Молекулярная биология, 2019, T. 53, № 6, стр. 1029-1037

ВВЕДЕНИЕ

26S протеасома – это АТР-зависимый мультисубъединичный протеазный комплекс, состоящий из 20S протеолитического субкомплекса, нековалентно соединенного с 19S регуляторным субкомплексом [1, 2]. 26S протеасома отвечает за деградацию большинства внутриклеточных белков, в том числе регуляторных, поврежденных и неправильно свернутых, контролируя тем самым все основные клеточные процессы и ответ на стресс. Двадцать лет назад в сотрудничестве с коллегами из Германии нами впервые была описана система координированной регуляции экспрессии протеасомных генов у пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae [3, 4]. Промоторные области большинства генов субъединиц протеасомы содержат элемент PACE (Proteasome Associated Control Element) (5'-GGTGGCAAA-3'), с которым связывается Rpn4. Фактор Rpn4 S. cerevisiae (ScRpn4) регулирует не только протеасомные гены, но и множество других, включая гены, кодирующие белки различных антистрессовых ответов [5].

В ходе биоинформатического анализа геномов различных организмов PACE-подобные элементы и гены, кодирующие Rpn4-подобные белки, выявлены только у дрожжей класса Saccharomycetes [6]. Нами показано, что Rpn4-подобные белки у таких дрожжей, как Candida glabrata, Yarrowia lipolytica, Komagataella pfaffii и Debaryomyces hansenii, несмотря на их низкое общее сходство, способны комплементировать делецию гена RPN4 у S. cerevisiae [7‒9], а также регулировать экспрессию протеасомных генов посредством PACE и подобных ему элементов [8]. Полученные результаты подтверждают родство обнаруженных Rpn4-подобных белков и открывают возможность проведения более широкого биоинформатического поиска PACE-подобных элементов и Rpn4-подобных белков в накопленных к настоящему моменту данных о секвенированных геномах различных дрожжей.

В настоящей работе выполнен биоинформатический поиск и охарактеризованы компоненты системы координированной регуляции экспрессии протеасомных генов более чем у 3000 штаммов, принадлежащих 427 видам дрожжей-сахаромицетов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Поиск последовательностей белков, похожих на субъединицы протеасомы и Rpn4 S. cerevisiae. Список последовательностей 34 субъединиц протеасом и фактора транскрипции Rpn4 S. cerevisiae получен из базы данных (http://www.yeastgenome.org/, по состоянию на 5.04.2019). Список видов Saccharomycetes с секвенированными геномами (427) получен с сайта www.ncbi.nlm.nih.gov/genome с помощью запроса “saccharomycetes[orgn]” (по состоянию на 13.04.19). Нуклеотидные последовательности геномов 3111 штаммов, принадлежащих этим видам дрожжей, получены из депозитория GenBank (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/genbank/fungi/) в формате аннотированных файлов, содержащих в названии “_genomic.gbff”. Следует отметить, что первое место в этом списке занимает вид S. cerevisiae (1005 штаммов), вторым по представленности является Candida albicans (93 штамма), замыкает тройку Komagataella pastoris (67 штаммов). Большинство других видов представлено в основном тремя‒пятью штаммами. С помощью скрипта, написанного на языке С, последовательности геномов были виртуально транслированы во всех шести рамках считывания. С помощью локально установленной программы BLAST (версия 2.9.0, ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/ blast+/LATEST/) в полученных виртуальных протеомах выполнен поиск последовательностей, наиболее близких (E-value < 10^–70) к последовательностям субъединиц протеасом и Rpn4.

Поиск Rpn4-подобных белков у видов, не входящих в род Saccharomyces. Поскольку последовательность фактора транскрипции Rpn4 в целом не консервативна, то поиск Rpn4-подобных белков у дрожжей, не принадлежащих к роду Saccharomyces, выполнен c помощью его наиболее консервативного ДНК-связывающего домена [6] (аминокислотные остатки 439‒531). Поиск осуществляли с помощью PSI-BLAST с параметрами по умолчанию в классе Saccharomycetes, исключив виды Saccharomyces. Полученные последовательности использовали в построении множественного выравнивания с помощью COBALT [10] с параметрами по умолчанию. Результат выравнивания визуализировали с помощью COBALT и Jalview2 [11]. Ключевым критерием включения белка в список Rpn4-подобных белков считали идентичность положения большинства распознающих аминокислотных остатков в обоих доменах “цинковых пальцев”.

Поиск сайтов PACE в промоторных областях генов, близких по последовательности к протеасомным генам и RPN4 S. cerevisiae. Из генома извлекали участки длиной 500 п.н., расположенные левее старт-кодона трансляции в генах, кодирующих сходные белки, отобранные на предыдущих этапах. Внутри этих участков проводили поиск PACE-подобных элементов по обеим цепям. Чтобы выявить ключевые основания PACЕ-подобных элементов, проанализировали результаты экспериментального исследования сродства Rpn4 к PACE-подобным последовательностям, мутированным вариантам PACE [4, 12‒14], а также профили консенсусов PACE-подобных элементов у изученных нами ранее штаммов дрожжей Y. lipolytica, K. phaffii, D. hansenii и C. glabrata [7‒9]. Инвариантными, характеризующими PACE-подобный элемент, приняты гуанин в четвертом положении и аденин в восьмом положении сайта. Поиск PACE-подобных сайтов выполняли с помощью скрипта, написанного на языке С.

Визуализация результатов поиска PACE-подобных сайтов. Профили консервативных нуклеотидов в обнаруженных PACE-подобных элементах строили с помощью WebLogo 3.6.0 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi) [15]. Тепловые карты нуклеотидных замен в PACE строили с помощью онлайн сервиса Heatmapper (http://www1.heatmapper.ca/) [16]. Входные данные для обработки в указанных сервисах готовили с помощью скриптов, написанных на языке программирования Python.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Распределение и структура PACE и подобных ему элементов в промоторных областях протеасомных генов и Rpn4

PACE – необходимый компонент системы координированной регуляции экспрессии протеасомных генов. Представляло интерес выяснить, существуют ли преимущественные позиции PACE в промоторных областях протеасомных генов дрожжей-сахаромицетов. На рис. 1 представлено распределение положения PACE относительно старт-кодона трансляции протеасомных генов. Показано, что PACE находится преимущественно между 100 и 120 п.н.

Рис. 1.

Распределение положения канонического PACE в промоторных областях протеасомных генов у Saccharomycetes.

Установлено также, что 96.05% всех обнаруженных сайтов локализуются в участке от 50 до 250 н. влево от старт-кодона. Этот диапазон выбран для анализа положения PACE-подобных сайтов с одним и двумя отличиями от канонического PACE. Согласно полученным результатам (рис. 2а), распределение вариантов PACE с одной заменой в целом повторяет распределение канонического PACE. Варианты сайта с двумя заменами, в любом положении (кроме 4-го и 8-го, см. Экспериментальную часть) и с заменами, которые не являются соседними, распределены более равномерно в пределах анализируемого диапазона, что указывает на присутствие среди таких сайтов большого количества случайных последовательностей. В дальнейшем мы использовали сайты, отличающиеся от PACE заменой только одного нуклеотида.

Рис. 2.

Положение и анализ PACE и подобных ему элементов в промоторных областях протеасомных генов и RPN4. а ‒ Положение PACE и подобных ему элементов в промоторных областях протеасомных генов. б ‒ Положение PACE и подобных ему элементов в промоторных областях генов RPN4. в ‒ Логотипы консервативности нуклеотидов PACE-подобных элементов. г ‒ Тепловые карты позиционных матриц однонуклеотидных замен в PACE-подобных элементах. Значения в ячейках совпадающих нуклеотидов обнулены. Присутствие гуанина в положении 4 и аденина в 8 принято характеристистическим для PACE и ему подобных элементов (см. “Экспериментальную часть”), поэтому замены в этих положениях запрещены. Левая карта соответствует логотипу PACE-подобных элементов S. cerevisiae, центральная – другим видам дрожжей и правая – логотипу элементов в промоторах RPN4-генов.

Отметим, что у многих видов дрожжей в промоторных областях протеасомных генов встречается не один, а два и даже три PACE и подобных ему элемента в пределах от 50 до 250 п.н. от старт-кодона трансляции.

Впервые обнаружено, что у 373 штаммов, принадлежащих 61 виду дрожжей, PACE и подобные ему элементы находятся в промоторных областях генов, кодирующих Rpn4-подобные белки (рис. 2б). Можно отметить бимодальное распределение канонического PACE и его вариантов с одной заменой. Основной пик приходится на участок 50‒70 п.н., а второй, как и у промоторов протеасомных генов – на участок 100‒120 п.н. На рис. 2в, г представлены результаты более детального анализа положения и вида однонуклеотидных замен в PACE. У штаммов S. cerevisiae встречаются практически только две замены G → A (G1A) в первом положении и А → G (A7G) в седьмом. Следовательно, консенсусная последовательность PACE-подобных элементов у S. cerevisiae ‒ 5'-RGTGGCRAA-3'. У других видов дрожжей ожидаемо наблюдается большее разнообразие замен. После замен G1A и A7G наиболее часто встречаются замены G2A, T3A, а также A9 на любую другую букву. Согласно экспериментальным данным, замена GC во втором тринуклеотиде GGC резко снижает сродство к нему Rpn4 S. cerevisiae [4]. У других видов дрожжей замены C и особенно G встречаются очень редко. Возможно, сайты с заменами в этих положениях нефункциональны, что требует экспериментальной проверки. Таким образом, консенсусную последовательность PACE-подобных элементов у других видов дрожжей (не S. cerevisiae) можно представить как 5'-RRWGGСRAN-3'. В сайтах в промоторах генов RPN4 замена G1A встречается редко, несколько чаще A7G и наиболее часто ‒ A9T. Следует отметить повышенное количество замен С в тринуклеотиде GGC, что может указывать на более низкое сродство этих сайтов к Rpn4, чем у сайтов в промоторах протеасомных генов. Таким образом, консенсусную последовательность PACE-подобных элементов в промоторах RPN4-генов можно определить как 5'-GRWGGCRAW-3'.

Второй важный компонент системы координированной регуляции протеасомных генов ‒ Rpn4. Ожидаемо, что у видов рода Saccharomyces эти белки в целом похожи (рис. 3а), очень высоким сходством обладает ДНК-связывающий домен, включая распознающие аминокислотные остатки в α-спиралях доменов цинковых пальцев.

Рис. 3.

Множественное выравнивание последовательностей Rpn4-подобных белков у дрожжей Saccharomyces. а ‒ Фрагмент схемы множественного выравнивания. Вверху указана шкала выравнивания (в аминокислотных остатках). Выравнивание выполнено с помощью программы COBALT [10] с параметрами по умолчанию. Более темным цветом указаны наиболее сходные участки. б ‒ Профиль консервативности ДНК-связывающего домена Rpn4-подобных белков, полученный с помощью программы Jalview2 [11]. Показано положение распознающих α-спиралей (α1 и α2) и аминокислотных остатков в этих спиралях, которые, как предполагают, контактируют с ДНК, в доменах N- и С-концевого цинковых пальцев соответственно.

Ожидаемо, что гораздо большее разнообразие последовательностей Rpn4-подобных белков и структуры их ДНК-связывающих доменов наблюдается у других видов Saccharomycetes (рис. 4 и 5). Всего выявлено 120 Rpn4-подобных белков, принадлежащих 80 видам дрожжей, не относящихся к роду Saccharomyces. Следует отметить в целом небольшое сходство Rpn4-подобных белков. Ранее мы показали, что общее сходство между CgRpn4 C. glabrata, DhRpn4 D. hansenii, KpRpn4 K. phaffii и YlRpn4 Y. lipolytica и ScRpn4 S. cerevisiae составляет 48.1 [9], 37.2 [8], 36.8 и 36.3% [7] соответственно. Представленные схемы выравниваний (рис. 4а, б) дают наглядное представление о небольшом сходстве анализируемых последовательностей. Наиболее консервативна лишь область ДНК-связывающего домена, что согласуется с высокой консервативностью PACE-элементов (рис. 2в).

Рис. 4.

Схемы множественных выравниваний последовательностей Rpn4-подобных белков. Сверху указана длина выравнивания (в аминокислотных остатках). Выравнивания выполнены с помощью программы COBALT [10] с параметрами по умолчанию. а ‒ Фрагмент схемы множественного выравнивания белков первой группы. б ‒ Фрагмент схемы выравнивания второй группы. в ‒ Схема множественного выравнивания белков третьей группы. г ‒ Схема множественного выравнивания белков четвертой группы.

Рис. 5.

Профили выравнивания ДНК-связывающих доменов Rpn4-подобных белков. Выравнивания, выполненные с помощью программы COBALT [10], визуализированы с помощью программы Jalview2 [11]. Показано положение распознающих α1- и α2-спиралей N- и С-концевых доменов цинковых пальцев и аминокислотных остатков в этих спиралях, которые, как предполагается, контактируют с ДНК. 1, 2, 3 и 4 – обозначение групп Rpn4-подобных белков.

На основании особенностей структуры ДНК-связывающего домена выделены четыре группы Rpn4-подобных белков (рис. 5). ДНК-связывающий домен белков первой группы, состоящей из 89 членов, в основных чертах такой же, как у детально описанного Rpn4 S. cerevisiae [3, 4, 6]. В ДНК-связывающем домене белков второй группы (17 белков, обнаруженных у представителей Brettanomyces, Candida, Cyberlindnera, Ogataea и Pichia) расстояние между остатками цистеина и гистидина, связывающими ион цинка в C-концевом цинковом пальце, сильно увеличено за счет вставки из 31‒50 аминокислотных остатков. Эта вставка не содержит мотивов цинковых пальцев. Кроме того, в положении 11 распознающей спирали α2 помимо остатка лизина встречается также остаток аргинина. В ДНК-связывающем домене третьей группы (10 белков) выявлено удлинение C-концевой части домена. В дополнительном участке заметную долю составляют отрицательно заряженные остатки аминокислот. Кроме того, в третьей позиции распознающей спирали α1 вместо остатка аспарагиновой кислоты находится остаток глутаминовой кислоты, а в положении 11 распознающей спирали α2 вместо остатка лизина находится аспарагин. Наконец, в ДНК-связывающем домене четырех белков четвертой группы, выявленных у видов рода Hanseniaspora, домен N-концевого цинкового пальца содержит классический мотив С(Х)_2–4С вместо уникального для Rpn4 S. cerevisiae мотива с сильно разделенными остатками цистеина.

Довольно высокое общее сходство белков внутри третьей и четвертой групп (рис. 4в, г), по-видимому, связано, с их небольшим числом. Можно ожидать, что по мере накопления секвенированных геномов других штаммов дрожжей и, соответственно, увеличения числа членов каждой группы Rpn4-подобных белков, общее сходство последовательностей будет падать при сохранении консервативности ДНК-связывающего домена.

В ходе поиска Rpn4-подобных белков обнаружены семь видов, в геноме которых одновременно присутствуют гены двух Rpn4-подобных белков: Clavispora lusitaniae, виды рода Candida (С. viswanathii, С. parapsilosis, C. orthopsilosis и С. haemulonis) и виды Debaryomyces (D. hansenii и D. fabryi) (рис. 6). Один из этих Rpn4 принадлежит к первой группе, а второй – к третьей. Результаты множественного выравнивания выявили близкое сходство как полных последовательностей этих белков, так и их ДНК-связывающих доменов. Некоторые отличия наблюдаются в распознающих аминокислотных остатках, что соответствует различиям между первой и третьей группами Rpn4-подобных белков.

Рис. 6.

Множественное выравнивание последовательностей паралогичных Rpn4-подобных белков. а ‒ Схема множественного выравнивания. Вверху указана шкала выравнивания в аминокислотных остатках. Выравнивание выполнено с помощью программы COBALT [10] с параметрами по умолчанию. Темным цветом выделены наиболее сходные участки. б ‒ Профиль консервативности ДНК-связывающего домена Rpn4-подобных белков, полученный с помощью программы Jalview2 [11]. Показано положение распознающих α1- и α2-спиралей в N- и С-концевом доменах цинковых пальцев и ДНК-распознающих аминокислотных остатков в этих спиралях.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящей работе показано, что высокая консервативность последовательностей PACE соответствует большому сходству структуры ДНК-связывающих доменов и идентичности большинства ДНК-распознающих аминокислотных остатков у Rpn4-подобных белков, при том что остальная часть этих белков не обнаруживает существенного сходства. Найдены протеасомные гены с двумя и тремя PACE-подобными элементами. Впервые PACE выявлены в промоторах некоторых генов Rpn4-подобных белков, найдены также семь видов, геном которых кодирует два Rpn4-подобных белка, принадлежащих первой и третьей группам, согласно нашей классификации.

Одна из парадигм молекулярной эволюции гласит, что изменения фенотипа и, возможно, образование новых видов обусловлены изменением регуляции, а не функций самих генов [17]. Изменения регуляции экспрессии генов могут быть достигнуты за счет изменения сайтов связывания факторов транскрипции и/или структуры самих факторов. Система регуляции протеасомных генов подтверждает эту парадигму: протеасомные гены очень консервативны, довольно консервативен и PACE, однако структура Rpn4-подобных белков очень разнообразна. N-концевые области Rpn4-подобных белков, где, скорее всего, можно обнаружить регуляторные домены [18], могут быть, судя по множественным выравниваниям (рис. 4а, б), уникальными у каждого вида. Это может указывать на различия в силе и количестве, а также в составе тех белков и белковых комплексов, участвующих в инициации транскрипции, с которыми взаимодействуют разные Rpn4-подобные белки у разных видов. Сложность регуляторной системы увеличивается с появлением нескольких сайтов связывания Rpn4. Ранее мы показали, что в двустороннем промоторе MAG1-DDI1 и в промоторе YAP1 находятся по два PACE-подобных элемента, но в регуляции экспрессии, по крайней мере в нормальных условиях, участвуют только проксимальные сайты [5]. Однако эти результаты не означают, что второй сайт не функционален. Перечисленные гены, включая протеасомные, участвуют в клеточном ответе на стресс (повреждение ДНК, окислительный стресс и т.д.). Нами показано, что индуцированная стрессом экспрессия RPN4, в промоторе которого находятся два сайта связывания факторов транскрипции Pdr1 и Pdr3 [19], дозозависимо увеличивается при действии стрессовых факторов [20]. Аналогично можно предположить, что в условиях сильного стресса Rpn4 может увеличить экспрессию гена-мишени путем использования второго сайта.

Присутствие PACE-подобных элементов в промоторах генов Rpn4-подобных белков может означать существование петли авторегуляции, которая, взаимодействуя с механизмом отрицательной обратной связи [21, 22], может менять соотношение концентраций Rpn4 и протеасомы. На рис. 7 представлена схема усложненной системы регуляции экспрессии протеасомных генов с участием петли положительной авторегуляции Rpn4. Механизм отрицательной обратной связи реализуется следующим образом: Rpn4 активирует экспрессию протеасомных генов, взаимодействуя с PACE в промоторах, что ведет к синтезу субъединиц и сборке активных протеасом, которые, в свою очередь, распознают Rpn4 и деградируют его. Это снижает количество фактора, а значит, экспрессию протеасомных генов и количество самих протеасом. Последовательности PACE, обнаруженные в промоторах RPN4-подобных генов, могут служить слабыми сайтами связывания, следовательно, они будут задействованы только при высоких концентрациях Rpn4. Тогда, при сильном стрессовом воздействии, из-за гиперактивации гена RPN4 сторонними факторами количество Rpn4 возрастает настолько, что он активирует не только транскрипцию протеасомных генов, но и экспрессию собственного гена, а значит, и синтез белка. Таким образом, включается петля положительной авторегуляции (рис. 7). Можно предположить, что с ее участием система переходит на новый уровень, обеспечивая повышенную продукцию протеасом и других Rpn4-зависимых мишеней в ответ на сильное стрессовое воздействие.

Рис. 7.

Схема регуляции экспрессии протеасомных генов с участием петли положительной авторегуляции Rpn4p.

Следующим уровнем усложнения системы регуляции экспрессии протеасомных генов может быть существование второго Rpn4-подобного белка. В проведенных ранее биоинформатических изысканиях [6] отмечено присутствие в геноме D. hansenii гена второго Rpn4-подобного белка, но высказывалось необоснованное предположение о его нефункциональности. В ходе наших поисков обнаружено семь подобных белков. В соответствующих генах не обнаружено каких-либо мутаций, нарушающих рамку считывания. Кроме того, нами амплифицирован ген второго Rpn4-белка из D. hansenii, т.е. его последовательность не является ошибкой сборки последовательностей геномов. Однако попытки клонировать этот ген без нарушения рамки считывания пока не увенчались успехом, что свидетельствует о его высокой токсичности (а, значит, и о наличии активностей) для E. coli. Два Rpn4-подобных белка обнаружены в геномах родственных групп Clavispora, Candida и Debaryomyces, известных своей способностью выживать в экстремальных условиях. Представители Candida зачастую являются патогенами человека, они сверхустойчивы к окислительному стрессу [23‒25], а Debaryomyces [26] может расти в средах с очень высокой концентрацией солей. Учитывая роль Rpn4 в ответе клеток на стресс, можно предположить, что присутствие двух белков позволяет этим дрожжам эффективно справляться с действием экстремальных факторов окружающей среды.

Часть работы выполнена на оборудовании ЦКП “Геном” Института молекулярной биологии РАН (http://www.eimb.ru/rus/ckp/ccu_genome_c.php).

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (№ 18-04-07021, № 18-04-00692).

Все процедуры, выполненные в данной работе, соответствуют этическим стандартам институционального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 года и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.