1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Молекулярная биология
  4. T. 53, № 3, 2019

Молекулярная биология, 2019, T. 53, № 3, стр. 388-392

Новый генетический маркер предрасположенности человека к тяжелым формам клещевого энцефалита

А. В. Бархаш a, *, И. В. Козлова b, Л. Л. Позднякова c, Н. С. Юдин a, М. И. Воевода a, А. Г. Ромащенко a

a Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук
630090 Новосибирск, Россия

b Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека
664003 Иркутск, Россия

c Городская инфекционная клиническая больница № 1
630099 Новосибирск, Россия

* E-mail: barkhash@bionet.nsc.ru

Поступила в редакцию 03.10.2018
После доработки 12.11.2018
Принята к публикации 14.11.2018

Полный текст (PDF)

Аннотация

Возбудитель клещевого энцефалита – нейротропный РНК-содержащий вирус из рода Flavivirus – может вызывать как тяжелые паралитические формы заболевания (менингоэнцефалитическая и др.), так и более легкие непаралитические (лихорадочная и менингеальная). Реакция организма на вирусную инфекцию (и, как следствие, характер течения и исход заболевания) в значительной степени зависит от индивидуальных особенностей защитных систем организма человека, предопределяемых структурой его генома. Генетическая предрасположенность человека к клещевому энцефалиту сравнительно мало изучена. В настоящей работе представлены результаты поиска новых генов, предопределяющих особенности течения и исход клещевого энцефалита у человека. Цель работы состояла в верификации существования связи между тремя выявленными ранее с помощью секвенирования экзомов на ограниченной выборке больных тяжелыми формами клещевого энцефалита SNP: rs3109675 (C/T) в интроне гена COL5A1, rs41554313 (A/G) в интроне гена POLRMT и межгенного rs10006630 (C/A), и предрасположенностью к клещевому энцефалиту в популяции русских (с использованием расширенной выборки больных с различными формами клещевого энцефалита). Подтверждена ассоциация SNP rs10006630, локализованного на хромосоме 4 между генами FABP2 и LINC01061, с предрасположенностью к клещевому энцефалиту. Этот SNP можно рассматривать как новый генетический маркер предрасположенности человека к тяжелым формам клещевого энцефалита. Возможная регуляторная роль этого SNP в функционировании близлежащих генов и механизм его влияния на формирование предрасположенности к тяжелым формам клещевого энцефалита требуют дальнейшего изучения.

Ключевые слова: клещевой энцефалит, генетическая предрасположенность, однонуклеотидный полиморфизм

ВВЕДЕНИЕ

Клещевой энцефалит (КЭ) вызывается РНК-содержащим вирусом из рода Flavivirus, распространенным на территории России и в ряде европейских и азиатских стран. Ежегодно регистрируется до 14 000 случаев заболевания КЭ, в том числе от 2000 до 11 000 в России. Несмотря на то, что вирус КЭ является нейротропным и может вызывать тяжелые паралитические (очаговые) формы заболевания с поражением центральной нервной системы (ЦНС) (менингоэнцефалитическая и др.), значительно чаще встречаются непаралитические формы КЭ (лихорадочная и менингеальная), примерно в 70–95% случаев заболевание протекает бессимптомно [1‒3]. Известно, что реакция организма на воздействие вируса (и, как следствие, особенности течения и исход заболевания) в значительной степени зависит от индивидуальных особенностей генома человека, предопределяющих способность его иммунной системы подавлять развитие вирусной инфекции [4, 5].

Генетическая предрасположенность человека к КЭ еще сравнительно мало изучена [6]. Используя анализ генов-кандидатов, мы впервые показали, что однонуклеотидные полиморфизмы (single nucleotide polymorphisms, SNP) в генах OAS2, OAS3, CD209, TLR3, IL28B и IL10, кодирующих ключевые компоненты неспецифического иммунного ответа, ассоциированы с предрасположенностью к КЭ у русских жителей Новосибирска [7‒10]. Кроме того, методом полноэкзомного секвенирования с последующим подтверждением полученных данных ассоциативным анализом на выборках большего размера мы показали, что SNP генов MMP9, ABCB9 и COL22A1 также являются вероятными генетическими маркерами предрасположенности к КЭ в популяции русских [11, 12]. В настоящей работе представлены результаты поиска новых генов, предопределяющих особенности течения и исход КЭ у человека. Целью данной работы была верификация (на расширенной выборке больных с различными формами КЭ) существования связи между тремя SNP: rs3109675 (C/T) в интроне гена COL5A1, rs41554313 (A/G) в интроне гена POLRMT и межгенного rs10006630 (C/A), выявленными с помощью секвенирования экзомов на ограниченной выборке больных тяжелыми формами КЭ [12], и предрасположенностью к КЭ у русских.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Пациенты. В работе использовали 169 образцов ДНК, выделенных из крови неродственных русских больных КЭ, проходивших лечение в стационарах Новосибирска в 2002–2017 гг. (n = 139) и Иркутска в 2014–2017 гг. (n = 30). Все пациенты имели диагноз КЭ, подтвержденный согласно общепринятым критериям (клиническая картина, анализ спинномозговой жидкости, серологическая диагностика, сезонность, факт укуса клещом) [1]. Проведение исследования одобрено Комиссией по биоэтике Института цитологии и генетики СО РАН. Все пациенты дали письменное информированное согласие на участие в обследовании. В исследование были включены только пациенты, которые не подвергались иммунизации до начала заболевания (профилактической вакцинации и/или введению специфического иммуноглобулина после укуса клеща). Общая группа больных была разделена на подгруппы в соответствии с клиническими формами КЭ: 1) тяжелые формы с поражением ЦНС (менингоэнцефалитическая, полиомиелитическая, полиоэнцефаломиелитическая) (n = 61); 2) более легкие формы без поражения ЦНС (n = 108) – лихорадочная (n = 47) и менингеальная (n = 61).

Контроль. Образцы ДНК контрольной группы были собраны в Новосибирске и Иркутске. Контрольная группа Новосибирска (n = 115), которая включала русских, отобранных случайным образом из избирательных списков одного из районов, была собрана в 1993–1994 гг. в рамках программы ВОЗ “MONICA” (MONItoring trends and determinants in CArdiovascular disease). Контрольная группа Иркутска включала 100 случайно отобранных русских доноров крови. Информация о реакции лиц, включенных в контрольную группу, на заражение вирусом КЭ отсутствовала.

Генотипирование. Генотипирование SNP rs3109675 гена COL5A1, rs41554313 гена POLRMT и межгенного SNP rs10006630 проводили методом ПЦР с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. Для генотипирования по каждому из SNP были подобраны пары праймеров, при этом в одном из праймеров была произведена замена нуклеотида согласно [13] для введения нового сайта рестрикции в ПЦР-продукт. Основные параметры генотипирования по изученным SNP приведены в табл. 1. Размеры продуктов ПЦР и рестрикционных фрагментов определяли с помощью электрофореза в 5–6%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) и окрашивания раствором бромистого этидия.

Таблица 1.  

Параметры генотипирования однонуклеотидных полиморфизмов (SNP)

Ген, SNP Праймер, нуклеотидная последовательность Tm, °C ПЦР-продукт, п.н. Эндону-клеаза рестри-кции Длина рестрикционных фрагментов, п.н.
COL5A1
rs3109675 		5′-GAGCCCCCATGATGCCGC-3′a
5′-CAGCTCCCCGTCGGAGATCG-3′ 		60 125 HspAI C/C: 108, 17
C/T: 125, 108, 17
T/T: 125
POLRMT rs41554313 5′-ACTGCTGGCACTGACTTTACCCGC-3′
5′-GCCCTCCCAGGACCCCGG-3′a		 62 117 SmaI G/G: 101, 16
G/A: 117, 101, 16
A/A: 117
rs10006630 5′-GGTATGAAATAGTTTAGTTATGCG-3′ a
5′-AATTTGGAACAAAGCAAGAAC-3′ 		55 146 HspAI C/C: 123, 23
C/A: 146, 123, 23
A/A: 146

Tm – температура отжига праймеров. a Нуклеотиды, выделенные жирным шрифтом, заменены в структуре праймера для образования нового сайта узнавания эндонуклеазой рестрикции [13].

Статистические методы. Соответствие частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга оценивали с использованием критерия χ2 и компьютерной программы CHIHW [14]. Сравнение частот генотипов и аллелей в изученных группах проводили по критерию χ2 с помощью программы SPSS (версия 11.0). Различия между группами считали статистически значимыми при уровне значимости P < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Три SNP, включая rs3109675 гена COL5A1, rs41554313 гена POLRMT и межгенный rs10006630, были выбраны нами в качестве потенциальных новых генетических маркеров предрасположенности человека к тяжелым формам КЭ по результатам полноэкзомного секвенирования [12]. Перечисленные полиморфизмы относятся к тем 16 SNP, частоты генотипов и/или аллелей которых различаются в группах больных тяжелыми формами КЭ и в контрольной группе [12].

Частоты генотипов и аллелей у больных КЭ, включая подгруппы с тяжелыми формами с поражением ЦНС и более легкими формами (лихорадочная и менингеальная), а также в контрольной группе, представлены в табл. 2. Распределение частот генотипов в контрольной популяционной группе по каждому из изученных SNPs соответствовало равновесию Харди–Вайнберга. Не найдено статистически значимых отличий в частотах генотипов и аллелей SNP rs3109675 гена COL5A1 и rs41554313 гена POLRMT в общей группе больных КЭ и в контрольной группе, а также между подгруппами больных тяжелыми и более легкими формами КЭ и/или контролем. Обнаружено статистически значимое повышение частоты генотипа C/C по SNP rs10006630 у больных тяжелыми формами КЭ (19.0%) по сравнению с контрольной группой (8.0%) (P = 0.016) и больными с более легкой менингеальной формой КЭ (5.0%) (P = 0.02).

Таблица 2.  

Частоты генотипов и аллелей по изученным SNP у больных различными формами клещевого энцефалита и в контрольной популяционной группе

Ген, SNP, генотипы и аллели Частота генотипа/аллеля, % (количествоa) P
контроль Больные КЭ
всего формы без поражения ЦНС тяжелые формы с поражением ЦНС
всего ЛФ МФ
COL5A1, rs3109675
T/T 32.5 (70) 31.1 (51) 31.7 (33) 30.4 (14) 32.8 (19) 30.0 (18) >0.05
T/C 47.0 (101) 51.2 (84) 51.0 (53) 52.2 (24) 50.0 (29) 51.7 (31) >0.05
C/C 20.5 (44) 17.7 (29) 17.3 (18) 17.4 (8) 17.2 (10) 18.3 (11) >0.05
T 56.0 56.7 57.2 56.5 57.8 55.8 >0.05
C 44.0 43.3 42.8 43.5 42.2 44.2 >0.05
N 215 164 104 46 58 60  
χ2HW 0.47            
POLRMT, rs41554313
G/G 81.8 (171) 77.5 (131) 74.1 (80) 72.4 (34) 75.4 (46) 83.6 (51) >0.05
G/A 16.3 (34) 20.7 (35) 24.1 (26) 25.5 (12) 23.0 (14) 14.8 (9) >0.05
A/A 1.9 (4) 1.8 (3) 1.8 (2) 2.1 (1) 1.6 (1) 1.6 (1) >0.05
G 90.0 87.9 86.1 85.1 86.9 91.0 >0.05
A 10.0 12.1 13.9 14.9 13.1 9.0 >0.05
N 209 169 108 47 61 61  
χ2HW 2.09            
Межгенный, rs10006630
A/A 43.4 (92) 36.6 (60) 38.7 (41) 43.5 (20) 35.0 (21) 32.7 (19) >0.05
A/C 48.6 (103) 51.2 (84) 52.8 (56) 43.5 (20) 60.0 (36) 48.3 (28) >0.05
C/C 8.0 (17)b 12.2 (20) 8.5 (9) 13.0 (6) 5.0 (3)c 19.0 (11)b, c 0.016b, 0.02c
A 67.7 62.2 65.1 65.2 65.0 56.9 >0.05
C 32.3 37.8 34.9 34.8 35.0 43.1 >0.05
N 212 164 106 46 60 58  
χ2HW 2.6            

Примечание. КЭ – клещевой энцефалит; ЦНС – центральная нервная система; ЛФ – лихорадочная форма; МФ – менингеальная форма; N – размер выборки; P – уровень значимости при сравнении частот генотипов и аллелей в группах; χ2HW – значения теста χ2 на соответствие распределения частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга. a Количество человек с данным генотипом. b Уровень значимости при сравнении больных тяжелыми формами КЭ с поражением ЦНС и контрольной группой. c Уровень значимости при сравнении больных тяжелыми формами КЭ с поражением ЦНС и больных с МФ КЭ.

Ассоциация только одного из трех изученных нами SNP с предрасположенностью к тяжелым формам КЭ была подтверждена при верификации на расширенной выборке образцов больных КЭ. Согласно нашим данным, SNP генов COL5A1 (кодирует α-цепь коллагена типа 5 [15]) и POLRMT (кодирует митохондриальную РНК-полимеразу [16]), не связаны с изучаемым признаком. Принимая во внимание ранее полученные нами данные [11, 12], можно заключить, что полноэкзомное секвенирование ограниченной выборки образцов ДНК позволяет сократить набор искомых SNP, но требует обязательной дальнейшей верификации. SNP rs10006630 локализован на хромосоме 4 в промежутке между двумя известными генами – на расстоянии около 22 т.п.н. от сайта инициации транскрипции гена FABP2 (кодирует белок, связывающий жирные кислоты [17]) и на расстоянии около 61 т.п.н от гена LINC01061 (продукт которого относится к некодирующим РНК). Поскольку основы архитектоники кодирующих и регуляторных частей генов пока не до конца выяснены, на данный момент SNP rs10006630 можно рассматривать как новый генетический маркер предрасположенности человека к развитию тяжелых форм КЭ. Опубликованных сведений об этом SNP нами не найдено. Возможная регуляторная роль этого SNP в функционировании близлежащих генов FABP2 и LINC01061 и механизм его влияния на формирование предрасположенности к тяжелым формам КЭ требуют дальнейшего изучения.

Таким образом, в данной работе идентифицирован SNP (rs10006630), связанный с предрасположенностью к тяжелым формам КЭ в популяции русских. Для определения возможного механизма защитных реакций с участием этого межгенного SNP необходимы дальнейшие исследования.

Работа поддержана грантом Российского научного фонда (№ 16-15-00127).

Список литературы

  1. Gritsun T.S., Lashkevich V.A., Gould E.A. (2003) Tick-borne encephalitis. Antiviral Res. 57, 129–146.

  2. Ruzek D., Dobler G., Donoso Mantke O. (2010) Tick-borne encephalitis: pathogenesis and clinical implications. Travel. Med. Infect. Dis. 8, 223–232.

  3. Bogovic P., Strle F. (2015) Tick-borne encephalitis: a review of epidemiology, clinical characteristics, and management. World J. Clin. Cases. 3, 430–441.

  4. Chapman S.J., Hill A.V. (2012) Human genetic susceptibility to infectious disease. Nat. Rev. Genet. 13, 175–188.

  5. Loeb M. (2013) Host genomics in infectious diseases. Infect. Chemother. 45, 253–259.

  6. Юдин Н.С., Бархаш А.В., Максимов В.Н., Игнатьева Е.В., Ромащенко А.Г. (2018) Генетическая предрасположенность человека к заболеваниям, вызываемым вирусами семейства Flaviviridae. Молекуляр. биология. 52, 190–209.

  7. Barkhash A.V., Perelygin A.A., Babenko V.N., Myasnikova N.G., Pilipenko P.I., Romaschenko A.G., Voevoda M.I., Brinton M.A. (2010) Variability in the 2'-5'-oligoadenylate synthetase gene cluster is associated with human predisposition to tick-borne encephalitis virus-induced disease. J. Infect. Dis. 202, 1813–1818.

  8. Barkhash A.V., Perelygin A.A., Babenko V.N., Brinton M.A., Voevoda M.I. (2012) Single nucleotide polymorphism in the promoter region of the CD209 gene is associated with human predisposition to severe forms of tick-borne encephalitis. Antiviral Res. 93, 64–68.

  9. Barkhash A.V., Voevoda M.I., Romaschenko A.G. (2013) Association of single nucleotide polymorphism rs3775291 in the coding region of the TLR3 gene with predisposition to tick-borne encephalitis in a Russian population. Antiviral Res. 99, 136–138.

  10. Barkhash A.V., Babenko V.N., Voevoda M.I., Romaschenko A.G. (2016) Association of IL28B and IL10 gene polymorphism with predisposition to tick-borne encephalitis in a Russian population. Ticks Tick-Borne Dis. 7, 808–812.

  11. Barkhash A.V., Yurchenko A.A., Yudin N.S., Ignatieva E.V., Kozlova I.V., Borishchuk I.A., Pozdnyakova L.L., Voevoda M.I., Romaschenko A.G. (2018) A matrix metalloproteinase 9 (MMP9) gene single nucleotide polymorphism is associated with predisposition to tick-borne encephalitis virus-induced severe central nervous system disease. Ticks Tick-Borne Dis. 9, 763–767.

  12. Бархаш А.В., Юрченко А.А., Юдин Н.С., Козлова И.В., Борищук И.А., Смольникова М.В., Зайцева О.И., Позднякова Л.Л., Воевода М.И., Ромащенко А.Г. (2019) Связь полиморфизма генов ABCB9 и COL22A1 с предрасположенностью человека к тяжелым формам клещевого энцефалита. Генетика. 55, принята к печати.

  13. Neff M.M., Turk E., Kalishman M. (2002) Web-based primer design for single nucleotide polymorphism analysis. Trends Genet. 18, 613–615.

  14. Zaykin D.V., Pudovkin A.I. (1993) Two programs to estimate significance of χ2 values using pseudo-probability tests. J. Hered. 84, 152.

  15. Greenspan D.S., Byers M.G., Eddy R.L., Cheng W., Jani-Sait S., Shows T.B. (1992) Human collagen gene COL5A1 maps to the q34.2–q34.3 region of chromosome 9, near the locus for nail-patella syndrome. Genomics. 12, 836–837.

  16. Barshad G., Marom S., Cohen T., Mishmar D. (2018) Mitochondrial DNA transcription and its regulation: an evolutionary perspective. Trends Genet. 34, 682–692.

  17. Thumser A.E., Moore J.B., Plant N.J. (2014) Fatty acid binding proteins: tissue-specific functions in health and disease. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. 17, 124–129.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Молекулярная биология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал