Микология и фитопатология, 2021, T. 55, № 6, стр. 440-448

ВВЕДЕНИЕ

Более 50% потребляемого людьми белка приходится на долю 8 основных злаков: пшеницы, кукурузы, риса, ячменя, овса, сорго, ржи и проса (Cordain, 1999). Белок в зерновках злаков локализован преимущественно в эндосперме и на 75–80% представлен глютеном, или клейковиной. Под этим термином понимают совокупность гликозилированных белков, обогащенных аминокислотными остатками пролина и глутамина. Среди компонентов глютена выделяют две группы белков – проламины и глютелины. Каждый род злаков образует специфические проламины; так, проламины пшеницы называют глиадинами, проламины овса – авенинами, в зерновках ячменя накапливаются гордеины, а в зерновках ржи – секалины (Shewry and Tatham 1990).

Важной особенностью компонентов глютена является выраженная аллергенность некоторых продуктов их неполного гидролиза. Аллергические реакции у людей с непереносимостью глютена проявляются как в форме нарушения процессов всасывания питательных веществ и дефекации, так и в форме повышенного риска развития остеопороза и Т-клеточных лимфом. Данные симптомы и состояния описываются обобщенным диагнозом “целиакия”, называемым также глютеновой энтеропатией, болезнью Ги–Гейтера-Гейбнера или глютенчувствительным спру (Zhuchkov, Kotlyarov, 2017).

Поскольку целиакия является генетически опосредованным заболеванием, комплекс мер поддержки пациентов в первую очередь направлен на обеспечение безглютеновой диеты. Формирование подобной диеты может происходить как путем полного исключения из рациона злаковых продуктов, так и путем их предварительной обработки. Второй подход имеет ряд преимуществ по сравнению с первым, т.к. существенно расширяет разрешенный для пациентов с целиакией набор блюд.

Для очистки злаковых продуктов от аллергенных глютеновых эпитопов можно использовать секретируемые пептидазы бактерий и грибов. На сегодняшний день известны сотни штаммов-продуцентов различных секретируемых пептидаз, однако особенностью глютена является специфический аминокислотный состав с высокой долей пролина и глутамина. Получение безглютеновых продуктов, также как возможность использования специфических ферментов с подобными активностями для пероральной энзимотерапии целиакии требуют ферментов с разными свойствами. Многие пептидазы, применяющиеся в промышленности для изготовления моющих средств или для осветления соков, не могут быть использованы в качестве глютенрасщепляющих агентов. Проведенный анализ имеющихся данных показал, что наиболее вероятными кандидатами, способными эффективно расщеплять глютен и его богатые пролином/глутамином фрагменты, являются пролинспецифичные пептидазы (ПСП), расщепляющие связи, образованные пролином, а также ферменты, гидролизующие связи с участием глутамина. ПСП хорошо изучены у бактерий (Kõiv, Tenson 2021) и животных (Dunaevsky et al., 2020), тогда как у грибов подавляющая часть подобных исследований была сделана с пролилэндопептидазой Aspergillus niger (Stepniak et al., 2006), A. oryzae (Eugster et al., 2015) и Flammulina velutipes (Schulz et al., 2018). Что касается ферментов с постглутаминрасщепляющей активностью, то пока только у бактерий найдены субтилизин-подобные пептидазы (СПП), обладающие такой активностью (Wei et al., 2016; Darwish et al., 2019). Интересными для поиска новых секретируемых пептидаз, причем не только щелочеустойчивых, являются грибы щелочных местообитаний. Недавно получены сведения, что алкалофильный вид Sodiomyces alkalinus (Plectosphaerellaceae), обитающий в грунтах щелочных озер, усваивают преимущественно белковые субстраты, в том числе и трудно гидролизуемые, в то время как хитиназы и пектиназы у него оказались утрачены (Grum-Grzhimaylo et al., 2018).

Целью настоящей работы был поиск, идентификация и предварительная характеристика пептидаз с глютен-расщепляющей активностью у алкалофильных микромицетов S. alkalinus и S. magadiensis.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы. Исследовали штаммы S. alkalinus F11 и S. magadiensis B39 из коллекции кафедры микологии и альгологии МГУ.

Биоинформатическое сравнение аминокислотных последовательностей ПСП и СПП S. alkalinus F11 с гомологами в геномах других высших грибов. В секвенированных геномах, включая геном S. аlkalinus, из базы данных NCBI, включающих представителей всех 6 подотделов высших грибов, а также представителей различных морфологических групп (дрожжи, мицелиальные грибы, лихенизированные грибы) и эколого-трофических групп (гумусовые сапротрофы, ксилотрофы, фитопатогены, энтомопатогены), проведен поиск гомологов известных ПСП и СПП по аминокислотным последовательностям при помощи сервиса Protein Blast (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). В качестве порога отсечения были приняты E-value 1 × × 10–20 и покрытие 75%. Для каждого гомолога были рассчитаны следующие параметры: молекулярная масса, число аминокислот и изоэлектрическая точка при помощи онлайн-ресурса Isoelectric point calculator (http://isoelectric.org/calculate.php); наличие, размер и положение сигнального пептида и трансмембранного домена (сервисы SignalP-5.0 и TMHMM Server v. 2.0, http://www.cbs.dtu.dk/services/). После этого аминокислотные последовательности обнаруженных гомологов пептидаз были выравнены при помощи сервиса Cobalt (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/cobalt.cgi). В сервисе Batch (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi) был проведен поиск консервативных доменов изучаемых гомологов пептидаз. В случае обнаружения последовательностей, имеющих высокую гомологию к нескольким аннотированным белкам, был использован сервис EFI-EST (https://efi.igb.illinois.edu/efi-est/), осуществляющий кластерный анализ на основе попарного сравнения всех последовательностей без предварительного выравнивания.

Питательные среды и условия культивирования. Щелочная ферментационная среда (ЩФС), pH 10.3, включала минеральный компонент щелочного мальт-агара (ЩА) и три модификации питательного компонента ЩА для изготовления жидких сред, отличающихся источником белка (200 мл солодового экстракта (15° по шкале Баллинга), 10.0 г казеина или 10.0 г пептона). Образцы культур хранили на скошенном ЩА при температуре 4°С. Для работы агаризованные блоки с поверхностным мицелием со скошенного агара пересевали в колбы Эрленмейера объемом 150 мл, содержащие 50 мл жидкой ЩФС. Колбы помещали на орбитальную качалку при 25°С, скорость вращения составляла 250 об./мин.

Получение фильтрата культуральной жидкости и определение сухой массы мицелия. После инкубации на орбитальной качалке мицелий отделяли двойной фильтрацией через предварительно взвешенную фильтровальную бумагу, после чего отфильтрованная жидкость очищалась повторно при помощи центрифугирования (6000 об./мин, 10 мин). Для предотвращения развития контаминантов в полученный фильтрат добавляли 8%-й азид натрия (2.5 мкл/мл NaN₃). Фильтраты хранили при 4°С. Фильтровальную бумагу с мицелием помещали в сушильный шкаф, доводили до постоянного веса при 60°С, после чего взвешивали и рассчитывали сухую массу мицелия вычитанием исходной массы бумаги.

Измерение активности сериновых пептидаз. Для измерения активности пептидаз в тестируемом фильтрате использовали метод спектрофотометрии. В лунку 96-луночного полистиролового планшета для иммуноферментного анализа помещали 175 мкл универсального буфера (УБ) с заданным pH, затем добавляли 20 мкл исследуемого фильтрата и 5 мкл хромогенного субстрата, несущего п-нитроанилидную метку (λ = 405 нм). Общий объем реакционной смеси в каждой лунке планшета составлял 200 мкл. В контрольных лунках культуральную жидкость заменяли на 20 мкл УБ. Планшеты с реакционной смесью инкубировали в спектрофотометре ELx800 при 37°С от 45 до 120 мин в режиме кинетического анализа оптической плотности (λ = 405 нм); измерение оптической плотности реакционной смеси проводили каждые 10 минут. В работе со спектрофотометром использовали программное обеспечение Gen5 BioTek, полученные данные были обработаны в программе MO 365.

Был использован ряд специфических хромогенных субстратов, на C-конце которых расположена п-нитроанилидная метка, а именно: Ala-Pro-pNa, Pro-pNa и Glp-Phe-Gln-pNA в концентрации 10 мМ, а также флуорогенные субстраты Abz-LPYPQPQLPQ-EDDnp и Abz-QPQQPFPQ-EDDnp в концентрации 2 мМ. Все перечисленные субстраты были растворены в диметилформамиде. Измерение интенсивности флуоресценции проводили при помощи флуориметра на черных полистироловых планшетах (λ1 = 340 нм, λ2 = 400 нм); в опыте использовали аналогичный объемный состав реакционной смеси. За единицу ферментативной активности (ед.) принимали такое количество фермента в расчете на 1 мг сухой массы мицелия, которое при гидролизе субстрата в указанных условиях инкубации вызывало за 1 час увеличение оптической плотности раствора при 405 нм на 0.01.

Определение оптимума pH активности пептидаз. В лунку полистиролового планшета вносили 20 мкл раствора, содержащего исследуемую пептидазу, 175 мкл универсального буфера (УБ) (Britton, Robinson, 1931) подобранной кислотности для придания необходимого pH (pH 2.0–11.0) и 5 мкл хромогенного субстрата. Полученную реакционную смесь измеряли на спектрофотометре по описанной выше процедуре.

Определение pH-стабильности пептидаз. В лунку полистиролового планшета вносили 20 мкл раствора, содержащего исследуемую пептидазу и заданный объем 0.01 М УБ подобранной кислотности для придания необходимого pH (pH 2.0–13.0). Полученный раствор инкубировали 60 минут при постоянном перемешивании на качалке (300 об./мин), после чего вносили 0.1 М УБ с подобранным pH до объема 195 мл и получения pH инкубационной смеси 7.5 (оптимум pH работы пептидаз из предыдущего эксперимента), перемешивали, добавляли 5 мкл хромогенного субстрата и проводили кинетический анализ ферментативной реакции на спектрофотометре.

Изучение влияния ингибиторов на активность пептидаз. Были использованы специфические ингибиторы пептидаз различных классов и групп, как-то: фенилметилсульфонил фторид (PMSF), ЭДТА-Na2, йодацетамид, Ala-Pro-N-метил-2-пирролидон (АР-NMP), Ala-D-Pro-N-метилформамид (АР-MF), Ala-D-Pro-пипеколовая кислота (АР-Pip), вилдаглиптин, ситаглиптин, дипротин А, дипротин B. В одну лунку планшета вначале помещали 20 мкл исследуемого фильтрата, 170 мкл УБ (pH 7.5) и 5 мкл стокового раствора ингибитора (ЭДТА-Na₂, йодацетамид – 10^–2 М, все остальные 10^–3 М). Полученную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин, после чего вносили 5 мкл хромогенного субстрата и проводили кинетический анализ ферментативной реакции.

Определение активности пептидаз в отношении глиадина. 1 мг глиадина растворяли в 1 мл 70%-го этанола, затем добавляли к раствору 500 мкл УБ с pH 8.0 и 50 мкл культуральной жидкости. В контрольном опыте к исходному раствору глиадина добавляли 480 мкл УБ, 20 мкл 1 мМ PMSF и 50 мкл культуральной жидкости. После центрифугирования 10 мкл реакционной смеси отбирали в нулевой момент времени и проводили нингидриновую реакцию, остальную часть ресуспендировали и инкубировали при 23°C в течение 12 ч на шейкере. После инкубации реакционную смесь вновь центрифугировали, отбирали 10 мкл реакционной смеси и повторяли измерение. Для определения концентрации свободных аминокислот и пептидов к 10 мкл реакционной смеси добавляли 190 мкл 0.1%-го р-ра нингидрина в этаноле, после чего инкубировали в течение получаса при температуре 80°С. Измерение оптической плотности проводили на спектрофотометре при λ = 545 нм.

Все эксперименты были проведены в 3-кратной повторности. Рассчитаны средние значения активности пептидаз и стандартные отклонения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ аннотированного генома S. alkalinus F11 указывает на присутствие 10 гомологов сериновых пролинспецифичных пептидаз (ПСП) и субтилизин-подобных пептидаз (СПП). Среди обнаруженных гомологов две последовательности принадлежат к группе дипептидилпептидаз (DPP4) (табл. 1). Первая последовательность (ROT37187.1) соответствует белку длиной 947 аминокислот, содержащему трансмембранный участок; вторая последовательность (ROT38925.1) лишена трансмембранного участка, но содержит классический сигнальный пептид. pI этих последовательностей составляют 4.80 и 4.66; молекулярные массы – 106.0 и 87.5 кДа. Оба гомолога содержат в своем составе консервативный домен DPP_IV на N-конце и домен Peptidase_S9 с пептидазной активностью на C-конце. В обоих случаях последовательности содержат консервативную триаду аминокислот, необходимую для катализа.

Обнаруженный у S. alkalinus F11 один гомолог пролинаминопептидазы (PAP) (XP_028465097.1) длиной 388 аминокислотных остатков содержит домен суперсемейства альфа/бета-гидролаз и лишен сигнального пептида и трансмембранного участка. pI PAP составляет 4.60, молекулярная масса – 39.2 кДа.

Гомолог пролилэндопептидазы (PEP) (ROT41790.1) состоит из 399 аминокислотных остатков с молекулярной массой 44.8 кДа. Как и другие гомологи кислой эндопептидазы Aspergillus niger, у данного фермента pI в кислой области (pH 4.6). Последовательность PEP состоит из единственного домена суперсемейства альфа/бета-гидролаз и не содержит сигнального пептида и трансмембранного участка. Консервативная триада аминокислот представлена в полном объеме.

В геноме Sodiomyces alkalinus F11 обнаружен также целый ряд гомологов СПП. Среди них можно выделить 3 гомолога протеиназы K (XP_028467389.1, XP_028465997.1 и XP_028468757.1), которые содержат N-концевой сигнальный пептид и не содержат трансмембранного домена. Молекулярная масса варьирует от 41.7 до 56.1 кДа, pI – от 5.04 до 6.5. Данные последовательности содержат два консервативных домена: N-концевой ингибирующий домен Inhibitor_I9 и каталитический домен Peptidases_S8_PCSK9. Порядок консервативных аминокислотных остатков соответствует таковому у других СПП. Одна аминокислотная последовательность S. alkalinus F11 соответствует субтилизину (XP_028463943.1). Данная последовательность содержит 476 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 53.2 кДа. Изоэлектрическая точка данного белка, согласно расчетам, составляет 5.64. Доменная структура субтилизина совпадает с таковой у протеиназы K. Последовательность XP_028470351.1 является гомологом пиролизина из группы СПП. Данный белок, согласно расчетам, состоит из 908 аминокислот и имеет молекулярную массу 97.6 кДа. Изоэлектрическая точка пиролизина составляет 4.72. В составе данной последовательности выделяется 4 консервативных домена: N-концевой ингибиторный домен Inhibitor_I9, крупный каталитический домен Peptidases_S8_5, расположенный внутри него специфический для грибов домен PA_PoS1_like и C-концевой домен из суперсемейства fn3_6. Наличие в составе последовательности пиролизина сигнального пептида может свидетельствовать о секреции данного фермента. И, наконец, в геноме S. alkalinus F11 среди SLP обнаружен один гомолог кексина (XP_028467150.1). В составе данного фермента 866 аминокислот, из которых 18 приходится на сигнальный пептид, а с 726 по 748 остатки образуют трансмембранный участок. Рассчитанная изоэлектрическая точка данного кексина составляет 5.02. Белок имеет двухдоменную структуру и состоит из N-концевого каталитического домена Peptidases_S8_kexins и C-концевого домена P_proprotein, характерного для пропротеиновых конвертаз.

Присутствие in vivo пролинрасщепляющей и постглутамингидролизующей активностей в культуральной жидкости S. аlkalinus F11 и S. magadiensis B39 было подтверждено использованием специфических пролин/глутаминсодержащих субстратов (табл. 2). Наличие у этих грибов активности в отношении субстрата Pro-pNA свидетельствует о присутствии в культуральной жидкости PAP, Ala-Pro-pNA является специфическим субстратом для DPP4, а субстрат Glp-Phe-Gln-pNA детектируют наличие в культуральной жидкости постглутамин-расщепляющей активности.

Подбор оптимальной питательной среды с точки зрения секреции сериновых пептидаз показал, что секреция DPP4 наблюдается на всех вариантах ЩФС, причем наибольшая активность фермента обнаруживается в присутствии пептона или казеина в качестве источника азота и углерода. На среде с суслом активность секретируемой DPP4 была более чем в 2–3 раза ниже (рис. 1). В дальнейшем в качестве основной среды была использована среда ЩФС с добавлением пептона.

Рис. 1.

Активность DPP4 в культуральной жидкости штаммов Sodiomyces аlkalinus F11 и S. magadiensis B39, растущих на различных средах (отрезками на рисунках обозначены границы доверительного интервала средней арифметической активности DPP4 на 95%-м уровне значимости).

Изучение зависимости величины секретируемой активности от срока культивирования выявило типичную логистическую кривую динамики роста сухой массы. Лаг-фаза у S. alkalinus F11 длилась 4 дня с момента инокуляции; на 5–18 сутки наблюдался наиболее активный рост мицелия, после чего кривая роста сухой массы мицелия начинала выходить на плато. В начале роста на жидкой среде сериновые пептидазы экспрессировались в незначительном количестве, наибольший уровень секреции пептидазы DPP4 осуществлялся на 14-е сутки культивирования при переходе из фазы экспоненциального роста в стационарную фазу. Далее удельная активность DPP4 в культуральной жидкости медленно снижалась.

DPP4 и РАР S. alkalinus F11 и S. magadiensis B39 проявляют наибольшую активность в области pH 8 (рис. 2, а, б). При pH 5 DPP4 теряет больше 90% активности, зато при pH 9 сохраняет 70% от максимальной активности, а при рН 10–40%. Обнаруженный слабощелочной оптимум действия DPP4 согласуется с данными, полученными на гомологичных белках других грибов (Doumas et al., 1998; Cooper, Woods, 2009). Активность РАР менее устойчива к изменениям рН: так, при рН 6.0 сохраняется 23% максимальной активности, а при рН 9.0 – до 40%. При рН 5.0 активность РАР практически не определяется (рис. 2, б). Полученные значения ставят гомологи PAP S. alkalinus F11 в один ряд с известными PAP Aspergillus niger и Talaromyces emersonii, оптимальным условием работы которых является область pH 7.0–7.5 (Basten, Moyers, 2005; Mahon et al., 2009).

Рис. 2.

Зависимость активностей DPP4 (а), РАР (б) и РGC (в) у штаммов Sodiomyces аlkalinus F11 и S. magadiensis B39 от pH.

Постглутаминрасщепляющая (РGC, рostglutamine-cleaving) активность также достигает наибольшей величины при pH 8 (рис. 2, в). В отличие от DPP4 и PAP, эта активность сохраняет способность к гидролизу субстрата в сильнощелочных условиях, сохраняя при pH 11 до 45% активности, небольшая активность детектируется также при pH 4. Оптимум pH исследованной PGC близок к таковому у Fusarium equisetii (Juntunen et al., 2015).

рН стабильность исследуемых пептидаз заметно шире их рН оптимума. DPP4 сохраняют относительно высокую стабильность в сильнощелочных условиях и в кислых условиях до рН 4.0. Значительная инактивации DPP4 происходит в области pH 3 (свыше 90%) (рис. 3, а). Ферменты Sodiomyces magadiensis B39 и S. alkalinus F11 при инкубации при pH 12 сохраняли до 85% от максимальной активности и до 30% активности после часового воздействия при pH 13.

Рис. 3.

pH-стабильность DPP4 (а), РАР (б) и РGC (в) Sodiomyces аlkalinus F11 и S. magadiensis B39.

PAP изученных штаммов подвержены большей инактивации в области pH 4–6 по сравнению с DPP4. Однако они также устойчивы, как и DPP4, при инкубации в среде с pH 13 (рис. 3, б). Подобные закономерности наблюдаются и в случае РGC пептидаз. В то же время эти пептидазы являются наиболее кислотоустойчивыми из изученных ферментов, практически сохраняют исходную активность в диапазоне pH 5–12 и около 60% при инкубации при pH 4 и около 20% – при pH 3 (рис. 3, в). Таким образом, секретируемые специфические пептидазы изученных штаммов содариомицетов несколько различаются между собой, но демонстрируют сходные профили оптимумов рН и pH-устойчивости.

Определение эффективности подавления активности изучаемых ферментов различными специфическими ингибиторами показало, что наибольшее ингибирующее влияние на DPP4 оказывают PMSF, специфический ингибитор сериновых пептидаз, а также вилдаглиптин и дипротин А, широко используемые для ингибирования DPP4. В присутствии 5 мкл 1мМ вилдаглиптина и дипротина А активность DPP4 снижалась до активности 3–7% от контроля. Пептидаза умеренно ингибировалась дипротином B (активность составляла 50% от исходной); слабое ингибирующее действие на DPP4 также оказывал ситаглиптин (остаточная активность 90%). Йодоацетамид, ЭДТА, AP-MF, AP-NMP и AP-Pip практически не влияли на активность DPP4 (остаточная активность – 98–100%).

Анализ влияния специфических ингибиторов на активность PAP показал, что наиболее эффективно данный фермент ингибировался PMSF (остаточная активность 10%); конкурентные ингибиторы PSP (AP-MF, AP-NMP и AP-Pip) также вызывали некоторое снижение активности РАР (остаточная активность – 85–97%), тогда как йодоацетамид и ЭДТА не ингибировали активность PAP. На постглутаминрасщепляющую активность, измеряемую по специфическому субстрату Glp-FQ-pNA, наибольшее влияние оказывал необратимый ингибитор сериновых пептидаз PMSF, под действием которого активность снижалась до 8% от контроля. Конкурентные ингибиторы ПСП, а также ингибиторы несериновых пептидаз не оказывали на постглутамин-расщепляющую активность существенного влияния (максимальное снижение – 2–5% активности).

Найденные ферменты были способны гидролизовать, как пептиды Abz (п-аминобензойная кислота)-QPQQPFPQ-EDDnp и Abz-LPYPQPQLPQ-EDDnp, моделирующие иммуногенные пептиды гладинов (табл. 1), так и сами трудно гидролизуемые глиадиновые белки (рис. 4). Наибольшая активность обнаружена у ферментов S. magadiensis B39. При добавлении к реакционной смеси 20 мкл 1 мМ PMSF глиадин-расщепляющая активность изученных штаммов существенно снижалась (на 70–75%).

Рис. 4.

Глиадинрасщепляющая активность штаммов Sodiomyces аlkalinus F11 и S. magadiensis B39.

На долю секретируемых сериновых пептидаз у штаммов S. alkalinus F11 и S. magadiensis B39 приходится, по меньшей мере, до 2/3 общей глиадингидролизующей активности. За оставшуюся часть активности, участвующей в гидролизе белков, обогащенных глутамином и пролином, по-видимому, ответственны пептидазы других классов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известен ограниченный спектр микробных препаратов с глютенрасщепляющей активностью. Так, для полного гидролиза иммуногенного 33-мерного пептида глиадина требуется набор пептидаз молочнокислых бактерий Lactobacillus sanfranciscensis, L. alimentarius, L. brevis, L. hilgardii (De Angelis et al. 2010). Для детоксикации глютена в пищевых продуктах используется ферментный препарат на основе аспергилопепсина Aspergillus niger и DPP 4 из A. oryzae (Ehren et al. 2009).

В проведенной работе впервые показано, что у Sodiomyces alkalinus F11 и S. magadiensis B39, наряду со специфическими пролинрасщепляющими активностями, присутствует постглутаминрасщепляющая активность, что позволяет им эффективно гидролизовать как богатые пролином/глутамином пептиды глютена, так и сам глютен. Эти ферменты относятся к группе сериновых пептидаз и являются стабильными ферментами в умеренно кислых и щелочных условиях. Наличие такого рода активности у исследованных штаммов, возможно, позволит расширить применение пептидаз грибов для производства безглютеновых продуктов и разработки диеты для пациентов с непереносимостью глютена.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 19-04-00852_а.