., 2002a; Vilka, Volkova, 2015; Michalecka et al., 2017). Кроме того, методы молекулярной филогении позволили заключить, что с видами рода Vaccinium, помимо видов D. eres и D. vaccinii, могут быть ассоциированы еще шесть видов этого рода: D. ambigua Nitschke, D. passiflorae Crous et L. Lombard (Elfar et al., 2013), D. asheicola L. Lombard et Crous, D. baccae L. Lombard, G. Polizzi et Crous, D. neotheicola A. J.L. Phillips et J.M. Santos, D. ster-ilis L. Lombard, G. Polizzi et Crous (Lombard et al., 2014) и D. australafricana Crous et Van Niekerk (Latorre et al., 2012; Elfar et al., 2013). Таким образом, данные о распространении этого опасного организма на территории Европы, Северной Америки, Канады и Чили требуют уточнения и ревизии. Так, на настоящий момент, в Европе достоверные находки D. vaccinii были сделаны только в Польше (Michalecka et al., 2017), Нидерландах, Латвии и Литве (Lombard et al., 2014).

Идентификация штаммов Colletotrichum acutatum, осуществляемая по морфологическим признакам, также может приводить к ошибкам в определении видовой принадлежности. Такой признак как форма конидий, имеющих веретеновидную форму и заостренные концы (Simmonds, 1965), который длительное время считался диагностическим, является нестабильным и может быть характерен и для других видов этого рода. Кроме того, конидии C. acutatum могут иметь и другую форму (Damm et al., 2012). Методы молекулярной филогении позволили заключить, что вид C. acutatum является сборным и включает в свой состав 29 видов Colletotrichum (Damm et al., 2012). Из них с кустарничками рода Vaccinium могут быть ассоциированы C. acutatum, C. fioriniae (Marcelino et Gouli) Pennycook, C. rhombiforme Damm, P.F. Cannon et Crous (Wharton, Schilder, 2008; Damm et al., 2012).

Изучение биоразнообразия грибов, вызывающих заболевания черники в России не проводилось. Опубликована информация об отдельных находках видов той или иной группы грибов, но нет результатов комплексного исследования микобиоты, сопровождаемого молекулярным анализом.

Целью данной работы была оценка биоразнообразия грибов, ассоциированных с черникой, произрастающей на территории северо-запада России и Финляндии, с помощью морфологических и молекулярно-генетических методов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Полевой материал. В период с июня по август 2017 г. на территории Пискаревского лесопарка в г. Санкт-Петербурге, в Ленинградской обл. (Лужский, Приозерский, Ломоносовский, Всеволожский, Гатчинский р-ны), в Республике Карелия (Пудожский р-н), а также на юго-западе Финляндии было собрано 17 образцов дикорастущей черники с некротическими пятнами на листьях и язвами на стеблях (рис. 1).

Рис. 1.

Симптомы листовой и стеблевой пятнистостей черники, наиболее часто наблюдаемые на северо-западе России и в Финляндии.

Изоляты. Из каждого образца брали фрагменты растений с симптомами поражения, которые поверхностно стерилизовали 5%-м р-ром гипохлорита натрия. В дальнейшем фрагменты тканей растений раскладывали на картофельно-сахарозную питательную среду (КСА) (Samson et al., 2000) с добавлением смеси антибиотиков (ампициллин, стрептомицин, пенициллин, HyClone, Austria) и 0.4 мкл/л р-ра Triton X-100 (Panreac, Spain). Чашки Петри инкубировали при 24°C в темноте. Отсев выросших грибов проводили на 7–10-е сутки, из каждой культуры гриба получали моноспоровые или монопикнидиальные изоляты. Все 67 анализированных изолятов хранятся в коллекции лаборатории микологии и фитопатологии ВИЗР.

Морфологический анализ. Идентификация изолятов до уровня секции, рода или семейства (в отдельных случаях до уровня вида) осуществлялась по морфологическим признакам, согласно определителям (Morochkovskiy et al., 1969; Boerema et al., 2004; Simmons, 2007; Gerlach, Nirenberg, 1982).

Выделение и секвенирование ДНК. Среди выделенных изолятов 31 был выбран для изучения с применением молекулярно-генетических методов (табл. 1). Мицелий для экстракции ДНК собрали с поверхности культур грибов, выращенных на КСА. Размол осуществляли с использованием шаровой мельницы MM 400 (Retsch, Germany) и стерильного стеклянного песка (0.3 мм диам.). Экстракцию ДНК проводили стандартным (СТАB/хлороформ) методом (Doyle, Doyle, 1990).

Для реконструкции молекулярной филогении и идентификации изолятов была произведена амплификация и последующее секвенирование таксономически информативных для анализируемой группы грибов локусов ДНК. Для Diaporthe анализировали последовательности областей внутренних транскрибируемых спейсеров рДНК (ITS), участков генов β-тубулина (TUB), фактора элонгации трансляции 1-α (TEF) и фрагмента гена, ответственного за синтез фермента ДНК-лиазы (apn2); Colletotrichum – ITS, TUB, TEF и фрагмента гена актина (ACT); Sporocadus – ITS и область большой субъединицы рибосомы рДНК (LSU); Kalmusia и Neocucurbitaria – ITS, TUB; Fusarium – TEF; изолятов грибов представителей семейства Didymellaceae – ITS, TUB и участка гена второй большой субъединицы фермента РНК-полимеразы II (RPB2).

Амплификацию ITS-области проводили с использованием праймеров ITS1F (Gardes, Bruns, 1993) и ITS4 (White et al., 1990); LSU – LR0R (Rehner, Samuels, 1994) и LR5 (White et al., 1990), ACT – Act-512F и Act-728R (Carbone, Kohn, 1999), apn2 – apn2fw2 и apn2rw2 (Udayanga et al., 2014), RPB2 – fRPB2-5F2 (Sung et al., 2007) и fRPB2-7cR (Liu et al., 1999), TEF – EF1-983F и EF1-1567R (Rehner, Buckley, 2005) или EF1-728F/EF1-986R (Carbone, Kohn, 1999), TUB – βtub2Fw и βtub4Rd (Aveskamp et al., 2009) или Т1 и Т2 (O’Donnell, Cigelnik, 1997; Saleh, Leslie, 2004).

Очищенные по стандартному протоколу (Boyle, Lew, 1995) фрагменты секвенировали методом Сэнгера (1977) на секвенаторе ABI Prism 3500 (Applied Biosystems – Hitachi, Япония) в соответствии с рекомендациями производителя с использованием набора реактивов Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (ABI, США).

Молекулярно-филогенетический анализ. Нуклеотидные последовательности выравнивали с помощью программы ClustalX 1.8 (Thompson et al., 1997), после чего при необходимости выравнивание корректировали вручную. Филогенетические деревья были построены согласно трем алгоритмам. Метод максимального правдоподобия (maximum likelihood – ML) применяли с использованием программного обеспечения RAxML (randomized accelerated maximum likelihood) v. 7.2.8 (Stamatakis et al., 2006). Принцип максимальной экономии (maximum parsimony – MP) применяли с использованием программного обеспечения Molecular Evolutionary Genetics Analysis версии 10 (MEGA X; Kumar et al., 2018). Анализ последовательностей методом Байесовской статистики (BPP) проводили с использованием программы Mr. Bayes v. 3.2.1., интегрированной в платформу Armadillo v. 1.1 (Lord et al., 2012). Надежность топологии дендрограмм, построенных разными методами, оценивали с помощью бутстреп-анализа c 1000 повторностей. В качестве референсных использовали полученные из базы данных GenBank последовательности ITS и LSU локусов рДНК, генов ACT, apn2, TEF, TUB, RPB2 разных видов и штаммов грибов (табл. 2).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Всего из листьев и стеблей черники было выделено 67 изолятов грибов. В результате идентификации по морфологическим признакам определено 16 родов аскомицетов, относящихся к 8 порядкам (Amphisphaerellales, Diaporthales, Capnodiales, Eurotiales, Glomerellales, Hypocreales, Pleosporales, Sordariales) и 13 семействам (Capnodiaceae, Chaetomiaceae, Cladosporiaceae, Coniothyriaceae, Diaporthaceae, Didymellaceae, Glomerellaceae, Hypocreaceae, Nectriaceae, Pestalotiopsidaceae, Pleosporaceae, Sordariaceae, Trichocomaceae).

Из исследуемой коллекции изолятов до уровня вида были определены Fusarium avenaceum (Fr.) Sacc., F. incarnatum (Desm.) Sacc., F. sporotrichioides Sherb. До таксона уровня секции идентифицировали Alternaria sect. Alternaria D.P. Lawr., Gannibal, Peever et B.M. Pryor, Alternaria sect. Infectoriae Woudenb. et Crous. До уровня рода идентифицировали Boeremia Aveskamp, Gruyter et Verkley, Chaetomium Kunze, Cladosporium Link., Colletotrichum Сorda, Coniothyrium Corda, Curvularia Boedijn, Diaporthe Nitschke, Epicoccum Link., Penicillium Link., Pestalotiopsis Steyaert, Sordaria Ces. et De Not, Trichoderma Pers. Кроме того, часть изолятов была идентифицирована только до уровня семейства Didymellaceae.

Также идентифицировали грибы из двух родов базидиомицетов – Rhizoctonia DC. и Sporotrichum Link., относящихся к порядкам Cantharellales и Polyporales и семействам Ceratobasidiaceae и Fomitopsidaceae, соответственно.

Всего 31 изолят из групп, надежное определение которых на настоящий момент рекомендуется осуществлять по молекулярно-генетическим признакам (роды Colletotrichum, Diaporthe, представители Didymellaceae, вид F. avenaceum), был изучен с применением методов молекулярной идентификации. В результате проведенного анализа установлена видовая принадлежность 30 штаммов, идентификация одного осуществлена до рода.

В мультилокусный анализ нуклеотидных последовательностей трех локусов семи наших изолятов Diaporthe были включены последовательности 58 референсных штаммов Diaporthe, составляющих комплекс видов D. eres, в качестве внешней группы взят штамм D. citri F.A. Wolf (AR3405). После проведения выравнивания, матрицы каждого штамма, используемые для реконструкции филогении, имели длину 1418 оснований (394 – TUB, 290 – TEF, 734 – apn2), число вариабельных сайтов составляло 265 (18.7%). Топология филограмм, построенных разными методами и на основании последовательностей каждого локуса в отдельности совпадала с топологией комбинированной филограммы. Участки ITS-локуса были проанализированы, но не включены в филогенетический анализ из-за низкой информативности. Филогенетическое дерево, сконструированное в результате анализа последовательностей трех локусов с применением метода ML, приведено на рисунке 2. Все наши штаммы Diaporthe кластеризовались в пределах комплекса видов D. eres. Два штамма MF-Vm17-013, MF-Vm17-029 формировали одну кладу со штаммом D. pulla Nitschke (CBS 338.89). Остальные пять штаммов (MF-Vm17-001, MF-Vm17-008, MF-Vm17-009, MF-Vm17-019, MF-Vm17-030) формировали субклады в пределах вида D. eres.

Рис. 2.

Комбинированное филогенетическое древо комплекса видов Diaporthe eres, построенное методом ML, основанное на нуклеотидных последовательностях TUB, TEF, apn2. Числовые значения бутстреп-поддержки, полученные методами ML, MP и BPP, приведены в узлах ветвей филограммы, соответственно. Номера исследованных штаммов выделены полужирным.

Для видов родов представителей семейства Didymellaceae осуществлено мультилокусное секвенирование нуклеотидных последовательностей трех таксономически информативных фрагментов. В анализ включены последовательности 10 наших изолятов представителей семейства Di-dymellaceae и 25 референсных штаммов, в качестве внешней группы взят штамм Macroventuria anomochaeta AA (CBS 525.71). После проведения выравнивания, матрицы каждого штамма, используемые для реконструкции филогении, имели длину 1333 оснований (454 – ITS, 289 – TUB, 590 – RPB2), число вариабельных сайтов составляло 298 (22.5%). Топология филограмм, построенных разными методами и на основании последовательностей каждого локуса в отдельности совпадала с топологией комбинированной филограммы. Филогенетическое дерево, сконструированное в результате анализа последовательностей трех локусов с применением метода ML, приведено на рис. 3.

Рис. 3.

Комбинированное филогенетическое древо семейства Didymellaceae (роды Boeremia, Heterophoma, Microsphaeropsis), построенное методом ML, основанное на нуклеотидных последовательностях ITS, TUB, RPB2. Числовые значения бутстреп-поддержки, полученные методами ML, MP и BPP, приведены в узлах ветвей филограммы, соответственно. Номера исследованных штаммов выделены полужирным.

Восемь штаммов (MF-Vm17-010, MF-Vm17-012, MF-Vm17-015, MF-Vm17-016, MF-Vm17-017, MF-Vm17-018, MF-Vm17-028, MF-Vm17-039) кластеризовались в пределах клады, сформированной видами рода Heterophoma Qian Chen et L. Cai. Внутри этой клады семь штаммов формировали единую субкладу с типовым штаммом Heterophoma sylvatica (Sacc.) Qian Chen et L. Cai (CBS 874.97). Штамм MF-Vm17-039 формировал отдельную субкладу, не включающую референсные штаммы этого рода. Штамм MF-Vm17-006 входил в состав клады Microsphaeropsis Höhn., внутри которой был в одной субкладе с репрезентативным штаммом Microsphaeropsis olivacea (Bonord.) Höhn. (CBS 233.77). Штамм MF-Vm17-035 располагался в кладе с репрезентативными штаммами Boeremia exigua (Desm.) Aveskamp, Gruyter et Verkley.

В мультилокусный анализ видов рода Colletotrichum включены последовательности двух наших изолятов и 10 референсных штаммов, в качестве внешней группы взят штамм Colletotrichum godetiae Neerg. (CBS 133.44). После проведения выравнивания, матрицы каждого штамма, используемые для реконструкции филогении, имели длину 1220 оснований (538 – ITS, 461 – TUB, 221 – ACT), число вариабельных сайтов составляло 88 (7.2%). Участки гена TEF были проанализированы, но не включены в филогенетический анализ. Топология филограмм, построенных разными методами и на основании последовательностей каждого локуса в отдельности и комбинированная совпадали. Филогенетическое дерево, сконструированное в результате анализа последовательностей трех локусов с применением метода ML, приведено на рис. 4. Два исследованных штамма Colletotrichum (MF-Vm17-043, MF-Vm17-044) внутри комплекса видов C. acutatum J.H. Simmonds формировали единую кладу вместе со штаммами C. salicis (Fuckel) Damm, P.F. Cannon et Crous, включая типовой штамм CBS 607.94.

Рис. 4.

Комбинированное филогенетическое древо видов Colletotrichum, построенное методом ML, основанное на нуклеотидных последовательностях ITS, TUB, ACT. Числовые значения бутстреп-поддержки, полученные методами ML, MP и BPP, приведены в узлах ветвей филограммы, соответственно. Номера исследованных штаммов выделены полужирным.

Вид рода Sporocadus идентифицирован в результате мультилокусного секвенирования нуклеотидных последовательностей двух фрагментов рДНК. В анализ включены последовательности одного нашего изолята MF-Vm17-047 и 11 референсных штаммов, в качестве внешней группы взят штамм Sporocadus cornicola (Wijayaw. et Camporesi) F. Liu, L. Cai et Crous (CBS 143889). После проведения выравнивания, матрицы каждого штамма, используемые для реконструкции филогении, имели длину 1304 оснований (515 – ITS, 789 – LSU), число вариабельных сайтов составляло 29 (2.2%). Топология филограмм, построенных разными методами и на основании последовательностей каждого локуса в отдельности и комбинированная совпадали. Филогенетическое дерево, сконструированное в результате анализа последовательностей двух локусов с применением метода ML, приведено на рис. 5. Исследованный штамм MF-Vm17-047 внутри рода Sporocadus формирует единую кладу вместе со штаммами S. rosigena F. Liu, L. Cai et Crous.

Рис. 5.

Комбинированное филогенетическое древо видов Sporocadus, построенное методом ML, основанное на нуклеотидных последовательностях ITS и LSU. Числовые значения бутстреп-поддержки, полученные методами ML, MP и BPP, приведены в узлах ветвей филограммы, соответственно. Номера исследованных штаммов выделены полужирным.

В анализ результатов мультилокусного секвенирования видов рода Kalmusia включены последовательности одного нашего изолята MF-Vm17-041 и пяти референсных штаммов. В качестве внешней группы взят штамм Alloconiothyrium aptrootii Verkley, Göker et Stielow (CBS 981.95). После проведения выравнивания, матрицы каждого штамма, используемые для реконструкции филогении, имели длину 856 оснований (457 – ITS, 399 – TUB), число вариабельных сайтов составляло 132 (15.4%). Топология филограмм, построенных разными методами и на основании последовательностей каждого локуса в отдельности и комбинированная, совпадали. Филогенетическое дерево, сконструированное в результате анализа последовательностей двух локусов с применением метода ML, приведено на рис. 6. Исследованный штамм MF-Vm17-041 внутри рода Kalmusia формирует единую кладу вместе со штаммами Kalmusia longispora (Verkley, Göker et Stielow) Ariyaw. et K.D. Hyde, включая типовой штамм CBS582.83.

Рис. 6.

Комбинированное филогенетическое древо видов Kalmusia, построенное методом ML, основанное на нуклеотидных последовательностях ITS и TUB. Числовые значения бутстреп-поддержки, полученные методами ML, MP и BPP, приведены в узлах ветвей филограммы, соответственно. Номера исследованных штаммов выделены полужирным.

Мультилокусное секвенирование двух фрагментов ДНК видов рода Neocucurbitaria проведено для одного нашего изолята MF-Vm17-040 и семи референсных штаммов, в качестве внешней группы взят штамм Neocucurbitaria hakeae (Crous) Valenz.-Lopez, Crous, Stchigel, Guarro et J.F. Cano (CPC28920). После проведения выравнивания, матрицы каждого штамма, используемые для реконструкции филогении, имели длину 810 оснований (491 – ITS, 319 – TUB), число вариабельных сайтов составляло 74 (9.1%). Топология филограмм, построенных разными методами и на основании последовательностей каждого локуса в отдельности и комбинированная, совпадали. Филогенетическое дерево, сконструированное в результате анализа последовательностей двух локусов с применением метода ML, приведено на рис. 7. Исследованный штамм MF-Vm17-040 внутри рода Neocucurbitaria формировал единую кладу вместе со штаммами N. cava (Schulzer) Valenz.-Lopez, Crous, Stchigel, Guarro et J.F. Cano, включая типовой штамм CBS 257.68.

Рис. 7.

Комбинированное филогенетическое древо видов Neocucurbitaria, построенное методом ML, основанное на нуклеотидных последовательностях ITS и TUB. Числовые значения бутстреп-поддержки, полученные методами ML, MP и BPP, приведены в узлах ветвей филограммы, соответственно. Номера исследованных штаммов выделены полужирным.

На основании нуклеотидных последовательностей фрагмента гена TEF девяти штаммов Fusarium, предварительно отнесенных к Fusarium avenaceum по морфологическим признакам, показано наибольшее сходство (100%) со штаммом F. avenaceum BRIP:64445 (KU529161), выделенным из пиретрума, собранного в Австралии.

ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведенных исследований коллекции штаммов грибов, выделенных из пораженных листьев и стеблей черники, по морфологическим и молекулярно-генетическим признакам нами идентифицировано 12 видов грибов: Boeremia exigua, Colletotrichum salicis, Diaporthe eres, D. pulla, Fusarium avenaceum, F. incarnatum, F. sporotrichioides, Heterophoma sylvatica, Kalmusia longispora, Micro-sphaeropsis olivacea, Neocucurbitaria cava, Sporocadus rosigena. Были выявлены грибы из двух секций рода Alternaria: Alternaria и Infectoriae. Кроме того, показано, что на растениях черники, растущей на северо-западе Европы, могут развиваться представители относящиеся, как минимум, к 21 роду грибов из двух отделов, 10 порядков, 15 семейств. Помимо вышеперечисленных родов грибов, обнаружены микромицеты из родов Chaetomium, Cladosporium, Coniothyrium, Curvularia, Epicoccum, Penicillium, Pestalotiopsis, Sordaria, Trichoderma.

Все выделенные из черники штаммы Diaporthe идентифицированы как представители комплекса видов Diaporthe eres. Известно, что этот гриб является весьма полиморфным и филогенетически гетерогенным, его представители могут быть ассоциированы с разными. Нуклеотидные последовательности ITS-локуса оказались неинформативными для реконструкции филогении в этой группе грибов, что было показано ранее (Udayanga et al., 2014). Поэтому они были депонированы в базу GenBank, но исключены из филогенетического анализа. Два штамма MF-Vm17-001, MF-Vm17-008 формировали субкладу в кладе, которую ранее трактовали, как вид D. cotoneastri (Punith.) Udayanga, Crous et K.D. Hyde. Штамм MF-Vm17-030 формировал отдельную субкладу, близкородственную кладам, которые ранее понимали, как виды D. cotoneastri и D. nobilis Sacc. et Speg. Штамм MF-Vm17-019 занимал на филогенетическом древе обособленное положение, формируя отдельную субкладу. В кладе, включающей штамм D. eres AR5193, являющийся эпитипом этого вида, оказался штамм MF-Vm17-009. В результате ревизии вида D. eres и видов, составляющих комплекс D. eres, выделение таких видов как D. cotoneastri, D. nobilis и других признано избыточным, и наименования этих таксонов синонимизировали с именем D. eres (Udayanga et al., 2014; Yang et al., 2018). Вероятно, это ожидает и вид D. pulla, который на филогенетических деревьях располагался среди штаммов D. eres и включал в состав формируемой им клады два штамма MF-Vm17-013 и MF-Vm17-029. На настоящий момент вид D. pulla еще является легитимным и эти штаммы, выделенные из черники, собранной в Санкт-Петербурге и Гатчинском р-не Ленинградской обл., согласно актуальным взглядам на филогению комплекса видов D. eres являются видом D. pulla. Входящий в список карантинных объектов Евразийского экономического союза, вид D. vaccinii, который также входит в состав комплекса видов D. eres нами обнаружен не был.

Гриб Colletotrichum acutatum, также входящий в единый перечень карантинных объектов, среди исследованных штаммов нами обнаружен не был. Два штамма Colletotrichum MF-Vm17-043, MF-Vm17-044 идентифицированы, как C. salicis. Этот микромицет входит в состав комплекса видов C. acutatum. Данный гриб не имеет узкой субстратной специализации и может быть ассоциирован с растениями разных семейств, однако, считается, что чаще он развивается на древесных растениях. Помимо разных видов ивы, из которых часто выделяют этот вид гриба, известны его штаммы из клена, араукарии, яблони, тополя, груши, томата и клубники (Cunnington et al., 2007; Pennycook, 1989; Guerber et al., 2003; Gadgil, 2005; Sun et al., 2011; Mulenko et al., 2008; Damm et al., 2012). Распространен C. salicis на территории стран Европы, в США, Австралии и Новой Зеландии, но в России этот гриб выявлен нами впервые.

Корректная и достоверная идентификация карантинных вредоносных видов Diaporthe vaccinii и Colletotrichum acutatum только на основании морфологических признаков невозможна и требует молекулярно-филогенетического анализа. Выявление и идентификацию этих грибов следует проводить в соответствии с современными взглядами на биоразнообразие и таксономию этих микромицетов.

Опубликованной информации о выявлении грибов Fusarium на чернике нами не обнаружено. Однако на культурных посадках голубики (Vaccinium corymbosum) виды Fusarium solani (Mart.) Sacc. (Pérez et al., 2007), F. proliferatum (Matsush.) Nirenberg ex Gerlach et Nirenberg (Pérez et al., 2011), F. oxysporum Schltdl. (Moya-Elizondo et al., 2019) приводили к корневой гнили и увяданию растений, а F. acuminatum Ellis et Everh. вызывал некрозы стеблей (Wright et al., 2014). В проведенных исследованиях идентифицировано три вида: F. avenaceum, F. incarnatum, F. sporotrichioides, среди которых F. avenaceum встречался повсеместно на несущих симптомы растениях. По всей видимости, это первое упоминание видов грибов Fusarium на чернике.

Считается, что вид Heterophoma sylvatica, к которому относятся семь исследованных штаммов, широко распространен в Европе на растениях семейства Scrophulariaceae и встречается также в ассоциации с корнями растений семейства Poaceae (Boerema et al., 2004). Нами этот вид впервые был выделен из черники, собранной во Всеволожском и Ломоносовском р-нах Ленинградской области. Несмотря на то, что для реконструкции молекулярной филогении штаммов Heterophoma в анализ были включены все шесть известных на настоящий момент видов этого рода, штамм MF-Vm17-039, выделенный из стеблей черники, собранной в Лужском районе Ленинградской обл. не входит в состав ни одной из клад, сформированной каждым видом, а формирует отдельную кладу. Таким образом, вероятно, этот штамм Heterophoma sp. является новым для науки видом этого рода.

Микромицет Microsphaeropsis olivacea (штамм MF-Vm17-006) был выявлен на многих растениях разных семейств, как сапротроф или эндофит (Hormazabal et al., 2014), в редких случаях, как фитопатоген (Razaghi, Zafari, 2016) или патоген, вызывающий микозы человека с ослабленным иммунитетом (Guarro et al., 1999). Данный вид впервые обнаружен на территории России – штамм выделен из черники, собранной в Лужском р-не.

Гриб Kalmusia longispora также выявлен на территории России впервые, штамм этого гриба MF-Vm17-041 выделен из черники, собранной на территории Санкт-Петербурга. До настоящего момента этот гриб был выделен из омелы (Arceuthobium pusillum Peck.) с территории Канады и из листьев пшеницы с симптомами пятнистости в Германии (Verkley et al., 2014).

Штамм MF-Vm17-040, который идентифицирован, как гриб Neocucurbitaria cava является первой находкой этого микромицета в России, он выявлен в Ломоносовском районе Ленинградской области. Это гриб известен как почвенный сапроторф или эндофит, ассоциированный преимущественно с древесными растениями или кустарниками (de Gruyter et al., 2010, Jaklitsch et al., 2018).

Sporocadus rosigena описан на территории Италии как сапротроф с мертвых иголок розы (Wanasinghe et al., 2018), впоследствии этот гриб также выявляли на растениях других семейств с территории других стран Европы и в Иране (Liu et al., 2019). Нами штамм этого гриба MF-Vm17-047 был впервые обнаружен на чернике, собранной на территории Финляндии.

Полученные результаты позволяют предварительно оценить биоразнообразие микромицетов на чернике, собранной на территории северо-запада России и в Финляндии. Для более детальной оценки, несомненно, необходим многолетний мониторинг и расширение географии сбора образцов, а также дальнейшие исследования, с включением в молекулярно-генетический анализ бόльшего числа штаммов.

Авторы выражают искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории микологии и фитопатологии ВИЗР О.П. Гавриловой и И.А. Казарцеву за помощь со сбором пораженных растений черники. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 19-76-30005).