Молекулярная биология, 2021, T. 55, № 3, стр. 355-361

УБИКВИТИНИРОВАНИЕ И РОЛЬ Е3 УБИКВИТИН-ЛИГАЗ

Убиквитин (Ub) – небольшой высококонсервативный белок, состоящий из 76 аминокислотных остатков, присутствует во всех клетках, а убиквитинирование – одна из самых частых посттрансляционных модификаций белков, играет ключевую роль в разнообразных клеточных процессах. Существуют разные типы убиквитиновых модификаций: моноубиквитинирование – присоединение одной молекулы убиквитина к белку путем ковалентного связывания с остатком лизина (Lys) в молекуле субстрата; мультиубиквитинирование (или множественное моноубиквитинирование) – одновременное присоединение убиквитина к нескольким остаткам Lys белка-субстрата; полиубиквитинирование – формирование поли-Ub-цепи, состоящей из нескольких молекул убиквитина, связанных между собой посредством специфических остатков лизина и глицина. В убиквитин-протеасомной системе (UPS – Ubiquitin-Proteasome System) убиквитин модифицирует белковые субстраты, формируя поли-Ub-цепи, которые служат сигналом для протеасомной деградации белка [1]. Однако оказалось, что убиквитин не только регулирует деградацию белков посредством UPS, но и выполняет множество непротеолитических регуляторных функций. Убиквитинирование изменяет поверхность белка-субстрата, что влияет на его активность, стабильность, способность взаимодействовать с другими белками, а также на его внутриклеточную локализацию [2, 3]. Моноубиквитинирование или мультиубиквитинирование необходимы для попадания определенных белков в везикулы на разных стадиях секреторно-эндоцитозного пути. В этом случае убиквитин выступает в роли регулируемого сортировочного сигнала [4]. А в случае полиубиквитинирования различная топология поли-Ub-цепей приводит к связыванию со специфическими белками-адапторами, что, в свою очередь, имеет различные последствия. Возможны по меньшей мере восемь различных типов связей между мономерами убиквитина. Семь из них образуются за счет внутренних остатков лизина в структуре убиквитина, а восьмой осуществляется через N-концевой остаток метионина [5]. К примеру, связывание через Lys48 используется главным образом для направления белка на деградацию, а связывание через Lys63 играет важную роль в репарации ДНК, воспалительной реакции, эндоцитозе и синтезе белка на рибосомах [6].

Связывание убиквитина с белками-субстратами осуществляется путем трех последовательных ферментативных реакций. Сначала убиквитин-активирующий фермент E1 АТР-зависимо активирует убиквитин с формированием высокоэнергетической тиоэфирной связи между карбоксильной группой С-концевого остатка глицина в убиквитине и остатком цистеина в молекуле Е1. Затем активированный убиквитин переносится на специфический остаток цистеина убиквитинсвязывающего фермента Е2 с формированием сходной тиоэфирной связи. На третьем этапе убиквитин-лигаза E3 взаимодействует одновременно с Е2, благодаря Е2-связывающему домену, и с белком-субстратом, благодаря субстратсвязывающему домену. Убиквитин-лигаза Е3 осуществляет перенос активированного убиквитина с Е2 на субстрат с формированием изопептидной связи между ε-аминогруппой субстрата и С-концевой карбоксильной группой убиквитина [7]. Именно на этом этапе происходит распознавание специфичного субстрата, сайта и типа убиквитиновой модификации, поэтому убиквитин-лигазы Е3 играют ключевую роль в каскаде реакций убиквитинирования.

Чтобы использовать весь функциональный потенциал убиквитинирования, в эукариотических клетках существуют сотни убиквитин-лигаз, которые содержат несколько основных типов каталитических доменов и разнообразные субстратсвязывающие домены и регуляторные элементы. Это свойство позволяет убиквитин-лигазам функционировать в разных клеточных контекстах, отвечать на различные клеточные сигналы и стимулировать процессинг разнообразных белковых субстратов. В геноме человека найдено около 1000 Е3 убиквитин-лигаз, которые в зависимости от структуры Е2-связывающего домена делят на три основных класса: RING (Really Interesting New Gene)/ U‑box, HECT (Homologous to E6AP C-Terminus) и RBR (RING between RING) [8]. Каждый из этих классов имеет свой особый белоксвязывающий домен (RING-finger или HECT) для связывания с Е2 и различные домены для взаимодействия с субстратами.

RING-домен устроен по типу цинковых пальцев, он осуществляет перенос убиквитина от Е2 на субстрат за один шаг [9]. Это самое большое семейство Е3 убиквитин-лигаз. У человека насчитывается около 600 представителей данного семейства [9]. Среди них есть белки, осуществляющие свои функции как самостоятельно (например, IAP – inhibitor of apoptosis, предотвращающий апоптоз; Mdm2, катализирующий убиквитинирование p53), так и в составе мультибелковых комплексов (таких как SCF – Skp-Cullin-F-box и APC/C – anaphase-promoting complex/cyclosome), мишенями которых служат циклины и секурины – ингибиторы анафазы [10–13].

Второй класс Е3 лигаз – HECT-лигазы – характеризуется наличием С-концевого домена из ~350 аминокислот, содержащего активный сайт – консервативный остаток цистеина, с помощью которого образуется временная тиоэфирная связь с убиквитином, а затем его перенос на остаток лизина в молекуле целевого белка [14]. В геноме человека обнаружено около 50 генов белков этого семейства. К этому классу относятся белки E6-AP, Huwe1 и Nedd4.

Е3 лигазы третьего класса – RBR – совмещают в себе черты двух первых классов, так как имеют два RING-домена, один из которых функционирует как каркас, а другой содержит каталитический остаток цистеина, образующий промежуточную связь с убиквитином [15]. У человека известно 14 Е3 лигаз класса RBR, из которых наиболее изучен Parkin [15].

Hyd – УНИКАЛЬНЫЙ ЧЛЕН СЕМЕЙСТВА Е3 ЛИГАЗ

Правильное функционирование UPS необходимо для нормального протекания таких жизненно важных процессов, как клеточный цикл и апоптоз. Поэтому в последние годы возрос интерес к изучению компонентов UPS, в частности Е3 убиквитин-лигаз, обеспечивающих специфичность убиквитинирования, в качестве потенциальных мишеней для терапии многих болезней, включая рак. Один из наиболее интересных представителей семейства Е3 убиквитин-лигаз – HECT-убиквитин-лигаза HYD (hyperplastic discs). Первоначально hyd обнаружили у Drosophila melanogaster как температурочувствительную мутацию, которая вызывала разрастание крыловых и гальтерных имагинальных дисков в мутантных личинках, выращенных при рестриктивной температуре, при этом способность дисков к дифференцировке сохранялась [16, 17]. Было показано, что hyd играет ключевую роль в контроле пролиферации соматических клеток в процессе развития дрозофилы, и на этом основании его отнесли к супрессорам опухолевого роста [17].

Убиквитин-лигаза Hyd дрозофилы, кодируемая геном hyperplastic discs, относится к HECT-семейству Е3 убиквитин-лигаз. Белок Hyd состоит из 2885 аминокислотных остатков и содержит N-концевой UBA-домен (ubiquitin-associated), необходимый для связывания с убиквитином [18]; два сигнала ядерной локализации NLS; UBR (ubiquitin recognin box) домен по типу цинковых пальцев, отвечающий за распознавание первого типа N-дегронов [19]; С-концевой HECT-домен, обеспечивающий каталитическую активность; и белоксвязывающий домен PABC (poly(A)-binding protein C-terminal) (рис. 1а).

Рис. 1.

Структура (а) и функции (б) белка Hyd. UBA – ubiquitin-associated domain; NLS – nuclear localization signal; UBR – ubiquitin recognin box; HECT – homologous to the E6-AP carboxyl terminus; PABC – poly(A)-binding protein C-terminal.

В структуре HECT-домена выделяются две различные части, связанные между собой гибким линкером. N-концевая часть взаимодействует c убиквитинсвязывающим ферментом E2, а С-концевая часть содержит каталитический остаток цистеина, который принимает убиквитин от Е2. При этом С-концевая часть Hyd имеет уникальные особенности, отличающие ее от HECT-доменов других Е3 лигаз, такие как вставка из четырех аминокислот во второй спирали, которая приводит к удлинению спирали и совершенно новой ориентации предшествующей петли. Эта выступающая петля имеет значение при взаимодействии с Е2-связывающим ферментом, она влияет на специфичность связывания [20].

Еще одна уникальная черта белка Hyd – наличие белоксвязывающего домена PABC, найденного также в белке PABP (poly(A)-binding protein), функция которого связана с трансляцией мРНК. PABC представляет собой небольшой протеолитически стабильный, высококонсервативный участок, который служит для связывания с различными белками, осуществляющими регуляцию трансляции (медиаторами терминации и усиления трансляции, стабилизации и полиаденилирования мРНК) [21]. Домен PABC белка Hyd может связываться с некоторыми партнерами соответствующего PABC-домена белка PABP [21, 22].

Hyd В ТКАНЯХ ДРОЗОФИЛЫ

Еще в ранних исследованиях было показано, что опухолевые супрессоры могут функционировать во многих тканях, но только в некоторых из них мутации этих генов вызывают гиперплазию [23]. Изучение мутаций hyd в соматических тканях дрозофилы выявило интересную особенность этого онкосупрессора. Оказалось, что при сильных мутациях мухи умирают на личиночной стадии или на ранней стадии куколки, а имагинальные диски меньше по размеру или отсутствуют совсем. При слабых мутациях, наоборот, чаще встречаются разросшиеся диски, а особи доживают до поздних стадий куколки или до взрослого состояния [17]. В связи с этим предполагается [17], что роль Hyd в контроле клеточной пролиферации не ограничивается лишь ее терминацией, этот фермент участвует также в ее инициации и поддержании.

Эксперименты по мозаичному анализу на глазных имагинальных дисках дрозофилы показали, что в глазах взрослых особей, содержащих клоны клеток, гомозиготных по мутации hyd, разрастается нормальная ткань дикого типа, окружающая мутантные клоны [24]. При этом сами мутантные клоны во взрослом состоянии не сохраняются. Механизм разрастания, при котором сверхпролиферации подвергаются не сами мутантные клетки, а их окружение, получил название клеточно-неавтономного. Глаза, которые полностью состояли из мутантной ткани, были меньше по размеру. Этот фенотип объясняется тем, что в клонах, мутантных по hyd, происходит эктопическая экспрессия генов hedgehog и dpp, что, в свою очередь, приводит к преждевременной дифференцировке фоторецепторов и распространению волны дифференцировки в окружающие здоровые ткани. Таким образом, когда глаз полностью мутантный, прогрессия морфогенетической борозды ускоряется, и клетки диска раньше прекращают деление.

Также известно, что утрата функции гена hyd приводит к стерильности самцов и самок дрозофилы [17]. На модели сперматогенеза показано, что мутации hyd вызывают многочисленные нарушения клеточного деления и дифференцировки сперматоцитов, к которым приводит несогласованность в развитии событий хромосомного, центросомного, микротрубочкового и цитоплазматического циклов. Однако при этом не происходит гиперплазии ни зародышевой, ни соматической тканей семенников, и особенность гена как онкосупрессора не проявляется [25].

Разное проявление мутаций hyd в разных тканях обусловлено многофункциональностью этого белка: в зависимости от клеточного контекста он может осуществлять не только свои протеолитические функции, связанные с деградацией белков, но и, взаимодействуя с другими белками и/или нуклеиновыми кислотами, выступать в качестве важного регулятора клеточных процессов (рис. 1б).

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ Hyd

Хотя выявлено более 56 белок-белковых взаимодействий, в которых участвует белок Hyd дрозофилы, доказанным субстратом для убиквитинирования с последующей протеасомной деградацией является только белок Groucho/TLE [26]. У ортолога Hyd, белка UBR5 (Ubiquitin protein ligase E3 component n-recognin 5) человека, который локализуется преимущественно в ядре, известно множество субстратов, включая белки ответа на повреждения ДНК (TopBP1, ATMIN и CHK2) [27–29], регуляторы транскрипции (hPXR, RNF168, CDK9) [27] и трансляции (PAIP2 (PABP2)) [27], протоонкогены β-катенин, E6 папилломавируса человека и с-Myc [27, 28, 30], регуляторы клеточной гибели MOAP1 и XIAP [31, 32], белки с мотивом PAM2 – BUB1, BUB1β, и ATXN2L [26], фактор ангиогенеза AGR2 [33] и глюконеогенеза PEPCK1 [28]. Таким образом, UBR5 млекопитающих вовлечен в регуляцию многих клеточных процессов: транскрипцию, трансляцию, пролиферацию, трансформацию клеток, ответ на повреждения ДНК (рис. 1б).

НЕПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ Hyd

В экспериментах на крыловых имагинальных дисках дрозофилы показано, что в Hh-сигнальном пути Hyd регулирует экспрессию генов-мишеней Hh – dpp, ptc, en, col, связываясь непосредственно с промоторами этих генов в различных соотношениях, что делает возможным их дифференцированное регулирование [34]. На определенном промоторе Hyd выступает в роли фактора, присутствие которого влияет на транскрипционную активность Ci (Cubitus interuptus) – главного транскрипционного медиатора Hh-сигнального пути. При этом Hyd физически взаимодействует с Ci. Интересно, что для осуществления этой регуляции необходима Е3 лигазная активность Hyd, но в протеасомной деградации этих субстратов Hyd не участвует [34].

Hyd необходим также для запуска экспрессии генов-мишеней в сигнальном пути Wnt, контролирующем ключевые события в процессе эмбрионального развития и морфогенеза. В отсутствие сигнала Wg репрессор Groucho/TLE связан с энхансерной последовательностью генов-мишеней, и это предотвращает их экспрессию. В ответ на сигнал происходит стабилизация белка-эффектора β‑катенина, который связывается с Groucho/TLE и Hyd, что приводит к убиквитинированию TLE, его дестабилизации и, как следствие, к конформационному изменению всего комплекса белков, связанных с энхансером. Хроматин переходит в деконденсированное состояние, что приводит к активации транскрипции. Экспериментально полученные данные позволили cделать вывод [26], что инактивация Groucho/TLE путем убиквитинирования и последующей протеасомной деградации не является основным механизмом регуляции его репрессорных функций. Предполагается, что присоединение поли-(Ub)-цепей ослабляет связь Groucho/TLE с нуклеосомами, а следовательно, и его способность удерживать хроматин в компактном состоянии [26].

Другой пример непротеолитической функции Hyd – участие в развитии иммунного ответа у дрозофилы. Посредством каталитического HECT-домена Hyd физически взаимодействует с белком Akirin и формирует на нем Lys63-поли-(Ub)-цепи, которые служат для дальнейшего связывания кофактора Akirin с транскрипционным фактором Relish и последующей активации экспрессии Akirin-зависимых генов [35]. Белок UBR5 человека (ортолог Hyd дрозофилы) необходим также для активации транскрипции AKIRIN2-зависимых генов.

Во всех приведенных примерах рассмотрены эволюционно консервативные сигнальные пути. И у млекопитающих, и у дрозофилы Hyd выполняет в них аналогичные функции. Еще один пример консервативного механизма регуляции экспрессии генов с участием UBR5 – генный сайленсинг, опосредованный микроРНК. В этом процессе убиквитин-лигазная активность UBR5 вообще оказалась необязательной. Для нормального функционирования UBR5 в сайленсинге с участием микроРНК необходим домен PABC, посредством которого UBR5 взаимодействует с белками семейства GW182 в комплексе c Argonaute и микроРНК, осуществляющими регуляцию трансляции [36] (рис. 1б).

РОЛЬ Hyd В РАЗВИТИИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЧЕЛОВЕКА

Hyd, как и все Е3 убиквитин-лигазы, – высококонсервативный белок, имеющий близкого ортолога у млекопитающих – UBR5, также известного, как EDD (E3 identified by Differential Display). Изначально UBR5 был идентифицирован в клетках рака молочной железы при скрининге генов, регулируемых прогестином [37]. В дальнейшем оказалось, что амплификация UBR5 характерна для многих видов рака [38]. Так, при раке молочной железы и раке яичников амплификация локуса UBR5 приводит к сверхэкспрессии мРНК гена UBR5. Недавние исследования показали, что 18% случаев мантийноклеточной лимфомы связаны с несинонимичными заменами в гене UBR5. Большинство из этих мутаций затрагивает консервативный остаток цистеина в HECT-домене белка, что нарушает его лигазную активность [39]. По данным COSMIC (catalogue of somatic mutations in cancer) при раке часто возникают точечные мутации по всей рамке считывания UBR5, а в районе домена HECT/PABC наблюдается тенденция к мутациям со сдвигом рамки считывания, что также, скорее всего, приводит к потере E3 убиквитин-лигазной активности [40]. Это указывает на онкосупрессорную функцию UBR5-опосредованного убиквитинирования [27].

Все большее количество исследований говорит о том, что UBR5 связан с различными аспектами биологии рака, но механизм, посредством которого этот белок вносит вклад в инициацию и прогрессию опухолей, остается невыясненным. Не совсем понятно, к какой группе генов следует отнести UBR5 – к онкогенам или онкосупрессорам. В одних случаях прослеживается четкая связь между амплификацией UBR5, его сверхэкспрессией и химиорезистентностью опухоли и, как следствие, с неблагоприятным исходом болезни [32]. Например, повышенный уровень экспрессии UBR5 при серозном раке яичника коррелирует со сниженной чувствительностью к циспластину, что в совокупности приводит к почти двукратному увеличению риска рецидива и смерти пациентов [41]. В других случаях развитие опухолей обусловлено мутациями потери функции UBR5 [39]. В связи с этим большое значение для изучения роли UBR5 в развитии рака приобретают животные модели, позволяющие модулировать экспрессию UBR5 в различных условиях и в различных клеточных контекстах. Выяснение роли UBR5 и набора субстратов в каждом конкретном случае необходимы для использования UBR5 в качестве мишени при таргетной противоопухолевой терапии.

Работа выполнена при финансовой поддержке программы фундаментальных научных исследований по темам 0310-2019-0005 (Ю.А. Галимова) и 0324-2019-0042-C-01 (Н.В. Дорогова и С.А. Фёдорова).

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследований.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.