Микология и фитопатология, 2022, T. 56, № 6, стр. 441-447

ВВЕДЕНИЕ

Септориозы – опасные заболевания зерновых культур. Они характеризуются образованием некротических пятен на листьях, поражением колоса и самой зерновки. В годы эпифитотий, вызванных септориозами в разных регионах России, потери урожая могут превышать 40% (Sanin et al., 2012, 2015).

В качестве возбудителей выступают несколько видов грибов, относящихся к разным родам и семействам. Самый распространенный вид – Zymoseptoria tritici (Desm.) Quaedvl. et Crous (Myco-sphaerellaceae), возбудитель септориоза листьев пшеницы, тритикале, ячменя, ржи.

Вид Parastagonospora nodorum (Berk.) Quaedvl., Verkley et Crous паразитирует на листьях, стеблях, колосовых чешуях и остях пшеницы (Shah et al., 1995; Pakholkova, 2003; Bennett et al., 2007; Sanin et al., 2018; Zeleneva et al., 2021). Также он нередко поражает семена. Зерновка становится щуплой, неполноценной, снижается ее скорость прорастания. При сильном заражении происходит поражение и отмирание колеоптилей.

Еще один вид рода Parastagonospora представлен двумя формами в зависимости от специализации к хозяину: P. avenae (A.B. Frank) Quaedvl., Verkley et Crous f.sp. triticea (пшеничная форма) и P. avenae (A.B. Frank) Quaedvl., Verkley et Crous f. sp. avenaria (овсяная форма).

P. avenae f.sp. triticea, наряду с P. nodorum, является одним из наиболее вредоносных патогенов пшеницы во всем мире (McDonald et al., 2012).

На территории Краснодарского края пшеницу также поражает вид Septoria triticicola Lobik (Mokhova, 2008). Данный патоген встречается реже и его распространение, экологические особенности и вредоносность почти не изучены.

Грибы рода Parastagonospora известны своей способностью синтезировать некротрофные эффекторы (necrotrophic effectors – NEs), в том числе специфичные к хозяину токсины (host selective toxins – HSTs) преимущественно белковой природы. Эти эффекторы действуют как факторы вирулентности и вызывают некроз на листьях сортообразцов пшеницы, имеющих в своем геноме комплементарные гены восприимчивости (= чувствительности) (Friesen et al., 2007).

У вида P. nodorum идентифицировано восемь генов, кодирующих NEs, комплементарных девяти генам чувствительности пшеницы (Snn): SnToxA/Tsn1, SnTox1/Snn1, SnTox2/Snn2, SnTox3/Snn3-B1/Snn3-D1, SnTox4/Snn4, SnTox5/Snn5, SnTox6/Snn6 и SnTox7/Snn7 (Duba et al., 2018). В настоящий момент клонированы только три эффекторных гена P. nodorum: SnToxA, SnTox1 и SnTox3 (Hafez et al., 2020).

Ген SnToxA кодирует белок, идентичный белку, кодируемому геном PtrToxA, который первоначально был клонирован у Pyrenophora tritici-repentis (Ballance et al., 1996). Этот белковый токсин вызывает обширный некроз ассимиляционной ткани образцов пшениц, несущих ген восприимчивости Tsn1 (Faris et al., 2013). ToxA-гомологи были обнаружены и у других патогенных грибов растений, включая вид P. avenae (Lu et al., 2015; McDonald et al., 2018; Navathe et al., 2020).

SnTox1 был первым идентифицированным геном, кодирующим селективный токсин у Parastagonospora nodorum. Этот токсин вызывает некроз тканей у восприимчивых сортов пшеницы, несущих ген чувствительности Snn1 (Liu et al., 2004). Данный ген также характерен и для вида P. avenae (McDonald et al., 2013).

Токсин, кодируемый геном SnTox3 может взаимодействовать с продуктами двух гомологичных генов (Snn3-B1 и Snn3-D1) пшеницы, расположенными на хромосомах 5B и 5D соответственно (Zhang et al., 2011). В литературе отмечается, что взаимодействие продуктов генов SnTox3/Snn3-D1 может вызывать более тяжелый некроз растительной ткани (Zhang et al., 2011). Показано, что ген Snn3-D1 так же присутствует в геноме P. avenae (Hafez et al., 2020).

Представляло интерес изучить видовой состав возбудителей септориоза пшеницы в различных регионах России. А также оценить изоляты рода Parastagonospora из российских популяций на наличие/отсутствие у них генов SnTox1, SnTox3 и SnToxA с помощью связанных с ними молекулярных маркеров.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Всего в 2021 г. было собрано и проанализировано 120 инфекционных образцов озимой и яровой пшеницы с симптомами септориозов из 5 областей Европейской части России, из Краснодарского края и из Республик Дагестан и Калмыкии (табл. 1). Под инфекционным образцом понимали листья, стебли, колосья или перезимовавшие части растений с хорошо выраженными симптомами септориоза, собранные на обследуемом поле по его диагонали через равные расстояния в определенное время (например, во время учета). Растения очищали от почвы, просматривали под бинокулярной лупой, отбирали участки с обильным спороношением (пикнидами) и регистрировали в журнале. Собранный материал гербаризировали, складывали в пакеты, снабжали этикеткой с указанием места, даты сбора, фазы развития, сорта и сохраняли в холодильнике для последующего анализа в лабораторных условиях (Zeleneva et al., 2021). Количество инфицированных листьев и колосьев, собранных с поля, было не менее 30 при хорошо выраженных признаках болезни и не менее 50 при затрудненной идентификации.

Для определения видов грибов использовали микроскопический анализ фрагментов пораженной ткани. Видовую принадлежность определяли по форме и размеру спор, вышедших из пикнид в капле воды (Pyzhikova et al., 1989). Микроскопическая идентификация видов септориоза была подтверждена методом секвенирования с использованием оборудования ЦКП “Геномные технологии, протеомика и клеточная биология” ФГБНУ ВНИИСХМ.

После идентификации видов септориоза проводили выделение моноконидиальных изолятов в чистую культуру на агаризованную среду картофельно-глюкозного состава (КГА) (Pyzhikova et al., 1989).

Моноспоровые изоляты гриба выделяли методом “штрихов”. Осматривая гербарный материал, вырезали кусочки ткани с типичными поражениями. Отобранные кусочки промывали водопроводной водой, затем многократно в стерильной воде и подсушивали фильтровальной бумагой. Поверхностно стерилизовали путем погружения в 50%-й этанол на 20 с, после чего промывали в стерильной воде. С помощью микроскопа или лупы на пораженной ткани находили участок с пикнидами, препаровальной иглой извлекали одну пикниду, помещали на предметное стекло в каплю стерильной воды и через некоторое время, после того как из нее выделялись споры, полученную споровую суспензию с помощью бактериологической петли высевали штрихом на питательную среду. Через 7–8 сут единичные колонии, произошедшие из одной конидии, пересевали в отдельные чашки Петри и помещали в термостат при 20–24°C (Pyzhikova et al., 1989).

Геномная ДНК грибов Parastagonospora spp. была выделена из чистой культуры моноконидиальных изолятов стандартным методом СТАВ/хлороформ (Doyle, Doyle, 1990). Изоляты выращивали в чашках Петри на КГА в течение 7–10 cут в термостате при 21–22°C.

Амплификацию геномной ДНК проводили в 25 мкл реакционной смеси (67 мМ Трис-HCl рН 8.8; 3 мМ MgCl₂; по 200 мкМ каждого dNTP; 10 рМ/мл праймера; 25 (от 2 до 50) нг геномной ДНК и 0.5 ед. Taq-полимеразы). ПЦР проводили с использованием праймеров, представленных в табл. 2.

Амплифицированные фрагменты разделяли методом электрофореза в 2%-м агарозном геле, в 1× ТВЕ буфере (pH 8.2), гель окрашивали бромистым этидием. Для оценки размера фрагментов использовали ДНК маркер Step50 plus (Биолабмикс).

Скрининг изолятов на присутствие генов SnTox1 и SnTox3 проводили по методике Gao et al. (2015) с использованием ПЦР с парами праймеров SnTox1-cF/SnTox1-cR и SnTox3-cF/SnTox3-cR соответственно. Условия ПЦР: 94°С в течение 4 мин, затем 30 циклов: 94°С в течение 30 с, 60°С – 30 с, 72°С – 3 мин, последний этап элонгации – 10 мин при 72°С.

Ген SnToxA детектировали с помощью ПЦР с использованием праймеров TA51F и TA52R (Andrie et al., 2007). Условия ПЦР: 94°С в течение 3 мин, затем 30 циклов: 94°С в течение 30 с, 58°С – 30 с, 72°С – 30 с; последний этап элонгации – 7 мин при 72°С.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На изученных сортообразцах пшеницы доминировал вид Zymoseptoria tritici. Данный вид образует некротические пятна с пикнидами на озимой пшенице с фазы всходов (26–29 по шкале Цадокс). В дальнейшем идет распространение гриба на верхние листья озимых сортов пшеницы и на всходы яровых. Встречаемость вида Z. tritici на озимой пшенице достигала 100% в Республиках Дагестан, Калмыкия; на сортах яровой пшеницы – из Республики Дагестан и Липецкой обл. (табл. 3).

По нашим наблюдениям, виды Parastagonospora nodorum и P. avenae f.sp. triticea образуют некротические пятна с пикнидами на листьях, побегах, колосе, как правило, начиная с фазы колошения (51 по шкале Цадокс). На изученных образцах данные виды встречались значительно реже, чем вид Zymoseptoria tritici. Так, вид Parastagonospora nodorum не был отмечен на озимых сортообразцах из Республик Дагестан и Калмыкии; на яровых – из Республики Дагестан, Липецкой и Тамбовской областей. Вид P. avenae f.sp. triticea не зарегистрирован на инфекционном материале озимых сортов из Краснодарского края, Республик Дагестан и Калмыкии, Липецкой и Саратовской областей. Среди яровых он не отмечен среди образцов из Республики Дагестан, Липецкой и Саратовской областей.

В среднем, вид P. nodorum имел второе место в патогенном комплексе септориозных пятнистостей пшеницы, уступая виду Zymoseptoria tritici (табл. 3).

Проведено выделение возбудителей септориоза в чистую культуру на КГА. В результате с 67 зарегистрированных сортообразцов пшеницы с признаками септориозной инфекции выделены моноконидиальные изоляты видов грибов (табл. 4). Изучение морфолого-культуральных свойств подтвердило видовую идентификацию фитопатогенов. С каждого пораженного сортообразца было получено не менее 30 моноконидиальных изолятов гриба. Изоляты видов Parastagonospora nodorum и P. avenae f.sp. triticea изучены на присутствие генов SnToxА, SnTox1 и SnTox3.

В результате молекулярного скрининга у изучаемого материала (267 ДНК-проб, полученных от 145 моноконидиальных изолятов вида P. nodorum и 122 – P. avenae) выявлены как единичные гены, кодирующие NEs, так и их сочетания в одном генотипе (рис. 1, 2, табл. 5).

Рис. 1.

Продукты амплификации с праймерами SnTox1-cF/SnTox1-cR, специфичными для гена SnTox 1 (номера изолятов слева: 2–21-P.n.–1; 2–21-P.n.–2; 2–21–P.n.–3; 32–21–P.n.; 108–21–P.n.; 67–21–P.av.t.; 74–21–P.av.t.; 77–21–P.av.t.; 78–21–P.av.t.; 84–21–P.av.t.; 101–21–P.av.t.). Последняя дорожка – негативный контроль без ДНК.

Рис. 2.

Продукты амплификации с праймерами TA51 F/TA52 R, специфичными для гена SnToxА (номера изолятов слева: 2–21–P.n.–1; 2–21–P.n.–2; 2–21–P.n.–3; 29–21–P.n.; 82–21–P.av.t). Продукты амплификации ПЦР с праймерами SnTox3-cF/SnTox3-cR, специфичными для гена SnTox3 (номера изолятов: 26–21–P.n.; 29–21–P.n.; 32–21–P.n.; 108–21–P.n.; 126–21–P.n.; 155–21–P.n. 82–21–P.av.t.).

Ген SnTox1 был выявлен среди изолятов, полученных с 11 сортов пшеницы. Наличие гена отмечено у изолятов P. nodorum с сортообразцов озимой пшеницы (трех – из Ленинградской обл., одного – из Саратовской обл., одного – из Тамбовской обл.). Наличие гена SnTox1 отмечено у моноконидиальных изолятов P. avenae f.sp. triticea, выделенных с инфекционного материала озимой мягкой, яровой мягкой и твердой пшеницы (пяти сортообразцов из Тамбовской, одного – из Воронежской областей) (рис. 1, табл. 5).

В результате молекулярного скрининга ген SnToxА выявлен среди моноконидиальных изолятов вида P. nodorum, полученных из листьев сорта озимой мягкой пшеницы Скипетр из Ленинградской области и изолятов вида P. avenae f.sp. triticea из листьев сорта яровой мягкой пшеницы Воронежская 20 из Тамбовской обл. (рис. 2, табл. 5).

Наличие гена SnTox3 выявлено среди изолятов вида P. nodorum, полученных из растительных образцов озимой мягкой пшеницы: двух – из Ленинградской и Тамбовской областей, одного – из Саратовской обл. и одного – из образцов яровой пшеницы, собранной в Краснодарском крае. Присутствие гена SnTox3 отмечено у изолятов, полученных с озимой мягкой пшеницы сорта Проза из Тамбовской обл. (рис. 2, табл. 5).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, с использованием молекулярных маркеров проведена идентификация генов, кодирующих NEs у двух видов Parastagonospora spp. различного географического происхождения. На основании изучения видового состава септориозного комплекса в 2021 г. показано, что в условиях года вид Zymoseptoria tritici имел наибольшую встречаемость в Тамбовской, Ленинградской, Саратовской, Липецкой, Воронежской областях, в Республиках Дагестан и Калмыкия, а также в Краснодарском крае. Виды Parastagonospora nodorum и P. avenae f.sp. triticea фиксировались, но имели меньшую частоту. Эту информацию необходимо учитывать при составлении селекционных программ и защитных мероприятий сельскохозяйственных растений.

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда, проект № 19-76-30005.