Микология и фитопатология, 2022, T. 56, № 1, стр. 45-51

ВВЕДЕНИЕ

Во многих странах мира в связи с загрязнением окружающей среды, развитием технологий рециклинга, а также трендом общественного сознания в сторону осознанного и ответственного потребления природных ресурсов промышленное грибоводство выделилось в самостоятельную высокопроизводительную отрасль. На сегодняшний день известно около 100 видов грибов, плодоносящих в искусственных условиях, около 60 из них коммерциализированы, но только более 10 видов выращиваются в промышленных масштабах во многих странах (Chang, Wasser, 2017). Hericium erinaceus (Bull.) Pers. относится к видам, твердофазное культивирование которых в настоящее время только разрабатывается. Актуальность работ связана с высокой пищевой и лекарственной ценностью этого вида (Atila et al., 2018; Park et al., 2020).

Известно, что на продуктивность культивируемых грибов оказывают влияние бактерии, названные по аналогии с PGPR-бактериями растений, MGP (mushroom growth promoting) (Carrasco, Preston, 2020). Так, бактериальный компонент субстрата играет значительную роль в росте мицелия и плодоношении двух самых выращиваемых во всем мире грибов – шампиньона (Agaricus bisporus) (Cao et al., 2019) и вешенки (Pleurotus ostreatus) (Cho et al., 2003). Микробиомы, связанные с мицелием и базидиомами культивируемых базидиомицетов описаны слабо, однако по молекулярно-генетическим данным, наиболее распространенными в базидиомах Agaricus bisporus являются представители филумов Proteobacteria, Bacterioidetes, Actinobacteria и Firmicutes (Carrasco et al., 2019), тогда как в базидиомах Pleurotus eryngii доминировали Actinobacteria и Firmicutes (62.5%) (Lee et al., 2015).

Поиск и изоляция штаммов потенциальных MGP-бактерий, как правило, осуществляется в естественных местообитаниях грибов: в подстилке, почве, компостах, а также в эукариотных организмах, экологически связанных с грибами (Carrasco, Preston, 2020). В настоящей работе бактерии выделяли из спорокарпов грибоподобных протистов – миксомицетов, которые подобно ксилотрофным грибам, обитают в лесных биоценозах на разлагающейся древесине, реализуя при этом отличные от грибов экологические стратегии. Характерной чертой миксомицетов является сложный жизненный цикл, включающий свободноживущий многоядерный плазмодий и неподвижный спорокарп (Novozhilov, 1993). Перемещаясь по гниющей древесине или плодовым телам базидиомицетов, плазмодий захватывает различные бактерии, используя их как источник питания. Однако некоторые из бактерий сохраняются в плазмодии и попадают в спорокарпы, где их роль пока слабо изучена.

Цель исследования – поиск, выделение и изучение свойств природных изолятов бактерий, способных оказывать влияние на рост и плодоношение гриба Hericium erinaceus при искусственном культивировании.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Из стерилизованных в течение 1 мин 75%-м этанолом спорокарпов миксомицетов Lycogala epidendrum, Trichia decipiens, Metatrichia vesparium и Hemitrichia serpula (рис. 1) на минеральном агаре с 1% метанола (Netrusov et al., 2005) изолировали 80 культур бактерий, среди которых по результатам проверки фиторегуляторной активности и способности к синтезу ИУК были отобраны 5 изолятов (Shirokikh et al., 2017). На основании анализа фрагмента гена 16S рРНК, штаммы были идентифицированы как Methylobacterium bullatum 56L и 55L, Pedobacter agri 85Td, Ewingella americana 66Mt и Arthrobacter humicola 30Ht. Нуклеотидные последовательности фрагмента гена 16S рРНК бактерий, ассоциированных с миксомицетами, депонированы в GenBank NCBI с присвоением культурам индивидуальных номеров доступа: MW579369, MK966935, MW579370, MK852339 и MW579368 соответственно.

Рис. 1.

Спорокарпы миксомицетов: a – Lycogala epidendrum, б – Trichia decipiens, в – Hemitrichia serpula, г – Metatrichia vesparium.

Изоляция в мицелиальную культуру Hericium erinaceus BP16 описана ранее (Shirokikh et al., 2020). Нуклеотидная последовательность фрагмента ITS1–5.8S–ITS2 H. erinaceus BP16 депонирована в NCBI под номером MK809367.

Влияние бактерий на культуру гриба in vitro оценивали методом агаровых блоков. В центр чашки c сусло-агаром (4° по Баллингу) помещали блок с культурой гриба в возрасте 15 суток, выращенной на сусло-агаре (Netrusov et al., 2005). Вокруг него на одинаковом расстоянии раскладывали по три блока, вырезанных из агара с культурой бактерий одного из пяти разных бактериальных излятов, выращенных на RHM (Rich High Medium) (Belimov, Dietz, 2000) в течение 2 суток. Инкубация – в течение 20 суток при 28°С в темноте, затем 5 суток – при естественном освещении и комнатной температуре (20 ± 2°С). По окончании инкубации оценивали влияние бактерий на рост мицелия гриба и формирование им зачатков плодовых тел.

Влияние бактерии и культуральной жидкости (КЖ) Arthrobacter humicola 30Ht на продукцию биомассы плодовых тел Hericium erinaceus BP16 изучали, культивируя гриб на лигноцеллюлозном композитном субстрате. Для этого дубовые опилки, зерно овса и солому смешивали в соотношении 1 : 3 : 6 (об. %), запаривали нагретой до 90°С водой, оставляли на 12 ч, после чего воду сливали и заполняли приготовленной смесью стеклянные культивационные емкости объемом 0.5 л. Заполненные субстратом на три четверти объема емкости стерилизовали автоклавированием при 1 атм. в течение 25 мин. Посевной материал H. erinaceus BP16 выращивали на сусло-агаре в чашках Петри в течение 15 суток. Затем из грибного газона пробочным сверлом (10 мм диам.) вырезали агаровые блоки с мицелием и инокулировали ими субстрат в емкостях, внося по 2 агаровых блока в каждую емкость.

Суспензию бактерий Arthrobacter humicola 30Ht выращивали на капустно-глюкозном бульоне в течение 3 суток. Для получения КЖ суспензию в течение 20 мин центрифугировали при 6000 об./мин, в надосадочной жидкости определяли, используя реактив Сальковского (Pausheva, 1988), концентрацию ИУК, которая составила 18 мкг/мл. По 1 мл бактериальной суспензии (титр 10⁷ КОЕ/мл) в первом эксперименте и КЖ A. humicola 30Ht во втором эксперименте наносили на агаровые блоки с мицелием гриба в разные сроки, в зависимости от варианта. Схема опыта: 1 – инокуляция/нанесение КЖ при закладке опыта, одновременно с внесением в субстрат грибных блоков, 2 – спустя 2 недели после закладки опыта и начала роста гриба, 3 – спустя 4 недели после закладки опыта и начала роста гриба. Контролем служили варианты без инокуляции грибных блоков бактерией или нанесения КЖ A. humicola 30Ht (рис. 2). В каждом варианте культуру гриба выращивали в 3 отдельных емкостях. По мере формирования грибом плодовых тел, начиная с четвертой недели культивирования, каждые 10–15 дней плодовые тела срезали, высушивали до постоянного веса при 60°С и гравиметрически определяли сухую массу.

Рис. 2.

Внешний вид плодовых тел при культивировании Hericium erinaceus BP16 на сусло-агаре (а); на смеси дубовых опилок, зерна овса и соломы (1 : 3 : 6 об. %) (б).

В таблицах приведены средние значения из трех биологических повторений и их стандартные отклонения. Подсчет средних значений и стандартных отклонений выполняли в программе Microsoft Excel. Обработку результатов методами непараметрической статистики осуществляли с помощью программы Pаst v.4.06. Значимость различий между вариантами оценивали с помощью критерия Фридмана, а для попарного сравнения вариантов использовали T-критерий Вилкоксона (уровень значимости р = 0.05).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате скрининга бактерий на микорегуляторную активность выявили штамм A. humicola 30Ht, способный стимулировать рост мицелия и примордиев Hericium erinaceus ВР16:

Штаммы Methylobacterium bullatum 56L и 55L также способствовали росту грибного мицелия, но степень их влияния была невелика по сравнению с артробактером, примордии в течение срока наблюдений не образовывались. Культуры Pedobacter agri 85Td и Ewingella americana 66Mt, напротив, оказали на гриб угнетающее действие. Ранее сообщалось об обнаружении бактерий рода Pedobacter в ассоциации с Tricholoma matsutake, однако экологическая роль этих бактерий не совсем ясна (Li et al., 2016). По мнению некоторых исследователей, бактерии рода Pedobacter способны к расщеплению целлюлозы и гемицеллюлозы, что позволяет им формировать синтрофные ассоциации с некоторыми ксилотрофными грибами (López-Mondéjar et al., 2016). По-видимому, Hericium erinaceus к числу таких грибов не относится, т.к. вокруг агаровых блоков с бактерией Pedobacter agri 85Td, в отличие от блоков с бактерией Arthrobacter humicola 30Ht, наблюдали зоны отсутствия роста гриба, что указывает на антагонистический характер их взаимодействия (рис. 3).

Рис. 3.

Влияние выделенных из спорокарпов миксомицетов бактерий Pedobacter agri 85Td (1) и Arthrobacter humicola 30Ht (2) на рост гриба Hericium erinaceus BP16 in vitro: а, б и в – 7-е, 14-е и 25-е сутки роста соответственно.

Вид Ewingella americana известен как условный патоген человека, способный вызывать случаи с тяжелыми клиническими проявлениями у пациентов, которые страдают от тяжелых сопутствующих заболеваний или получают иммуносупрессивную терапию (Esposito et al., 2019). Вместе с тем, E. americana вызывает “болезнь коричневых пятен” у шампиньонов, массовые поражения плодовых тел Flammulina velutipes (Madbouly et al., 2014; Liu et al., 2018). Кроме того, вид Ewingella americana отмечен как преобладающий (более 73% среди всех выделенных представителей семейства Enterobacteriаceae) в плодовых телах грибов Lentinula edodes, Pleurotus ostreatus (Reyes et al., 2004). Недавние исследования показали, что бактерии родов Ewingella и Pedobacter входят в состав микробных сообществ, разрушающих мертвый мицелий базидиомицетов в лесных почвах (Brabcová et al., 2016).

Далее в инокуляционном эксперименте изучали влияние Arthrobacter humicola 30Ht на продукцию плодовых тел Hericium erinaceus BP16 в зависимости от времени нанесения бактериальной суспензии на блоки с культурой гриба, помещенные на поверхность лигноцеллюлозного композитного субстрата. Полученные данные обрабатывали методами непараметрической статистики. Для проведения сравнительного анализа вариантов (четырех независимых групп данных) использовали число наблюдений, равное шести (шесть волн плодоношения) (табл. 1). Сравнение проводили при помощи критерия Фридмана, который базируется на ранжировании значений исследуемого параметра (биомасса плодовых тел) и позволяет установить или опровергнуть однотипность статистических данных. Разброс сумм рангов в зависимости от варианта был достаточно велик – от 11 до 22. Расчетное значение критерия (Фр = 8.2) превысило табличное значение (Фр = 7.6; р = = 0.043), что позволяет считать различия между вариантами с разными сроками инокуляции статистически значимыми, с риском ошибки меньшей или равной 5%.

Для оценки направленности и выраженности выявленных в зависимости от срока инокуляции различий проводили попарное сравнение вариантов с помощью Т-критерия Вилкоксона. Выраженный эффект стимуляции плодовых тел проявился в варианте с наиболее поздним сроком нанесения бактерий Arthrobacter humicola 30Ht – спустя 4 недели от начала роста гриба (табл. 1). При этом суммарный сбор биомассы за шесть волн плодоношения повысился на 25% по сравнению с контролем. Для числа пар сравнений, равном 18 (6 моментов наблюдения × 3 повторения) табличный Т-критерий при 1%-м уровне значимости составляет 32, а при 5%-м – 47. Полученное значение (Т = 43) меньше табличного, следовательно, различия между рассматриваемыми вариантами статистически значимы при р = 0.05.

По литературным данным, польза для грибов от формирования мутуалистических ассоциаций с бактериями может заключаться в улучшении питания за счет деградации сложных полисахаридов в результате активизации лигноцеллюлозных ферментов (Vieira, Pecchia, 2018), а также в потреблении бактериями летучих органических соединений октенола и этилена, блокирующих плодоношение грибов (Kües et al., 2018). Возможно, одним из активных компонентов комплекса бактериальных метаболитов является ИУК, которая усиливает вегетативный рост грибов (Jemsi, Aryantha, 2017).

Инокуляция бактерией одновременно с внесением в субстрат блоков с грибным мицелием при закладке опыта, а также инокуляция, отсроченная на две недели от начала роста гриба, не оказали положительного влияния на процесс плодоношения. Суммарная биомасса плодовых тел составила в этих вариантах соответственно 88.7 и 83.4% от контрольного значения. Снижение биомассы собранных в этих вариантах плодовых тел оценивалось, согласно полученным значениям Т-критерия Вилкоксона, как статистически незначимое.

Таким образом, обработка суспензией бактериальных клеток A. humicola 30Ht оказала выраженный стимулирующий эффект на Hericium erinaceus ВР16 только при инокуляции на относительно поздней стадии развития гриба – в период формирования примордиев. Инокуляция в более ранние сроки способствовала увеличению продолжительности вегетативного роста гриба и, соответственно, препятствовала активизации генеративных процессов. Ранее возможность как положительного, так и отрицательного эффектов от инокуляции бактериальными культурами Pseudomonas putida и P. tolaasii, в зависимости от стадии развития гриба Agaricus bisporus, была отмечена в работе (Frey-Klett et al., 2011).

В отдельном эксперименте изучали влияние на продукцию плодовых тел Hericium erinaceus BP16 культуральной жидкости Arthrobacter humicola 30Ht. В первую волну плодоношения биомасса в вариантах с нанесением КЖ на блоки с грибным мицелием через две и четыре недели после начала роста гриба увеличилась соответственно на 70 и 61% по сравнению с контролем (табл. 2). В остальные сроки наблюдений различия между вариантами не были существенными. Суммарная за шесть волн плодоношения биомасса гриба практически не различалась по вариантам. Обработка полученных данных ранговым методом подтвердила отсутствие между вариантами с разными сроками нанесения КЖ статистически значимых различий. Сумма рангов по вариантам изменялась от 13 до 17, полученное значение критерия Фридмана (Фр = 1) оказалось ниже табличного значения (Фр = 7.6, р = 0.043). Результаты попарного сравнения опытных вариантов с контролем путем расчета значений Т-критерия Вилкоксона также указывали, что изменения массы плодовых тел гриба в результате обработки КЖ не являются статистически значимыми (p = 0.05).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, обработка Hericium erinaceus ВР16 суспензией бактериальных клеток Arthrobacter humicola 30Ht оказала стимулирующий эффект на поздних стадиях развития гриба, тогда как обработка культуральной жидкостью этой же бактерии способствовала формированию плодовых тел только в начале плодоношения, и этот эффект был непродолжительным. Можно предположить, что кратковременное стимулирующее действие было вызвано наличием в КЖ остаточных компонентов питательной среды, но вместе с тем, присутствие в экзометаболитах бактерий веществ, стимулирующих рост гриба, тоже вполне вероятно.

На основании полученных результатов штамм A. humicola 30Ht можно отнести к группе MGP-бактерий и рекомендовать к дальнейшему изучению в качестве потенциального инокулянта для повышения урожайности культивируемых съедобных грибов. Объект, из которого был выделен данный штамм – спорокарп миксогастриевого грибоподобного протиста Hemitrichia serpula, равно как и спорокарпы других исследованных миксомицетов, можно рассматривать как новый перспективный источник для выделения бактерий, как с антифунгальными свойствами, так и MGP, которые имеют реальные перспективы для использования в промышленных технологиях выращивания съедобных грибов, при условии тщательного подбора стадии развития гриба для инокуляции.

Работа выполнена в рамках государственного задания № 0767-2019-0090 “Изучить потенциал полифункционального действия мицелиальных микроорганизмов в региональных типах почв с целью создания новых препаратов для повышения адаптивности и экологической безопасности растениеводства и защиты окружающей среды от загрязнений”.