Молекулярная биология, 2021, T. 55, № 3, стр. 362-391

WUS

Функции WUS в меристемах побега. Ген WUS A. thaliana известен в первую очередь как фактор, поддерживающий функционирование меристем побега за счет стимуляции пролиферации и подавления дифференцировки их стволовых клеток. WUS функционирует в апикальной меристеме побега (ПАМ), меристеме соцветия, пазушных меристемах и меристеме цветка. ПАМ растений с потерей функции гена WUS (wus-1) способна дать начало лишь небольшому числу листьев, после чего прекращает функционировать. На ее поверхности образуются новые меристемы, но любая из них через небольшой промежуток времени прекращает свою работу, и ситуация повторяется. Сходными дефектами обладают меристемы соцветий, а меристемы цветка также дифференцируются раньше, чем в норме, и вместо шести тычинок и двух плодолистиков формируют всего лишь одну тычинку в центре [7]. Потеря функции WUS также приводит к снижению частоты образования пазушных меристем. Напротив, стимуляция активности WUS приводит, в частности, к увеличению размеров ПАМ [8] и количества пазушных меристем [9].

WUS способен не только поддерживать функционирование меристем побега, но и обеспечивать их идентичность. Так, эктопическая экспрессия WUS в отдельных клетках корней A. thaliana приводит к развитию структур, подобных ПАМ, образующих листоподобные органы. При добавлении ауксина в среду на кончиках таких корней развиваются соматические эмбрионы, а на фоне сверхэкспрессии гена LEAFY, регулятора цветения, – неупорядоченно расположенные органы цветка [10]. В системе регенерации побегов из эксплантов гипокотилей A. thaliana потеря функции WUS делает невозможной регенерацию побегов in vitro, а его избыточная экспрессия может приводить к регенерации побегов на безгормональной среде [11].

WUS начинает экспрессироваться уже в эмбрионе на стадии 16 клеток во внутренних клетках апикального домена. В постэмбриональном развитии этот ген экспрессируется в ПАМ и меристеме соцветия в клетках организующего центра (ОЦ), а также в центральной части меристемы цветка. В ходе развития цветка уровень экспрессии WUS постепенно уменьшается, и его РНК не детектируется, когда стволовые клетки меристемы окончательно расходуются на образование плодолистиков [12]. Также экспрессия WUS наблюдается при заложении пазушной меристемы; в ходе дальнейшего развития домен экспрессии ограничивается ее ОЦ [13]. Таким образом, ген WUS в меристемах побега обычно оказывает влияние не на те клетки, в которых экспрессируется (клетки ОЦ), а на стволовые клетки, расположенные выше [12]. Белок WUS способен мигрировать из ОЦ в соседние клетки, и его присутствие в слоях L1 и L2 важно для выполнения его функций в ПАМ [14, 15]. WUS способен формировать гомодимеры, а его подвижность, вероятно, ограничивается в том числе за счет гомодимеризации [15].

Ортологи WUS обнаружены у множества видов растений, в том числе у голосеменных [16]. Обычно паттерны экспрессии и функции WUS A. thaliana и его ортологов сходны, однако встречаются и различия. Так, ортологи WUS у Medicago truncatula, Oryza sativa и Zea mays экспрессируются в листовых примордиях [17–19]. При этом потеря функции ортолога WUS у риса, гена MONOCULM3, или TILLERS ABSENT1 (TAB1 ), не влияет на активность ПАМ, но приводит к недоразвитию боковых побегов, связанную с дефектами при заложении пазушных меристем [20]. TAB1 не экспрессируется в ПАМ, но активен в меристеме соцветия и при заложении пазушных меристем [20, 21]. Функцию поддержания ПАМ у O. sativa выполняет другой ген семейства WOX – OsWOX4 (см. ниже). При формировании пазушных меристем TAB1 экспрессируется до образования видимой пазушной меристемы, в так называемой премеристематической зоне, в дальнейшем его экспрессия исчезает, но уже непосредственно в пазушных меристемах начинает экспрессироваться OsWOX4 [20].

WUS и CLV3. Наиболее известным регулятором экспрессии WUS является CLE-пептид CLAVATA3 (СLV3). Ген CLV3 экспрессируется в центральной зоне ПАМ и меристемы соцветия (над ОЦ), и потеря его функции приводит к увеличению размера ПАМ, которая приобретает более выпуклую форму вследствие эктопической экспрессии WUS [22]. Напротив, сверхэкспрессия CLV3 приводит к остановке развития ПАМ и к подавлению экспрессии WUS [23]. Рецепция CLV3 осуществляется с помощью мембранных рецепторных киназ с лейцин-богатыми повторами, в частности, CLAVATA1 (CLV1) и RECEPTOR-LIKE PROTEIN KINASE 2 (RPK2), способных формировать гомодимеры. В рецепции CLV3 также участвует комплекс из рецептороподобного мембранного белка CLV2, не имеющего киназного домена, и мембранной псевдокиназы CORYNE (CRN). Фенотипические проявления мутаций в генах, кодирующих белки CLV1, RPK2, CRN или CLV2, сходны с фенотипом растений с потерей функции CLV3. Помимо этого, гены рецепторных киназ из группы BARELY ANY MERISTEM (ВАМ1 и 2), которые в норме экспрессируются вокруг центральной зоны ПАМ и поддерживают ее стволовые клетки, в случае потери функции CLV1 начинают экспрессироваться в центральной зоне. В этом случае данные киназы способны частично выполнять функции CLV1, по-видимому, также передавая сигнал от CLV3 к WUS [24]. Путь дальнейшей передачи сигнала от CLV3 до репрессии транскрипции WUS известен не до конца, однако выяснено, что в рецепции CLV3 участвуют также киназы CLAVATA3 INSENSITIVE RECEPTOR KINASE1-4 (CIK1-4), действующие после перечисленных рецепторов [25]. Другими посредниками в передаче сигнала от CLV3 к WUS являются фосфатазы POLTERGEIST1 (POL1) и POLTERGEIST-LIKE 1 (PLL1) [26]. В норме CLV3 ингибирует работу фосфатаз POL и PLL1, активаторов экспрессии WUS [27]. Фосфатидилинозит-4-фосфат (PI(4)P) стимулирует активность POL и PLL1. Поскольку при передаче сигнала от рецепторов, связавших CLV3, активность POL и PLL1 должна подавляться, предполагается, что рецепторы могут блокировать либо синтез PI(4)Р, либо его связывание с POL и PLL1 [28]. Другие предполагаемые посредники в передаче сигнала CLV3 – G-белки [29], MAP-киназы MPK3 и 6 [30], а также ионы кальция [31]. В свою очередь, ТФ WUS активирует экспрессию гена CLV3. Так, например, эктопическая экспрессия WUS в примордиях развивающихся листьев приводит к появлению в них клеток, сходных с меристематическими, в которых экспрессируется CLV3 [22], а потеря функции WUS приводит к отсутствию или снижению активности промотора CLV3 [23]. Эти данные говорят о существовании в ПАМ системы обратной связи WUS-CLV, которая ограничивает зону экспрессии WUS в ОЦ [22] (рис. 1). Аналогичные отношения между ортологами WUS и CLV3 наблюдаются также и у других видов, например у Cucumis sativus [32]. WUS активирует транскрипцию CLV3 [14], связываясь, в частности, с пятью близко расположенными регуляторными элементами в 3′-области гена CLV3, которые образуют так называемый цис-регуляторный модуль [14, 33]. Анализ мутаций в этих элементах и соотнесение их с аффинностью к WUS, а также другие эксперименты позволили предположить, что при высокой концентрации WUS формирует гомодимеры и подавляет экспрессию CLV3, а в случае его низкой концентрации мономеры WUS, напротив, стимулируют экспрессию CLV3. Это позволяет не активировать CLV3 в ОЦ, но активировать его в центральной зоне ПАМ [33]. Однако согласно другому исследованию, основным фактором, определяющим влияние WUS на экспрессию CLV3, являются белки HAIRY MERISTEM (HAM) (см. ниже) [34]. WUS также подавляет экспрессию CLV1, связываясь с его промотором [35].

Рис. 1.

Регуляторный модуль WUS-CLV3 (объяснения в тексте).

WUS и AGAMOUS. Другой регуляторный модуль, включающий WUS, связан с геном AGAMOUS (AG), кодирующим ТФ с доменом MADS, и регуляцией терминации меристемы цветка. Согласно модели развития цветка ABCDE, AG – это ген класса C, отвечающий за развитие андроцея и гинецея [36]. В растениях с мутацией в гене AG, в отличие от растений дикого типа, меристема цветка остается недетерминированной, и гены WUS и CLV3 не перестают экспрессироваться на поздних стадиях развития цветка. AG в норме подавляет транскрипцию WUS, тем самым способствуя терминации развития меристемы цветка после заложения всех цветковых органов [37]. WUS, действуя совместно с активатором цветения LFY, запускает экспрессию AG, связываясь с его локусом [37, 38]. Таким образом, гены AG и WUS, связанные петлей обратной связи (рис. 2), ответственны за прекращение активности стволовых клеток цветочной меристемы и детерминированность цветка. AG подавляет экспрессию WUS с помощью нескольких путей. В одном из них AG активирует транскрипцию гена, кодирующего ТФ KNUCKLES (KNU) с мотивом цинковых пальцев C2H2 и с доменом EAR [39], и гена ТФ MINI ZINC FINGER2 (MIF2) [40]. Белки KNU и MIF2 в составе комплекса с корепрессором TOPLESS (TPL) и деацетилазой гистонов HISTONE DEACETYLASE 19 (HDA19) подавляют экспрессию WUS, связываясь с его промотором; аналогичный регуляторный модуль обнаружен и у Solanum lycopersicum [40]. Репрессия локуса WUS под действием KNU опосредована не только деацетилированием гистонов: KNU также рекрутирует в локус WUS комплекс PRC2 (Polycomb-repressive complex 2), что приводит к накоплению репрессирующих меток H3K27me3, а также способствует снижению количества активирующих меток H3K4me3 в локусе WUS и вытеснению белка SPLAYED (SYD) – активатора WUS (см. ниже) [41].

Рис. 2.

Регуляторный модуль WUS-AG (объяснения в тексте).

AG также репрессирует WUS, связываясь с регуляторными последовательностями в его локусе и, вероятно, рекрутируя PRC2 [42]. Кроме того, AG взаимодействует с компонентом PRC1 – белком TERMINAL FLOWER2 (TFL2)/LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN1 (LHP1), также участвующим во внесении метки H3K27me3. Методами 3С и ChIP-3C показано, что в меристеме цветка AG и TFL2, связываясь друг с другом, участвуют в образовании хроматиновой петли в локусе WUS, подавляя тем самым экспрессию WUS [43]. В образование петли вовлечены так называемые CArG-боксы в 3′-регуляторной области WUS – сайты связывания AG. Интересно, что мутации в CArG-боксах в локусе ортолога WUS у S. lycopersicum – гена Locule number (Lc) – приводят к повышению уровня его экспрессии при развитии плодов и к увеличению размера плода и числа камер в нем; нуклеотидные замены в этих локусах можно обнаружить у многих культивируемых сортов томата [44, 45]. Еще один белок, вовлеченный в регуляцию локуса WUS белком AG – ДНК-топоизомераза IB MGOUN1/TOP1α, которая облегчает связывание AG с WUS посредством уменьшения количества нуклеосом в данном локусе, что в конечном счете приводит к подавлению экспрессии WUS [46].

Третий возможный путь репрессии WUS ТФ AG связан с действием ауксин-чувствительных факторов. Мутация в гене AUXIN RESPONSE FACTOR 3 (ARF3) приводит к разрастанию медиальной части гинецея, что указывает на нарушение терминации меристемы цветка. ARF3 подавляет активность WUS в меристеме цветка, а связыванию ARF3 с локусом WUS способствует AG [47]. В то же время регулятор развития цветка из группы A – ген APETALA2 (AP2), кодирующий ТФ из класса AP2/EREBP, действует как антагонист AG. AP2 опосредованно стимулирует экспрессию WUS, в том числе, вероятно, путем прямой репрессии ARF3 [47].

С помощью генетического анализа, оценки взаимодействия белков и других экспериментов показано, что AG, ген класса C, функционирует в составе тетрамерных комплексов вместе с другими белками с доменом MADS из функциональных групп B, D и E [36]. Согласно данным генетического анализа и анализа экспрессии ортолога WUS TERMINATOR (TER) у Petunia hybrida, лишь совместное действие ТФ классов C, D и E может подавить экспрессию TER в меристеме цветка [48]. Эти данные и результаты генетического анализа других видов позволяют предполагать, что AG и его ортологи подавляют экспрессию WUS или его ортологов в составе тетрамерного комплекса [49, 50].

Другие белковые регуляторы WUS. Экспрессию WUS регулируют не только AG и CLV3, но и множество других факторов. В частности, к предполагаемым прямым репрессорам WUS относятся ULTRAPETALA1 (цистеин-богатый белок с B‑боксом и ДНК-связывающим доменом SAND) [51, 52] и способный к взаимодействию с ним ULT1 INTERACTING FACTOR 1 (UIF1) с Myb- и EAR-доменами [53]. Потеря функции ULT1 и/или UIF приводит к развитию цветков с увеличенным количеством чашелистиков и лепестков [53]. UIF1 способен связываться с промотором WUS. Можно предположить, что UIF1 и ULT1 взаимодействуют друг с другом и репрессируют активность WUS в меристеме цветка [53]. Согласно данным генетического анализа, при развитии соцветий и формировании меристем цветка WUS действует в том числе через подавление ULT1 [51].

Важным регулятором развития ПАМ является также ген STM (SHOOTMERISTEMLESS). Показано, что в регуляции ПАМ STM и WUS действуют параллельно, при этом они необходимы для нормальной экспрессии друг друга [12, 54, 55]. Результаты многочисленных исследований указывают на связь между другими регуляторами развития ПАМ – ТФ HD-ZIPIII – и геном WUS. Анализ растений с мутацией cna1 в гене CORONA (CNA), кодирующем ТФ семейства HD-ZIPIII, растений с мутацией jba1D, для которых характерна сверхэкспрессия гена микроРНК (miR166G, репрессор генов HD-ZIPIII), и сочетания этих мутаций с мутацией wus-1 говорит о негативной регуляции экспрессии WUS факторами HD-ZIPIII [56, 57]. Тем не менее, показано прямое связывание ТФ HD-ZIPIII PHABULOSA (PHB), PHAVOLUTA (PHV) и REVOLUTA (REV) с локусом WUS в ходе регенерации побегов и их взаимодействие с ТФ ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATOR (ARR) типа B (ARR1 и ARR2), прямыми активаторами WUS (см. далее). Эти ТФ HD-ZIPIII, как и ARR1 и ARR2, важны для регенерации, хотя разные сочетания мутаций в этих генах приводят как к снижению, так и к повышению способности к регенерации побегов. Предполагается, что ARR типа B и указанные HD-ZIPIII образуют комплекс, который активирует WUS в ходе регенерации, однако влияние HD-ZIPIII на развитие ПАМ и на экспрессию WUS в целом неоднозначно [11]. Также HD-ZIPIII могут, по-видимому, действовать на меристемы побега не только через WUS: одновременная потеря функции PHB, PHV и CNA приводит к частичной супрессии фенотипа мутантов wus-1 и частичному восстановлению ПАМ [58].

Изучение ортологов WUS у других видов позволило обнаружить еще несколько ТФ, регулирующих экспрессию данных ортологов путем связывания с их локусами: специфическая форма ТФ c доменом MADS CsFRUITFULL1 – активатор CsWUS у C. sativus [32], ТФ из группы AP2/ERF EXCESSIVE NUMBER OF FLORAL ORGANS (ENO) – репрессор Lc (SlWUS) у S. lycopersicum [59], PtrTALE12 – активатор PtrWUS у Populus trichocarpa [60].

WUS и фитогормоны. Взаимодействию WUS и фитогормонов, главным образом ауксинов и цитокининов, посвящено множество работ. Сигнальные пути цитокининов и WUS связаны друг с другом положительной обратной связью. WUS подавляет экспрессию генов ARR типа A (ARR5, 6, 7 и 15), кодирующих репрессоры ответа на цитокинины, также подтверждено связывание WUS с промотором гена ARR7. Таким образом, WUS действует как стимулятор передачи цитокининового сигнала [61]. Тем не менее, данные генетического анализа и математическое моделирование показывают, что WUS, вероятно, негативно влияет на синтез цитокининов (возможно, посредством репрессии гена LONELY GUY 4 (LOG4), кодирующего фермент активации цитокининов) [62].

Обработка растений цитокинином приводит к увеличению уровня экспрессии WUS, к расширению домена его экспрессии и к появлению фенотипа, сходного с фенотипом растений с мутациями в генах CLAVATA [63, 64]. Кроме того, цитокинины способны стабилизировать белок WUS, тем самым стимулируя его распространение в клетки, в которых ген WUS не экспрессируется [65]. Паттерн цитокининового ответа в ПАМ сходен с паттерном экспрессии WUS, а домены экспрессии AHK4 (ген рецептора цитокинина) и WUS значительно перекрываются между собой [63]. Промотор гена LOG4, кодирующего фермент, активирующий цитокинины, работает в слое L1 в ПАМ, что позволяет предполагать наличие источника активных форм цитокининов в этом слое. Предполагается, что место экспрессии WUS и, соответственно, позиция ОЦ в ПАМ динамически определяются комбинированным антагонистическим влиянием концентраций цитокинина и CLV3 и устанавливаются в зоне, где содержание цитокининов, поставляемых из L1, еще достаточно высоко, содержание CLV3 уже достаточно мало, а также присутствует рецептор цитокинина AHK4 [62].

ТФ ARR типа B – положительные регуляторы цитокининового ответа – в частности, ARR1, 2, 10 и 12, активируют экспрессию WUS в ходе регенерации побегов, в ПАМ [66–68] и при заложении пазушных меристем [9]. При этом цитокинин стимулирует связывание ARR с локусом WUS [68, 69]. Нарушение работы ARR B-типа приводит к подавлению этих процессов и к уменьшению размера ПАМ из-за снижения уровня экспрессии WUS [9, 11, 66, 69]. Тем не менее, эффект ARR B-типа на регенерацию не всегда однозначен. Так, растения с потерей функции ARR1 характеризуются повышенной способностью к каллусообразованию и побегообразованию корневых эксплантов, а сверхэкспрессия гена ARR1 снижает эту способность. Однако в отсутствие функционального ARR12 ARR1, напротив, стимулирует побегообразование. Его ингибирующий эффект на регенерацию связан, в частности, с тем, что он вытесняет ARR12 из локусов CLV3 и WUS – стимуляторов побегообразования – будучи при этом не таким эффективным стимулятором экспрессии, как ARR12 [70].

Взаимное влияние WUS и ауксинов не однозначно. В ПАМ ауксиновый ответ локализуется в первую очередь в примордиях листьев, а в стволовых клетках центральной зоны наблюдается его минимум. Тем не менее, подавление действия ауксина в ПАМ зачастую приводит к ее терминации. Таким образом, стволовые клетки ПАМ требуют для своего поддержания определенного уровня ауксинового ответа. WUS способен непосредственно регулировать экспрессию множества генов, связанных с ауксиновым ответом и синтезом ауксина: TIR1, MONOPTEROS (MP)/ARF5 и других ARF, TARGET OF MONOPTEROS6/TMO6, TRYPTOPHAN AMINOTRANSFERASE RELATED2 (TAR2). Таким образом, WUS поддерживает в ПАМ уровень ауксинового ответа на стабильно низком, но не нулевом уровне [71].

Влияние ауксина на экспрессию WUS изучено в различных системах регенерации. В частности, для регенерации побегов in vitro экспланты часто культивируют сначала на среде с высоким содержанием ауксина (CIM, callus-inducing medium), а затем на среде с высоким содержанием цитокинина (SIM, shoot-inducing medium). Полярный транспорт ауксина, нужный для формирования его градиента, необходим для активации промотора WUS на SIM [72]. Необходимость определенной концентрации ауксина для экспрессии WUS показана и в системе получения соматических эмбрионов. Образование ауксиновых максимумов сначала в будущем апикальном домене соматического эмбриона, а затем в развивающихся примордиях семядолей коррелирует с активацией промотора WUS в зоне, соответствующей ПАМ [73]. Нарушение ауксинового ответа приводит к изменению домена экспрессии WUS и к подавлению формирования соматических эмбрионов [74].

Эпигенетические регуляторы WUS. В регуляции WUS участвуют также многие эпигенетические факторы. Так, мутации в различных генах, кодирующих эпигенетические репрессоры, такие как метилтрансфераза гистонов KRYPTONITE, ДНК-метилтрансфераза METHYLTRANSFERASE1 (MET1) и другие, приводят к повышенному уровню экспрессии WUS в каллусах и увеличению скорости регенерации побегов из таких каллусов, что предполагает важную роль эпигенетических модификаций в активации WUS в ходе регенерации [75, 76]. В пазухах молодых листьев в локусе WUS наблюдаются высокие уровни репрессирующей метки H3K27me3 и низкие уровни активирующей метки H3ac, в то время как в пазухах зрелых листьев, в которых формируются пазушные меристемы, уровень H3ac возрастает, а H3K27me3 – снижается, что делает возможной активацию WUS и формирование пазушных меристем [9].

К числу эпигенетических активаторов экспрессии WUS можно отнести хроматин-ремоделирующий фактор SPLAYED (SYD) из семейства SNF, который связывается с промотором WUS. У растений с потерей функции гена SYD наблюдается более ранняя терминация меристемы соцветия и уменьшение уровня экспрессии WUS в ней [77]. Белок BARD1 (BRCA1-associated RING domain 1), или ROW1 (REPRESSOR OF WUS1), способен связываться с участком промотора WUS, близким к сайту связывания SYD, а также взаимодействовать с SYD, однако при этом он является репрессором WUS [78]. Влияние на паттерны и уровень экспрессии WUS выявлено при изучении множества других эпигенетических регуляторов и ТФ, таких как FASCIATA1 и 2 (субъединицы фактора сборки хроматина CAF-1 (Chromatin assembly factor-1)) [79], AtRING1a и AtRING1b (компоненты комплекса PRC1) [80], FILAMENTOUS FLOWER и YABBY3 из семейства YABBY [81], HANABA TARANU из семейства GATA [82], ТФ OBERON1-4 c PHD-доменом (plant homeodomain) [83] и другие.

Физиологические регуляторы WUS. Обнаружено влияние ряда небелковых веществ, а также факторов окружающей среды на экспрессию WUS. Так, супероксид-анион, содержание которого повышено в центральной зоне ПАМ, стимулирует экспрессию WUS, а пероксид водорода, который концентрируется в периферической зоне ПАМ – подавляет. Нарушение баланса данных веществ в ПАМ может привести к изменению ее размера или даже к терминации [84]. Кроме того, активность промотора WUS в проростках стимулируется продуктами фотосинтеза (сахароза), а также уровнем освещенности. Интересно, что активность phyB, фитохрома, отвечающего за восприятие красного света, в мезофилле, эпидермисе или проводящих тканях стимулирует активность промотора WUS в ПАМ. Таким образом, вероятно, существует некий мобильный сигнал, который переносится в ПАМ и активирует ее работу после восприятия света. Одним из передатчиков активирующего сигнала к WUS от света и продуктов фотосинтеза, является киназа TARGET OF RAPAMYCIN [85].

Иные мишени WUS. WUS поддерживает стволовые клетки ПАМ не только за счет взаимодействия с сигнальными путями цитокининов и ауксинов, но и с помощью регуляции экспрессии множества генов, кодирующих различные ТФ. Среди прямых мишеней WUS обнаружены гены ТФ, стимулирующих дифференцировку, включая KANADI1 (KAN1), KAN2, ASYMMETRIC LEAVES2 (AS2) и YABBY3. В норме WUS мигрирует в периферическую зону ПАМ, подавляя экспрессию генов, отвечающих за дифференцировку, в то время как ТФ, кодируемые этими генами, в частности KAN1, напротив, ограничивают экспрессию WUS, делая ее возможной только в ОЦ [86]. WUS также подавляет в ПАМ гены группы HECATE (HEC), кодирующие ТФ из группы bHLH, связываясь с их локусами. Анализ мутантов показывает, что HEC1, 2 и 3 действуют на ПАМ сходным с WUS образом, однако при этом оказывают противоположный эффект на гены, регулируемые WUS. Так, например, HEC1 активирует экспрессию генов ARR типа A. Таким образом, HEC1 может выполнять в ПАМ двоякую функцию, с одной стороны, стимулируя пролиферацию стволовых клеток за счет активации специфических мишеней и действуя параллельно WUS, но с другой, подавляя ее с помощью других механизмов, в частности, за счет репрессии цитокининового ответа [87]. CaWUS, ортолог WUS у Cicer arietinum, также связывается с промотором гена, кодирующего CabHLH121 – ТФ из группы bHLH, вовлеченный в контроль размеров ПАМ и растения в целом [88].

Партнеры WUS. Работа WUS в ПАМ осуществляется в том числе за счет взаимодействия с белками-партнерами. Одними из первых обраруженных кофакторов WUS были белки-корепрессоры TOPLESS (TPL) и TOPLESS-RELATED 1 (TPR1), 2 и 4 [89, 90]. Способностью к взаимодействию с ортологами TPR обладает ортолог WUS риса – белок MONOCULM3 (MOC3) [91]. Эксперименты по комплементации мутантов wus-1 показали, что для выполнения WUS своих функций требуется его взаимодействие с TPL (или, возможно, TPR1, 2 и 4) [92]. Белки группы TOPLESS осуществляют репрессию транскрипции за счет взаимодействия с деацетилазами гистонов [93]. Активация WUS приводит к изменению уровня ацетилирования гистонов в большом количестве локусов, с которыми он связывается [71], что, вероятно, и приводит к их репрессии данным ТФ. При этом WUS непосредственно активирует экспрессию TPL и подавляет экспрессию TPR1 и 2 [35]. WUS также может взаимодействовать с ТФ HAIRY MERISTEM1-4 (HAM1-4) с доменом GRAS. Растения с мутациями ham1, ham2, ham3 и ham4 имеют укороченные корни, у них наблюдается остановка развития ПАМ и нарушено развитие сосудистых тканей. Таким образом, HAM1–4 необходимы, в частности, для поддержания функционирования ПАМ. Домены активности промоторов HAM1 и 2 перекрываются с доменом активности промотора WUS. Уровень экспрессии прямых мишеней WUS изменяется сходным образом в мутантах wus-1 или ham1 ham2 ham3, и было показано, что HAM2 связывается с некоторыми из этих локусов в тех же участках, в которых с ними связывается WUS [94]. Совместное участие HAM и ортолога WUS (TERMINATOR) в поддержании ПАМ обнаружено также у P. hybrida [95]. Тем не менее, HAM1 и 2 в отличие от WUS, подавляют экспрессию CLV3. Потеря функции генов HAM или отсутствие градиента их экспрессии (что наблюдается, например, при заложении придаточных меристем) приводит к формированию паттерна экспрессии CLV3 с максимумом в зоне экспрессии WUS. Эти данные, а также математическое моделирование позволяют предположить, что гетеродимеры WUS-HAM подавляют экспрессию CLV3, а мономеры WUS – активируют [34]. К предполагаемым партнерам WUS и его ортологов можно также отнести белки из группы SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN у Glycine max [96] и A. thaliana, ТФ из группы CmCYC2 (семейство TCP) у Chrysantemum morifolium [97] и ТФ DRINK ME с доменом bZIP у A. thaliana [98].

Иные функции WUS. WUS участвует не только в поддержании меристем побега, но и в ряде других аспектов жизни растения. Так, проростки с потерей функции WUS имеют укороченный гипокотиль из-за снижения интенсивности пролиферации. WUS является непосредственным активатором гена GRP23 (GLUTAMINE-RICH PROTEIN 23), кодирующего ядерный белок с PPR-мотивом, взаимодействующий с РНК-полимеразой II. Белок GRP23 опосредует влияние WUS на длину гипокотиля [99]. Мутация jam в промоторе гена WUS приводит к снижению уровня экспрессии WUS и к развитию растений, у которых не формируются листья ювенильного фенотипа (с меньшим количеством трихомов и более простым жилкованием) [100]. Подобный эффект обусловлен снижением у растений с мутацией в гене WUS уровня экспрессии гена микроРНК miR156 (регулятор перехода из ювенильной фазы в фазу взрослого фенотипа) и увеличением уровня экспрессии одной из мишеней этой микроРНК – гена SPL9 (SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE9) – в ПАМ и примордиях листьев [101]. У некоторых видов ортологи WUS еще более существенно влияют на развитие листьев. Так, у растений M. truncatula с потерей функции гена HEADLESS (HDL) – ортолога WUS, помимо прочего, уменьшена длина листьев и изменена их форма, что, возможно, связано с нарушением транспорта ауксина и паттернов ответа на ауксин [17, 18].

WUS влияет также на фенотип цветка, действуя не только как регулятор развития его меристемы, но и как непосредственный участник развития органов цветка. Так, экспрессия WUS обнаружена в развивающихся пыльниках между пыльцевыми гнездами и позднее, в ходе развития тычинки, – в периферических клетках пыльников [56, 102]. Пыльники растений с потерей функции WUS часто имеют меньшие или неправильно сформированные доли по сравнению с пыльниками дикого типа и не раскрываются [103]. ТФ PHB из семейства HD-ZIPIII непосредственно подавляет экспрессию SPOROCYTELESS(SPL)/NOZZLES(NZZ) – стимулятора развития микроспороцитов – и активирует экспрессию WUS для детерминации границ между микроспорангиями, в то время как miR165/166 ограничивает активность PHB и делает возможной экспрессию SPL в развивающихся микроспорангиях [102].

WUS также экспрессируется в нуцеллусе – дистальной части семязачатка. В растениях, у которых отсутствует экспрессия WUS в семязачатке, не формируются наружный и внутренний интегументы [104, 105]. Напротив, эктопическая экспрессия WUS в халазе достаточна для формирования в нижней части семязачатка дополнительных структур, похожих на интегументы [104–106]. Также в семязачатках растений с потерей функции WUS останавливается развитие зародышевого мешка или мегаспора вообще не формируется. Согласно генетическому анализу, WUS опосредованно активирует гены WINDHOSE 1 и 2 (WIH1 и 2), кодирующие белки с GYPP-мотивом, которые стимулируют развитие мегаспоры и зародышевого мешка [106]. Тем не менее, WUS не экспрессируется в самой материнской клетке мегаспоры, его эктопическая активация в этой клетке приводит к развитию нескольких мегаспор и, в дальнейшем, зародышевых мешков. В норме экспрессия WUS в материнской клетке мегаспоры прямо репрессируется с помощью RETINOBLASTOMA-RELATED PROTEIN 1 [107]. В свою очередь, стимулятором экспрессии WUS (опосредованным или прямым) является ТФ SPL/NZZ: потеря его функции приводит к нарушению развития нуцеллуса и снижению уровня экспрессии WUS в нем [105]. Подобная схема регуляции обнаружена также у C. sativus, при этом подавление экспрессии CsSPL приводит к снижению уровня экспрессии CsWUS как в женских, так и в мужских цветках, а тычинки и семязачатки развиваются аномально. Интересно, что CsSPL и CsWUS способны к взаимодействию [108]. Напротив, эктопической экспрессии WUS в халазе и фуникулусе препятствуют белки BEL1, SEEDSTICK, SHATTERPROOF1 и 2 (возможно, образуя тримеры BEL1 + AG/SEEDSTICK/ SHATTERPROOF1/2 + SEPALLATA1/3 [109]), а также ТФ группы HD-ZIPIII [110].

WUS также является стимулятором соматического эмбриогенеза (СЭ): in vitro его эктопическая экспрессия может приводить к формированию соматических эмбрионов на безгормональной среде [111], а подавление экспрессии WUS приводит к снижению количества соматических эмбрионов [73]. Сверхэкспрессия WUS A. thaliana в гипокотильных эксплантах Gossypium hirsutum и его индуцибельная экспрессия в Capsicum chinense стимулирует развитие соматических эмбрионов, хотя дальнейшая регенерация полноценных проростков в этих случаях не наблюдается [112–114]. Индуцибельная экспрессия WUS A. thaliana в Coffea canephora также может приводить к увеличению способности к СЭ [115]. Напротив, индукция экспрессии WUS A. thaliana негативно влияет на СЭ у Picea glauca [116]. Также показано, что эктопическая экспрессия ZmWUS2 вместе с ZmBABYBOOM значительно улучшает (а в некоторых случаях делает возможной) трансформацию различных линий Zea mays и ряда других злаков за счет стимуляции регенерации [117], а использование тканеспецифичного промотора для ZmBBM и индуцибельного для ZmWUS2 сделало возможным прямой (без стадии каллуса) СЭ после трансформации зиготических эмбрионов Z. mays [118]. Активация экспрессии ортологов WUS выявлена в ходе СЭ у Vitis vinifera [119], Cocos nucifera [120], Panax ginseng [121] и других видов. У M. truncatula MtWUS экспрессируется как в эмбриогенных, так и в неэмбриогенных каллусах [122, 123], однако в эмбриогенных каллусах экспрессируется MtCLV3, что, вероятно, ограничивает транскрипцию MtWUS в зонах формирования соматических эмбрионов [122]. HaWUS у Helianthus annuus способен связываться с локусом LEC1-подобного гена HaL1L [124], предполагаемого регулятора СЭ. В ходе развития эмбрионов уровень экспрессии HaWUS постепенно увеличивается, в то время как уровень активности HaL1L снижается, что позволяет предположить репрессию гена HaL1L HaWUS [124]. Подавление транскрипции LEC1 наблюдали и после стимуляции экспрессии WUS в эксплантах A. thaliana [111].

WOX5

Ген WOX5 и его ортологи у других видов растений – одни из основных регуляторов работы КАМ. Предполагаемая потеря функции WOX5 у растений A. thaliana с мутацией wox5-1 приводит к увеличению размера клеток ПЦ, а также к увеличению и дифференцировке стволовых клеток колумеллы, что подтверждается накоплением в них гранул крахмала [125]. При этом частота делений клеток ПЦ в мутантах wox5-1 увеличивается, а число слоев клеток колумеллы уменьшается [126]. Такой же эффект потеря функции WOX5 оказывает на КАМ боковых корней, а также снижает частоту образования боковых корней [127]. Индуцируемая сверхэкспрессия WOX5 подавляет дифференцировку клеток колумеллы и боковых клеток корневого чехлика [125], а эктопическая экспрессия при ее низком уровне стимулирует клеточные деления [128]. WOX5 обычно начинает экспрессироваться в ходе эмбриогенеза после стадии 16 клеток в гипофизе, а после ее деления – в линзовидной клетке, которая дает начало ПЦ, а затем в самом ПЦ. Экспрессия WOX5 наблюдается также в примордиях семядолей [1]. Во взрослом растении, кроме ПЦ, промотор WOX5 активируется на ранних стадиях развития боковых и придаточных корней, в дальнейшем активность остается в ПЦ корня [127, 129–131].

Известные на настоящий момент мишени и регуляторы WOX5 в КАМ представлены на рис. 3. Для поддержания стволовых клеток в КАМ WOX5 репрессирует ген ТФ CDF4 (CYCLING DOF FACTOR4), стимулирующего дифференцировку клеток колумеллы, путем рекрутирования факторов TPL/TPR к его промотору. В свою очередь, факторы TPL/TPR рекрутируют деацетилазу гистонов HDA19 для удаления активирующих ацетильных групп с гистонов в промоторе CDF4. При этом WOX5 перемещается из ПЦ в стволовые клетки колумеллы [129]. Тем не менее, немобильная версия WOX5, сшитая с двумя белками GFP, также способна восстановить присутствие стволовых клеток колумеллы в мутанте wox5-1 [132], что говорит о существовании неизвестного пока механизма работы WOX5 в КАМ. Как и другие белки из ветви WUS, WOX5 способен к взаимодействию с белками HAM. Домены активности промоторов WOX5 и HAM2 перекрываются в ПЦ, а растения с мутациями ham1, ham2, ham3 и ham4 характеризуются, помимо прочего, нарушениями развития КАМ и укороченными корнями, что предполагает участие белков HAM в регуляции КАМ вместе с WOX5 [94].

Рис. 3.

Регуляторы и мишени WOX5 в КАМ (объяснения в тексте).

WOX5 подавляет дифференцировку стволовых клеток и стимулирует клеточные деления в колумелле, однако в отношении клеток ПЦ он действует частично противоположным образом, подавляя их пролиферацию. Известно, что WOX5 прямо подавляет экспрессию CYCD3;3, кодирующего циклин группы D (регулятор перехода в S‑фазу), в ПЦ [126]. Помимо WOX5, в детерминации ПЦ участвуют ТФ из семейства GRAS SHORTROOT (SHR) и SCARECROW (SCR), а также ТФ PLETHORA (PLT) из семейства AP2/ERF. Уровень экспрессии WOX5 уменьшен в растениях с мутациями по генам SHR или SCR, а потеря активности генов PLT1 и PLT2, регулирующих развитие КАМ через ауксиновый сигнальный путь, приводит к расширению домена экспрессии WOX5 [125]. В мутантах wox5-1 активность промоторов SHR, SCR, PLT1 и 2 в ПЦ и в КАМ в целом значительно снижена, а эктопическая активация WOX5 в клетках колумеллы приводит к активации промоторов PLT1 и 2 (но не SHR и SCR). Таким образом, возможно, WOX5 необходим для активации PLT1 и 2 в ПЦ [128, 130]. Согласно данным генетического анализа WOX5 вместе с SCR, SHR, PLT1 и 2 поддерживает также проксимальные стволовые клетки КАМ [125]. При этом ТФ TCP20/21 из семейства TCP (TEOSINTE BRANCHED 1, CYCLOIDEA AND PCF TRANSCRIPTION FACTOR), SCR и PLT образуют комплекс и активируют WOX5 в ПЦ [133, 134]. Также ТФ JACKDAW (JKD) с цинковыми пальцами, взаимодействуя в ПЦ с SHR, активирует экспрессию WOX5 [135].

Исследования взаимодействия WOX5 с фитогормонами посвящены главным образом ауксину. В растениях с мутациями по генам MP или BODENLOS с нарушением ауксинового ответа в эмбриогенезе экспрессия WOX5 практически никогда не детектируется [125], однако обработка ауксином ингибирует экспрессию WOX5 в главном корне. В подавлении экспрессии WOX5 ауксином участвуют ауксин-чувствительные ТФ ARF10 и 16 [130], а INDOLE-3-ACETIC ACID INDUCIBLE 17 (IAA17), ингибитор ауксинового ответа, стимулирует экспрессию WOX5 [136]. WOX5 также влияет на сигнальные пути ауксина: в норме максимальный ауксиновый ответ в КАМ выявляется в ПЦ, однако при потере функции WOX5 он смещается из ПЦ в более дистальные клетки. Кроме того, WOX5 стимулирует продукцию ауксинов в корнях, способствуя экспрессии YUCCA1, кодирующего один из ферментов синтеза ауксина [136].

Экспрессия WOX5, как и WUS, регулируется также пептидом CLE. CLE40 является близким гомологом CLV3. Этот ген экспрессируется в дифференцированных клетках колумеллы и в зоне дифференцировки в клетках стелы. Он подавляет деление стволовых клеток колумеллы и ограничивает домен экспрессии WOX5. Обработка растений синтетическим пептидом CLE40 приводит к уменьшению домена экспрессии WOX5 и к его перемещению в более проксимальные зоны корня (туда же перемещается в этом случае и сам ПЦ, согласно анализу экспрессии других его маркеров) [132]. В рецепции CLE40 и регуляции КАМ участвуют рецепторные киназы ARABIDOPSIS CRINKLY4 (ACR4) [131], CLV1 [137] и белок CLV2 [132]. Интересно, что ACR4 способна фосфорилировать WOX5 in vitro по нескольким сайтам [138]. Дальнейший путь передачи сигнала от киназ до регуляции экспрессии WOX5 не выявлен, однако на экспрессию WOX5, как и WUS, оказывают стимулирующее влияние фосфатазы POL и PLL1 [139]. Обратная связь – стимулирующее воздействие WOX5 на экспрессию CLE40 – у A. thaliana не выявлена, однако обнаружена у гомологов данных генов в КАМ у O. sativa [140]. К другим прямым репрессорам WOX5 относится ТФ ROW1/BARD1. Кодирующий его ген экспрессируется в проксимальной части КАМ, и потеря его функции приводит к развитию коротких корней, нарушению гравитропизма, к потере идентичности ПЦ и другим нарушениям КАМ, а также к расширению домена активности промотора WOX5 [141].

WOX5 и его ортологи активируются также при взаимодействии корней растения с различными симбионтами и/или при развитии нерегулярных меристематических структур. В частности, экспрессия WOX5 активируется в ходе развития корневых галлов при инфицировании нематодой Meloidogyne javanica [142]. Активность промотора WOX5 A. thaliana обнаружена в клетках, прилежащих к меристематическим очагам в генетических опухолях Raphanus sativus [143]. Экспрессия ортологов WOX5 обнаружена в азотфиксирующих клубеньках у M. truncatula, Pisum sativum [144] и Arachis hypogaea [145]. Генетический анализ показал, что количество клубеньков и экспрессия MtWOX5 и его ортолога PsWOX5 в M. truncatula и в P. sativum регулируются, как и в случае КАМ и ПАМ, с помощью генов системы CLAVATA [144]. Экспрессия ортологов WOX5 обнаружена также при прямой и непрямой регенерации корней и при каллусообразовании in vitro, в частности, у M. truncatula [122], Rosa canina [146] и A. thaliana [74]. Экспрессия WOX5 при регенерации корней активируется ТФ WOX11 и 12 (см. ниже). Интересно, что уровень экспрессии WOX5 и других корнеспецифичных генов A. thaliana возрастает при формировании каллуса на среде CIM [147, 148], но снижается при переносе на SIM. Значительную роль в активации WOX5 и других корнеспецифичных генов в каллусе играет ацетилтрансфераза гистонов HAG1 (HISTONE ACETYLTRANSFERASE of the GNAT/MYST superfamily 1), ацетилирующая H3 в локусах WOX5 и 14, SCR, PLT1 и 2 [149]; активация данных генов в каллусе важна для дальнейшей регенерации побегов.Рис. 4.

Рис. 4.

Органы и ткани A. thaliana, на развитие и функционирование которых влияют ТФ WOX. WUS регулирует функционирование ПАМ, меристемы соцветия и меристемы цветка, WOX9 участвует в функционировании ПАМ, WOX1 и WOX3 важны для разрастания боковых органов побега, WOX4 и 14 регулируют работу камбия и прокамбия, WOX5 контролирует функции КАМ, WOX5, 7 и 14 участвуют в развитии боковых корней, WOX11, 12, 5 и 7 регулируют развитие придаточных корней, WOX13 и 14 контролируют сроки цветения, WUS и WOX14 регулируют развитие тычинок, WOX6 и WUS важны для развития семязачатков, WOX13 регулирует развитие плода, WOX2, 8, 9, 1, 3, 5 участвуют в эмбриогенезе.

WOX5 необходим также для прохождения СЭ у A. thaliana: подавление его экспрессии в эксплантах значительно снижает количество формируемых соматических эмбрионов и нарушает их развитие. Для формирования нормального паттерна экспрессии WOX5 при СЭ необходим цитокининовый сигнальный путь. Возможно, цитокинин ограничивает зону экспрессии WOX5, делая возможным формирование ПЦ КАМ [74]. WOX5 также экспрессируется в ходе развития мужского гаметофита. У мутантов tepiztin1 со сниженным уровнем экспрессии WOX5 нарушено функционирование мужского гаметофита, в частности, их пыльцевые трубки растут медленнее и имеют меньшие размеры [150].

WOX1

Основная функция WOX1 и его ортологов – регуляция разрастания боковых органов. Одиночные мутанты A. thaliana с потерей функции WOX1 лишь незначительно отличаются от растений дикого типа, однако потеря функции WOX1 и другого гена WOX современной клады – WOX3/ PRESSED FLOWER (PRS) – приводит к значительным изменениям: листовые пластинки, чашелистики и лепестки таких растений значительно сужены вследствие снижения количества делений клеток; у них нарушена также спецификация клеток кромок листа [151]. WOX1 экспрессируется на стадии сердца и торпеды в закладывающихся сосудах [1], а после прорастания WOX1 и 3 экспрессируются в кромках и срединных слоях примордиев листьев (в так называемом срединном домене листа) [151]. Интересно, что потеря функции WUS усиливает эффект от потери функции WOX1 и 3, в частности, делая листья мутантов еще более узкими. Можно предположить, что WUS также принимает участие в регуляции разрастания листовой пластинки [152]. В развитии листа ТФ семейства YABBY и KANADI определяют развитие абаксиального домена, а ТФ AS2 и REV – развитие адаксиального домена. Согласно анализу множественных мутантов, WOX1 и 3 вместе с данными факторами также участвуют в формировании адаксиально-абаксиальной полярности листа [151, 153]. При этом ТФ YABBY стимулируют активность WOX1, а ТФ KANADI, напротив, подавляют [151]. Другие репрессоры WOX1 и 3 – ТФ из семейств NGATHA (NGA) и CINCINNATA-class-TCP (CIN-TCP), такие как TCP3, TCP4, NGA1 и NGA4, участвуют в подавлении роста листовой пластинки. Растения A. thaliana со сниженным уровнем экспрессии TCP1-5 и NGA1-4 имеют курчавые листья и расширенный домен активности промоторов WOX1 и 3 [154].

Уровень экспрессии WOX1 и 3 также регулируется ауксином. В абаксиальной части листовых примордиев содержание ауксина повышено, однако промоторы MP и ряда других ARF (NONPHOTOTROPIC HYPOCOTYL4 (NPH4)/ARF7, ARF6, 8 и 19) активны преимущественно в адаксиальной части примордиев. Срединный домен является единственной зоной перекрывания экспрессии MP, ARF6, 7, 8 и 19 и повышенного содержания ауксина; именно в этой зоне активны промоторы генов WOX1 и 3. При этом MP активирует WOX1 и 3, связываясь с их локусами. Напротив, гены ARF3 и, вероятно, 2 и 4 экспрессируются в абаксиальной части примордия на определенных стадиях его развития, и кодируемые ими ТФ подавляют экспрессию WOX1 и 3 [155]. WOX1 также регулирует ауксиновый ответ: cогласно транскриптомному анализу, многие из генов, на экспрессию которых влияет WOX1, участвуют в сигнальных путях, транспорте и синтезе ауксина. Так, положительная регуляция характерна для PIN1, AUX1 и MP, а отрицательная, например, для TAR2 и YUC5 [156]. Также WOX1 способен к взаимодействию с S-АМDC1 (S-adenosylmethionine decarboxylase) – ферментом синтеза полиаминов, важных регуляторных молекул растений, а в мутантах со сверхэкспрессией WOX1 уровень полиаминов снижен. Таким образом, WOX1 регулирует развитие латеральных органов, возможно, за счет регуляции синтеза полиаминов [157].

Механизмы работы генов группы WOX1 подробно изучены у ортолога WOX1 M. truncatula – гена STENOFOLIA (STF). В отличие от растений A. thaliana с потерей функции WOX1, не имеющих выраженных фенотипических особенностей, мутанты M. truncatula с потерей функции STF характеризуются узкими листовыми пластинками, нарушениями в формировании проводящей системы листа, а также нарушенным разрастанием лепестков и плодолистиков [158]. STF регулирует разрастание листовой пластинки, связываясь с промотором гена MtAS2, подавляющего пролиферацию клеток в адаксиальном домене листа, и подавляя его экспрессию путем привлечения корепрессора MtTPL [159]. STF способен взаимодействовать с корепрессором (и возможным коактиватором) MtLEUNIG (MtLUG) и коактиватором MtANGUSTIFOLIA3 (MtAN3), а генетический анализ мутаций в генах AN3, LUG, WOX1 и 3 у A. thaliana позволяет предположить, что AN3 и LUG участвуют в разрастании листовой пластинки вместе с WOX3 и WOX1 [160]. Экспрессия STF в различных видах злаков может приводить, помимо прочего, к развитию более широкой листовой пластинки. STF способен подавлять экспрессию генов цитокининоксидаз, увеличивая содержание цитокининов в трансгенных растениях [161], а также участвовать в регуляции метаболизма сахаров [162]. Гены, ортологичные WOX1 и STF – LATHYROIDES у P. sativum [163] и MAEWEST у P. hybrida – также необходимы для нормального разрастания боковых органов, в частности листьев и лепестков [164].

WOX3

WOX3, как и WOX1, участвует в регуляции разрастания боковых органов. У растений A. thaliana с мутацией в гене WOX3, или PRESSED FLOWER (PRS), не развиваются боковые чашелистики, а в абаксиальных и адаксиальных чашелистиках отсутствуют краевые ряды клеток. Число тычинок также уменьшено [165, 166]. Гораздо более серьезные дефекты развития наблюдаются у двойных мутантов A. thaliana с потерей функции WOX3 и WOX1 (см. раздел о WOX1). Интересно, что ортолог WOX3 у M. truncatula – ген LOOSE FLOWER (LFL) – в отличие от своего ортолога WOX3 и паралога STF не участвует в развитии листьев, но необходим для разрастания органов цветка. Согласно результатам генетического и комплементационного анализа, гены STF и LFL обладают функциональным сходством, однако они имеют разные домены экспрессии, что и определяет различия в их функциях в развитии растения [167].

Согласно данным филогенетического анализа, гены группы WOX1 специфичны для двудольных и не встречаются у однодольных [168]. Разрастание боковых органов у однодольных регулируется генами ветви WOX3. Так, потеря функции ортологов WOX3 NARROW SNEATH1 (NS1) и 2 у Z. mays приводит к отсутствию боковых доменов листьев и гомологичных им органов. Эти гены экспрессируются в боковых частях ПАМ (в слоях L1 и L2) и в кромках примордиев боковых органов [166, 169]. У риса ортологами NS1/2 являются гены NARROW LEAF2(NAL2)/3, или ген OsWOX3A/ OsPRS/OsNS, представленный двумя практически идентичными копиями. Cверхэкспрессия NAL2/3 приводит, помимо других эффектов, к развитию растений с более широкими листьями с большим количеством проводящих пучков [170]. У растений с одновременной потерей функции генов NAL2 и 3 наблюдается значительное недоразвитие листовых пластинок, у них отсутствуют щетинки на краях листа и нарушено развитие проводящих пучков в листьях [170, 171]. У таких мутантов нарушена экспрессия генов ARF, YUC и PIN, что предполагает изменение в сигнальных путях, транспорте и синтезе ауксина [170, 171], а согласно генетическому анализу и другим экспериментам, NAL2/3 непосредственно подавляет экспрессию OsYAB3. Как OsYAB3, так и NAL2/3 участвуют, предположительно, в дифференцировке листа, в частности, путем регуляции экспрессии генов семейства KNOX (OSH1 и OSH3) [172]. Другой эффект потери функции NAL2 и 3 – уменьшение количества боковых корней и увеличение количества корневых волосков. Эксперименты с обработкой ауксином позволяют предположить, что оба эти эффекта связаны с уменьшением уровня экспрессии генов OsPIN1 и с концентрацией ауксина не в перицикле, а в эпидермисе, что и приводит к снижению количества боковых корней, которые закладываются в перицикле, но при этом к увеличению количества и длины корневых волосков, которые развиваются из клеток эпидермиса [171, 173]. Сверхэкспрессия NAL2/3 приводит не только к изменениям фенотипа листьев, но и к увеличению количества боковых корней, а также к карликовости. Обработка гиббереллином восстанавливает нормальную высоту растения. NAL2/3 взаимодействует с гиббереллинами по принципу отрицательной обратной связи: их избыток стимулирует экспрессию NAL2/3, тогда как NAL2/3 подавляет синтез этих гормонов, в частности, связываясь с локусом KAO (ENT-KAURENE ACID OXIDASE), кодирующим фермент биосинтеза гиббереллинов, и подавляя его экспрессию [174].

Согласно данным филогенетического анализа, у однодольных (по меньшей мере у риса и кукурузы) имеется дополнительная ветвь, содержащая гомологи WOX3, отличные от генов группы NS [175]. Подробно изучены функции одного из представителей этой ветви – гена OsWOX3B/GLABROUS RICE1 (GLR1)/DEPILOUS (DPL)/NUDA/LEAF LATERAL SYMMETRY1 (LSY1) O. sativa. Подавление экспрессии этого гена приводит к отсутствию трихомов или к сильному уменьшению их количества на листьях и колосковых чешуйках [176–178]. OsWOX3B стимулирует развитие трихомов совместно с ТФ из группы AP2/ERF HAIRY LEAF6 (HL6), близким гомологом ТФ EMBRYOMAKER (его сверхэкспрессия также приводит к развитию трихомов на семядолях A. thaliana). OsWOX3B способен к взаимодействию с HL6, также он непосредственно активирует HL6 [179]. OsWOX3B и HL6 прямо или опосредованно стимулируют экспрессию ряда генов, вовлеченных в синтез, транспорт и передачу сигнала ауксина, таких как OsYUCCA5, OsPIN1a, OsARF4 и 7. HL6 способен связываться с локусом OsYUCCA5, а добавление гомеодомена OsWOX3B усиливает это связывание [179]. OsWOX3B, независимо от NAL2/3, участвует и в разрастании листовой пластинки. Один из эффектов потери его функции – формирование несимметричных листовых пластин из-за отсутствия латеральных разрастаний с одной из сторон листа и нарушение адаксиально-абаксиальной полярности. Кроме того, соцветия у таких мутантов часто не имеют колосковых чешуй, а развитие тычинок и семязачатков у них нарушено [180].

Ортологи WOX3 у голосеменных, как и у покрытосеменных, также участвуют в разрастании боковых органов. Так, подавление экспрессии гена PaWOX3 P. abies – ортолога WOX3 – нарушает развитие семядолей у соматических эмбрионов, а также влияет на морфологию иголок, делая их менее уплощенными и более цилиндрическими [181].

WOX2

WOX2 вместе с ТФ WOX8 и WOX9 регулирует эмбриональное развитие. Ген WOX2 начинает экспрессироваться в яйцеклетке и в центральной клетке. Вместе с WOX2 в этих клетках экспрессируется WOX8, член промежуточной ветви, однако после оплодотворения и деления зиготы эти гены начинают экспрессироваться в разных ее потомках: WOX8 – в базальной клетке (см. раздел о WOX8), а WOX2 – в основном в апикальном домене [1]. Экспрессия ортологов WOX2 в зиготических эмбрионах и/или в семенах в целом выявлена также у N. tabacum [182], O. sativa [183], P. abies [184] и других видов. Потеря функции WOX2 приводит к нарушению упорядоченности деления клеток в апикальном домене, что в данном случае не критично для развития растения [1]. У растений с потерей функции WOX2 в некоторых случаях развивается только одна семядоля, часто нарушен сосудистый паттерн в семядолях [185, 186]. Как уже сказано, в ходе раннего эмбриогенеза WOX2 и 8 экспрессируются в комплементарных друг другу областях, однако у части растений с мутациями в обоих генах наблюдаются различные дефекты семядолей (асимметричные семядоли, частичное их слияние), которые отсутствуют у одиночных мутантов [187]. WOX2 и 8 с помощью пока не выявленного механизма активируют транскрипцию CUP-SHAPED COTYLEDON2 (CUC2) и 3, обеспечивая симметричный характер их экспрессии. Предполагается, что потеря функции WOX2 активирует экспрессию WOX8 в апикальном домене, что, возможно, приводит к их избыточности в регуляции развития семядолей [186].

Одновременная потеря функции генов WOX2, 1 и 3 увеличивает частоту возникновения нарушений развития семядолей (по сравнению с потерей функции только WOX2). Добавление потери функции WOX5 усиливает эти дефекты. Ключевую роль в регуляции клеточных делений апикального домена играет WOX2, а активность остальных генов в этих процессах становится важной только в отсутствие этого гена [185]. Кроме того, WOX2 вместе с генами WOX1, 3 и 5, играющими второстепенные роли, участвует в инициации ПАМ в эмбриогенезе и в первичной активации экспрессии маркеров ПАМ, включая CLV3. Интересно, что промотор CLV3 на стадии сердца активируется за счет WOX1, 2, 3, 5 даже у мутантов wus-1, хотя в дальнейшем его активность пропадает. Таким образом, WOX1, 2, 3, 5, но не WUS, необходимы для запуска экспрессии CLV3 в эмбриогенезе. Нарушение инициации ПАМ у растений с мутациями в генах WOX1, 2, 3 и 5 сопровождается повышением интенсивности ауксинового ответа в зоне ПАМ, что может быть связано с нарушением паттернов экспрессии гена PIN1 в эмбрионах с таким генотипом. Также WOX2 (вместе с WOX1, 3 и 5) стимулирует развитие ПАМ, усиливая экспрессию HD-ZIPIII (PHB, PHV, REV) как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровнях. PHB, PHV и REV в свою очередь активируют биосинтез цитокининов, необходимых для закладки ПАМ [188].

Ортологи WOX2 экспрессируются также в ходе СЭ у P. pinaster [189], P. abies [184], V. vinifera [119] и ряда других видов. Подавление экспрессии PaWOX2 у P. abies приводит к нарушению развития соматических эмбрионов [184], а WOX8 и WOX2 A. thaliana совместно индуцируют СЭ или регенерацию побегов N. tabacum in vitro [190].

WOX4

WOX4 и его ортологи у большинства видов растений регулируют развитие проводящих тканей. Так, снижение уровня экспрессии WOX4 A. thaliana приводит к уменьшению размера проводящих пучков и нарушению упорядоченной структуры стелы, перицикла и эндодермы. Потеря функции WOX4 у мутантов wox4-1 снижает активность пучкового и межпучкового камбия в стебле, хотя его активность исчезает не полностью [191]. WOX4 экспрессируется в основном в камбии и прокамбии. Активность ортологов WOX4 в камбии выявлена у многих видов растений, включая голосеменные [192].

Роль WOX4 в регуляции развития проводящих тканей изучена в основном в рамках исследования работы сигнального модуля TDIF-TDR-WOX4. TDIF (TRACHEARY ELEMENT DIFFRENTIATION INHIBITORY FACTOR) – CLE-пептид, кодируемый двумя разными генами A. thaliana – CLE41 и CLE44. TDIF и его рецептор TDR (TDIF RECEPTOR)/PXY(PHLOEM INTERCALATED WITH XYLEM) известны как регуляторы, подавляющие дифференцировку клеток камбия в ксилему и стимулирующие пролиферацию камбия [193]. Уровень экспрессии WOX4 повышается в камбии A. thaliana в ответ на обработку TDIF. WOX4, в отличие от TDR и TDIF, не относится к белкам, необходимым для подавления дифференцировки ксилемы, однако, как и эти регуляторы, важен для стимуляции пролиферации клеток прокамбия и камбия. При этом сверхэкспрессия WOX4 не вызывает утолщения стелы, что предполагает присутствие системы отрицательной обратной связи, нейтрализующей влияние излишней активности WOX4. Кроме того, сверхэкспрессия WOX4 не влияет на уровни экспрессии CLE41 и 44 [193]. Показано также, что ортологи WOX4 не влияют на интенсивность экспрессии ортологов CLE41 у гибридов тополя [194]. TDR-зависимое повышение уровня экспрессии WOX4 в проростках наблюдается также при обработке CLE-пептидом HsCLEB типа B, который синтезируют паразитические нематоды Heterodera schachtii, и который, по-видимому, является аналогом TDIF, мимикрирующим под него. Промотор WOX4 активируется при заражении нематодой на определенных этапах развития синцития – структуры, питающей нематоду [195].

Ауксин активирует экспрессию WOX4, что, в свою очередь, индуцирует развитие межпучкового камбия и способствует делению клеток внутри проводящих пучков. При этом TDR/PXY необходим для стабильной активации экспрессии WOX4 ауксином. Усиление камбиальной активности ауксином зависит от клеточного контекста, что, вероятно, связано со специфическими ауксин-чувствительными ТФ [191]. Так, MP ограничивает количество клеток камбия в стебле, прямо репрессируя ген WOX4. В то же время другие ARF (ARF3 и 4), наоборот, стимулируют активность камбия. При этом MP работает в самом камбии, в клетках, экспрессирующих WOX4, а ARF3 и ARF4 – и в камбии, и за его пределами – в ксилеме и флоэме [196]. Тем не менее, в другом исследовании показано положительное влияние MP на WOX4 и на развитие камбия в корне. Обнаружено, что прилегающий непосредственно к камбиальной зоне слой клеток с уже установленной ксилемной идентичностью выполняет функции ОЦ, поддерживающего работу камбия. Там сосредоточен локальный максимум индолилуксусной кислоты (ИУК), и экспрессируются гены группы HD-ZIPIII и MP, поддерживая идентичность этого слоя. Подавление экспрессии MP на фоне потери функции ARF7 и 19 снижает уровень транскрипции WOX4, ряда генов HD-ZIPIII, а также дифференцировки вторичной ксилемы. Индукция экспрессии miR-165a, ингибитора всех пяти HD-ZIPIII, снижает уровень активности камбия и также подавляет экспрессию WOX4 [197]. В регуляции пролиферации клеток проводящих тканей WOX4 действует совместно с WOX14 (см. WOX14) [198]. Кроме того, сверхэкспрессия WOX4, как и потеря его функции, снижает уровень экспрессии WOX14 [199]. WOX4 способен взаимодействовать с белками группы HAM, а домены активности промоторов HAM4 и WOX4 перекрываются в меристемах проводящих тканей [94].

У O. sativa ортолог WOX4 не только регулирует развитие проводящей системы, но и участвует в поддержании ПАМ и развитии листьев. При подавлении экспрессии OsWOX4 формируются аномальные ПАМ, которые быстро терминируются, наблюдается нарушение закладки и роста листьев, а также развития их проводящей системы [200, 201]. При этом CLE-пептиды FCP1/2 подавляют экспрессию OsWOX4 и стимулируют развитие листьев [201]. С помощью транскриптомного анализа и определения содержания гормонов показано, что OsWOX4 стимулирует синтез цитокининов путем активации экспрессии генов группы LOG [200].

Гены группы WOX4, как и многие другие гены WOX, участвуют не только в развитии проводящей системы и ПАМ, но и в регенерации: ортологи WOX4 экспрессируются в развивающихся эмбриогенных каллусах Coffea canefora [202], M. truncatula [203], в соматических эмбрионах V. vinifera [119] и других видов.

WOX6

WOX6/PRETTY FEW SEEDS2 (PFS2)/HIGH EXPRESSION OF OSMOTICALLY RESPONSIVE GENES 9 (HOS9) регулирует развитие семязачатков. PFS2 экспрессируется в ПАМ и в примордиях листьев, в меристемах цветка, примордиях органов цветка, пыльниках, пестиках и семязачатках, а также, в меньшей степени, – в плодолистиках, лепестках и чашелистиках. У растений с нарушением функции этого гена (pfs2-1) уменьшена материнская клетка мегаспор и, по-видимому, вследствие этого нарушено развитие зародышевого мешка. У мутантов pfs2-1 формируется намного меньше жизнеспособных семязачатков, чем у растений дикого типа. Также у них укорочены интегументы, нарушено развитие лепестков и листьев. Эта мутация проявляется на стадии спорофита: гетерозиготные растения PFS2/pfs2-1 формируют нормальные семязачатки. [204, 205]. PFS2, по-видимому, участвует также в подавлении экспрессии AG [205], а возможными репрессорами экспрессии самого PFS2 могут быть LRR-киназы ERECTA и ERECTA-LIKE1 и 2 [206].

Анализ другой мутации в гене WOX6 показывает, что этот ген участвует в ответе на холодовой стресс: мутанты hos9-1 со вставкой Т-ДНК в 3′-часть гена обладают большей чувствительностью к отрицательным температурам, у них повышены уровни экспрессии ряда генов, вовлеченных в ответ на холод. Эти мутанты отличаются более медленным ростом корней и побегов, а также более поздним цветением, они имеют узкие и мелкие листья и меньшее количество трихомов [207].

WOX7

WOX7 регулирует развитие боковых корней. Промотор гена WOX7 активен в кончиках корней в клетках-инициалях кортекса и эндодермы и в самой эндодерме, а также в примордиях боковых корней, преимущественно до их появления на поверхности корня. У растений с мутацией в WOX7 повышено количество боковых корней и примордиев боковых корней, а сверхэкспрессия WOX7 приводит к снижению числа боковых корней. WOX7 подавляет экспрессию гена циклина CYCD6;1, однако у растений с мутацией в CYCD6;1 количество боковых корней даже немного больше, чем у растений дикого типа. Активность промотора WOX7 при этом подавляется при обработке ауксином, что соответствует противоположным ролям этих регуляторов в контроле заложения боковых корней. Добавление в среду глюкозы или сахарозы активирует промотор WOX7. Высокие концентрации этих сахаров при повышенном соотношении содержания углерода и азота подавляют образование боковых корней, однако этот эффект отсутствует в растениях с нарушением функции WOX7. Таким образом, возможно, WOX7 опосредует ингибирующее действие сахаров на образование боковых корней [208].

WOX8

WOX8/STIMPY-LIKE (STPL), как уже упоминалось, является регулятором эмбриогенеза, он участвует в формировании апикально-базальной оси полярности зародыша. WOX8 экспрессируется в яйцеклетке и в центральной клетке, а после оплодотворения и деления зиготы – в базальной клетке и ее потомках, клетках суспензора и гипофизы, и в части эндосперма [1]. У растений с потерей функции WOX8 часто нарушен сосудистый паттерн в семядолях, а ауксиновый максимум в базальном полюсе распространяется на весь суспензор, в отличие от растений дикого типа, у которых он локализован лишь в базальной части эмбриона и в самой верхней части суспензора. Возможно, WOX8 активирует экспрессию PIN7 и обеспечивает отток ауксина из суспензора [186]. Функции WOX8 в эмбриогенезе частично выполняют также гены WOX2 и WOX9 (см. соответствующие разделы). Важный регуляторный модуль, включающий (по меньшей мере, до настоящего времени) WOX8, но не WOX2 и 9, связан с CLE8 – пептидом из группы CLE. CLE8 экспрессируется в эмбрионе и в эндосперме. У растений с потерей функции CLE8 эндосперм недоразвит, а развитие эмбрионов и суспензора нарушено. CLE8 необходим также для активации WOX8 в суспензоре и эндосперме. Сверхэкспрессия CLE8 ведет к увеличению размера семян, однако потеря функции WOX8 снимает этот эффект. Вероятно, WOX8 опосредует влияние CLE8 на развитие эмбриона и эндосперма [209].

WOX8 вместе с WOX9 участвует в формировании апикально-базальной оси полярности. Согласно данным генетического анализа, для их активации необходим ТФ WRKY2 с доменом типа “цинковые пальцы” [210]. Транскрипцию WOX8 совместно активируют ТФ WRKY2 и ТФ из семейства HD-ZIPIV HOMEODOMAIN GLABROUS11/12 (HDG11/12). Активация ТФ WRKY2 опосредуется киназой SHORT SUSPENSOR, мРНК которой поступает в зиготу из спермия. В то же время HDG11/12 экспрессируются в яйцеклетке, т.е. для активации WOX8 необходимо совместное действие и материнских, и отцовских факторов [211].

WOX9

WOX9/STIMPY A. thaliana известен прежде всего как регулятор эмбрионального развития, однако у ряда видов его ортологи являются важными участниками развития соцветий. WOX9 регулирует прохождение ранних стадий эмбриогенеза. Данные об экспрессии WOX9 в эмбриогенезе отчасти противоречивы, однако известно, что он начинает экспрессироваться после первого деления зиготы либо в базальной, либо в обеих клетках, затем в гипофизе и в самом эмбрионе, а в дальнейшем – в наружных слоях зародыша и в примордиях семядолей [1, 187]. Интересно, что в эмбрионах с нарушением функции MP или BODENLOS (гена репрессора ауксинового ответа из группы Aux/IAA) не наблюдается сдвиг экспрессии WOX9 из гипофизы в собственно эмбрион [1]. Различные мутации в гене WOX9 приводят к нарушению эмбриогенеза: недоразвитию базальной части зародыша, гипокотиля и семядолей и другим дефектам, и/или остановке развития на глобулярной стадии, или раньше, снижению частоты клеточных делений [187, 212]. Однако согласно другому исследованию, растения с мутацией в WOX9 не имеют дефектов в развитии эмбрионов [185]. WOX8 – близкий гомолог WOX9, и его экспрессия под промотором WOX9 способна комплементировать мутацию в WOX9 [187]. У части двойных мутантов с предполагаемой потерей функции генов WOX8 и 9 наблюдаются нарушения в делениях клеток апикального и/или базального домена и остановка развития до формирования семядолей. У таких эмбрионов нарушены домены активности промоторов генов-маркеров различных частей зародыша, в том числе WOX8, WOX2, WOX5 и ZWILLE [185, 187]. Кроме того, для этих эмбрионов характерно нарушение экспрессии PIN1 и, вероятно, вследствие этого отсутствие максимумов ауксина в зародыше [185, 187]. Эктопическая активность WOX2 в эмбрионе и суспензоре способна частично восстановить нормальный фенотип эмбрионов данных мутантов [185]. Также потеря функции DWARF TILLER1 (DWT1) и DWT-LIKE2 (DWL2) – двух из трех ортологов WOX8/9 у O. sativa – приводит к летальности эмбрионов [213]. Гены группы WOX9 участвуют также и в СЭ: повышенный уровень экспрессии ортологов WOX9 в ходе СЭ обнаружен у M. truncatula [214], P. abies [16] и других видов. Сверхэкспрессия MtWOX9-1 стимулирует СЭ у M. truncatula [215], а подавление экспрессии PaWOX8/9 у P. abies приводит к нарушению морфологии соматических эмбрионов и развитию на их основе вторичных соматических эмбрионов [216].

Вскоре после прорастания экспрессия WOX9 наблюдается в ПАМ и примордиях листьев, а затем в меристемах цветков и развивающихся органах цветка на начальных стадиях роста, а также в эпидермисе плаценты [1, 212], в растущей перегородке плода и в верхней части КАМ [212]. Одна из мутаций в WOX9 приводит к нарушению развития ПАМ: через несколько дней после прорастания она полностью дифференцируется. WOX9 важен для поддержания экспрессии WUS и CLV3 после прорастания. Тем не менее, функции WOX9 не ограничиваются, по-видимому, активацией WUS, поскольку после прекращения функционирования ПАМ мутанты с нарушением функции WOX9 не формируют ни листьев, ни вторичных побегов, в отличие от мутантов с потерей функции WUS. Интересно, что при проращивании на среде с сахарозой, которая стимулирует деление клеток, такие мутанты развиваются практически нормально. После перехода ПАМ в стадию репродуктивного роста сахароза перестает быть необходимой. WOX9 не экспрессируется в меристеме соцветия и, по-видимому, не требуется для ее функционирования [212]. Обнаружено, что по меньшей мере одной из непосредственных мишеней WOX9 является ген циклина CYCP2;1, регулирующего переход G2/M клеточного цикла. Сахароза также способна активировать CYCP2;1 [217].

Ортологи WOX9 у пасленовых участвуют в регуляции развития соцветия. Так, ТФ EVERGREEN (EVG) P. hybrida – гомолог WOX9 и WOX8 – отвечает за архитектуру соцветия. P. hybrida имеет цимозное соцветие: в ходе его развития апикальная меристема делится на две: латеральную и меристему цветка. Меристема цветка образует цветок, а латеральная продолжает расти и занимает место апикальной. Затем этот цикл повторяется, и развивается зигзагообразное соцветие. EVG экспрессируется в меристеме соцветия, но не в меристеме цветка. У растений с мутацией в гене EVG меристемы соцветия не разделяются и продолжают формировать единый стебель, хотя и утолщенный. Через несколько узлов такие меристемы разделяются на несколько ветвей, и цикл повторяется. Кроме того, ни одна из этих меристем не может сформировать цветок [218, 219]. Согласно результатам генетического анализа, в норме EVG тем или иным способом активирует экспрессию DOUBLE TOP (DOT), гомолога UFO A. thaliana, белковый продукт которого, взаимодействуя с гомологом LEAFY – белком ALF (ABERRANT LEAF AND FLOWER), обеспечивает формирование цветков [218]. Также ортолог WOX9 у S. lycopersicum – ген COMPOUND INFLORESCENSE (S) – участвует в регуляции ветвления соцветия; мутации в этом гене или его промоторе могут приводить к возникновению сильно разветвленного соцветия [45, 220], что связано с замедленным переходом вегетативной меристемы в меристему соцветия и замедленным переходом меристемы соцветия в меристему цветка, в результате чего рядом с ними успевает сформироваться больше новых вегетативных меристем и меристем соцветия, чем в норме [221]. Как и EVG, S активирует ортолог UFO, ген ANANTHA, в меристеме цветка [220]. Сходные взаимоотношения и функции выявлены у ортологов данных генов Capsicum annuum [222].

По меньшей мере один из ортологов WOX8 и 9 O. sativa, DWT1, участвует в регуляции баланса между ростом боковых побегов и основного побега. В норме эти побеги имеют одну высоту, однако потеря функции DWT1 (мутация dwt1), не влияя на высоту основного побега, приводит к уменьшению длины боковых побегов. DWT1 экспрессируется в различных частях растения, включая эмбрион, кончик корня и молодые метелки, но не в удлиняющихся междоузлиях, там также не детектируется его белковый продукт. Вероятно, действие этого ТФ приводит к возникновению пока не идентифицированного мобильного сигнала, влияющего на удлинение междоузлий [223]. Среди генов, экспрессия которых изменена в междоузлиях растений с потерей функции DWT1, много генов, связанных с цитоскелетом и делением клеток, а также с метаболизмом и сигнальными путями цитокининов. Также в междоузлиях мутантов dwt1 O. sativa повышен уровень экспрессии гена, кодирующего фермент OsGIBBERELLIN 2-OXIDASE 1 (OsGA2OX1), инактивирующий гиббереллины, снижен уровень экспрессии гена, участвующего в биосинтезе гиббереллинов (OsENT-COPALYL DIPHOSPHATE SYNTHETASE 1), и уменьшена интенсивность ответа на экзогенный гиббереллин [223]. DWT1 и его близкий гомолог DWT-LIKE2 (DWL2) способны к взаимодействию с OsPIP5K1, ферментом, вовлеченным в синтез важнейшего вторичного посредника – фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата. Потеря функции OsPIP5K1 приводит к развитию растений с укороченными основным и боковыми побегами, а сверхэкспрессия OsPIP5K1 частично компенсирует дефекты мутантов dwt1, увеличивая длину боковых побегов, возможно, за счет взаимодействия OsPIP5K1 с DWL2 [213].

WOX11 и 12

WOX11 и его близкий гомолог WOX12 известны в первую очередь как регуляторы каллусообразования и развития придаточных корней, т.е. корней, которые возникают из некорневых органов, а также при регенерации in vitro или после поранения. У растений с мутациями в гене WOX11 и/или 12 придаточные корни на листовых эксплантах образуются медленнее, а их количество снижено. Сверхэкспрессия WOX11 приводит к усиленному формированию придаточных корней и каллуса у эксплантов на среде без гормонов и к усилению каллусообразования на среде CIM [224]. При регенерации корней на безгормональной среде из листовых эксплантов активность промоторов WOX11 и 12 наблюдается на ранних сроках, в прокамбии центральной жилки листа вблизи места среза, а затем в клетках-основательницах придаточного корня. Затем в растущем примордии придаточного корня, где промоторы генов WOX11 и 12 уже не активны, начинают работать промоторы WOX5/7 [224, 225]. По своей природе и набору экспрессирующихся генов каллус сходен с примордием корня, и при формировании каллуса из листовых эксплантов промотор WOX11 активен также в центральной жилке, маркируя формирование клеток-основательниц, а в уже образующемся каллусе промотор WOX11 не активен, но начинает функционировать промотор WOX5 [224].

WOX11/12 непосредственно активируют экспрессию WOX5/7, которые, согласно анализу мутантов, также важны для формирования придаточных корней [225]. Также WOX11 запускает экспрессию стимуляторов каллусообразования и формирования придаточных и боковых корней – генов ТФ LBD (LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN), в частности LBD16 и 29, причем показано, что LBD16 прямо активируется WOX11 [224, 226]. Ауксин и полярный транспорт ауксина важны для активации WOX11 и запуска экспрессии WOX5/7 и, в конечном счете, для регенерации корней [224, 225]. Тем не менее, сверхэкспрессия WOX11 способна частично восстанавливать способность к регенерации при подавлении синтеза ауксина [227]. Напротив, этилен подавляет регенерацию корней, а WOX11 и 5 репрессируются этилен-чувствительным ТФ ETHYLENE-INSENSITIVE3 (EIN3). Интересно, что чем старше листовой эксплант, тем сильнее в нем экспрессируется EIN3 и слабее – WOX11, и тем более затруднена регенерация корней [228]. Также обнаружен один из механизмов эпигенетической регуляции WOX11 при каллусогенезе: атипичный вариант гистона H3 – H3.15 (без остатка лизина в позиции 27) связывается с локусом WOX11 и активирует его экспрессию, вероятно, за счет уменьшения количества репрессирующих меток H3K27me3 [229]. Сходная схема взаимодействия ортологов WOX11/12 и WOX5 в каллусообразовании на среде CIM обнаружена у O. sativa [230]. Экспрессия ортологов WOX5 и 11 при каллусогенезе выявлена у Z. mays, и у гибрида P. davidiana × P. bollena [230], а участие ортологов WOX11 в образовании придаточных корней показано у различных видов и гибридов Populus [231–233]. Как и у семенных растений, у папоротника Ceratopteris richardii обнаружен путь формирования придаточных корней, при котором факторы ауксинового ответа активируют ген промежуточной клады WOX CrWOXA, который активирует экспрессию гена клады WUS – СrWUL. Таким образом, этот путь формирования придаточных корней (ауксин–ген WOX промежуточной клады–ген WOX клады WUS) консервативен у папоротников и семенных растений [234]. CrWOXA экспрессируется и при образовании боковых корней [4]. Гены группы WOX11 участвуют и в других вариантах регенерации, таких как побегообразование и СЭ. Так, показано положительное влияние PtWOX11 на регенерацию побегов у P. alba × P. glandulosa [233]. Повышенный уровень экспрессии ортолога WOX11 выявлен также в эмбриогенных каллусах M. truncatula [214] и в соматических эмбрионах и неэмбриогенных каллусах V. vinifera [119].

Помимо участия в процессах регенерации in vitro, ТФ группы WOX11/12 участвуют в развитии растения in vivo при формировании придаточных корней. У A. thaliana WOX11/12 не влияют на формирование боковых корней, которые в норме формируются за счет активации ARF7/19, и промотор WOX11 не активируется в ходе образования бокового корня [226]. Однако при выращивании проростков в почве промотор WOX11 активируется в различных участках корня, и изменение его функции влияет на количество вторичных, третичных и четвертичных корней. Вероятной причиной таких различий могут быть повреждения, которые корни получают при росте в почве и которые стимулируют образование корней, сходных с придаточными. В формировании как боковых, так и придаточных корней участвует ТФ LBD16. WOX11 за счет прямой активации LBD16 стимулирует развитие придаточных корней и корней в месте повреждения, а ARF7/19 стимулируют LBD16 в случае развития боковых корней без повреждения корня [226].

У O. sativa ортолог WOX11 выполняет более многочисленные функции. Растения с потерей функции OsWOX11 практически не формируют придаточные корни, кроме того, их первичный корень и ПАМ тоже недоразвиты, и они не доживают до взрослого состояния. OsWOX11 экспрессируется в КАМ, ПАМ и стебле, а также в примордиях придаточных корней, начиная с ранних стадий инициации, и в меристеме зрелых придаточных корней. Сверхэкспрессия OsWOX11 приводит к развитию большого количества придаточных и боковых корней. Ауксины повышают уровень экспрессии OsWOX11, а цитокинины снижают. OsWOX11 необходим для стимулируемого ауксином развития придаточных корней у риса [235]. При этом OsWOX11, вероятно, положительно влияет на передачу цитокининового сигнала, являясь прямым репрессором гена OsRR2, кодирующего репрессор цитокининового ответа – ARR типа A [236]. Также показано взаимодействие OsWOX11 с ТФ OsERF3 из семейства AP2/ERF, стимулятором развития придаточных корней и роста главного корня. Уровень экспрессии ERF3 уменьшен в растениях с потерей функции OsWOX11, однако ERF3 способен регулировать развитие корней по пути, не связанному с OsWOX11. OsERF3 также связывается с OsRR2 (но не в том регионе, в котором с ним связывается OsWOX11), однако он не подавляет, а стимулирует экспрессию OsRR2. При этом OsERF3 способствует взаимодействию OsWOX11 со своим сайтом связывания в локусе OsRR2. OsRR2 стимулирует заложение придаточных корней, однако его влияние на длину корней неоднозначно, что объясняет разнонаправленное влияние на него OsWOX11 и OsERF3 [237]. OsWOX11 также связывается с комплексом, включающим вспомогательный белок OsADA2 и гистон-ацетилтрансферазу OsGCN5 для активации экспрессии генов-мишеней (с помощью ацетилирования гистонов) и стимуляции развития придаточных корней, активируя в том числе гены, связанные с транспортом ауксина, в частности OsPIN9, а также с метаболизмом и построением клеточной стенки [238]. Ген ТФ DEGENERATED HULL 1 (DH1)/OsLOB16, близкий гомолог LBD16 A. thaliana, представляет собой мишень OsWOX11 [239]. Помимо регуляции образования придаточных корней, OsWOX11 регулирует поглощение корнями минеральных веществ и воды. Промотор OsWOX11 активен в эпидермисе, в кончиках и зоне роста корня [236], а сам OsWOX11 стимулирует образование и рост корневых волосков. Уровень экспрессии данного гена повышается в ответ на водный стресс, а растения с мутацией в OsWOX11 более чувствительны к засухе [240]. Кроме того, среди непосредственных мишеней OsWOX11 обнаружены гены, кодирующие предполагаемый ТФ OsABIOTIC STRESS RESPONSIVE3 (OsASR3), участвующий в ответе на дефицит воды и холодовой стресс, и OsFRD3-LIKE PROTEIN1 (OsFRDL1) – переносчик цитрата, необходимый для транспорта ионов железа в растении, а реакция ряда генов на дефицит воды зависит от присутствия функционального OsWOX11 [239]. Интересно, что экспрессия OsWOX11, направляемая промотором, активирующимся в корнях при дефиците калия, приводит к стимуляции развития корневой системы растений как в нормальных условиях, так и в условиях дефицита калия [241].

Как сказано выше, потеря функции OsWOX11 приводит также к замедлению роста побега, уменьшению размера ПАМ и соцветия. OsWOX11 способен к взаимодействию с деметилазой гистонов JMJ705, снимающей метку H3K27me3, которая также стимулирует рост побега и влияет на размер ПАМ. OsWOX11 и JMJ705 совместно регулируют множество генов, связанных, в частности, с энергообменом, фотосинтезом, развитием хлоропластов, ответом на стресс и формированием побега, например, OSH15 из семейства KNOX [242]. Также OsWOX11 вместе с другим геном из группы WOX11/12, OsWOX6, участвует в регуляции гравитропического ответа. Уровень их экспрессии увеличивается в ответ на гравистимуляцию проростков и в ответ на обработку ауксином, при гравистимуляции уровень их экспрессии повышен в нижней части проростка и снижен в верхней. Растения с потерей функции OsWOX6 и 11 слабее реагируют на гравистимуляцию и имеют больший угол наклона побегов. В условиях гравистимуляции гены OsWOX6 и 11 опосредованно регулируются ТФ HEAT STRESS TRANSCRIPTION FACTOR 2D (HSFA2D), который, посредством активации экспрессии гена ТФ LA1 (LAZY1) стимулирует асимметричное распределение ауксина, что приводит к асимметричному паттерну экспрессии OsWOX6 и 11 и способствует ответу на гравистимуляцию [243].

WOX13

WOX13 A. thaliana изучен в первую очередь как регулятор развития плода. Потеря его функции приводит к уменьшению размеров медиальной части гинецея (перегородки), расширению кромки створок и к ускорению растрескивания плодов. Напротив, сверхэкспрессия WOX13 ведет к тому, что гинецей дольше остается открытым, перегородка расширяется, а растрескивание плода не происходит или происходит намного позднее. WOX13 регулирует развитие перегородки в том числе за счет прямого или опосредованного подавления экспрессии маркеров латеральных областей гинецея – генов ТФ семейства YABBY FILAMENTOUS FLOWER и ТФ с цинковыми пальцами JAGGED [249]. Помимо гинецея, активность промотора WOX13 детектирована в закладывающихся боковых корнях, листовых примордиях и цветках, а также в кончике корня, проводящих тканях корня и листа и в ПАМ, а мутация в WOX13 приводит также к уменьшению количества боковых корней и к более раннему цветению [244, 249].

У мха P. patens гены WOX представлены только членами древней клады, близкими к WOX13: PpWOX13LA, B и С [250]. Активность промоторов PpWOX13LA и B повышена в апикальных стволовых клетках хлоронемы и каулонемы, а также в яйцеклетке и зиготе. Потеря функции обоих генов приводит к уменьшению количества сформированных спорангиев и к остановке развития зигот, а также к нарушению регенерации вследствие сниженной интенсивности клеточных делений и подавления роста клеток [250].

Партнеры WOX13 или его ортологов in vivo еще не выявлены, однако показана способность ТФ PtrWOX13c P. trichocarpa формировать тример с ТФ PtrDRIF1 (PtrDIVARICATA AND RADIALIS INTERACTING FACTOR1) и PtrRADIALIS1 с доменом MYB/SANT; при этом гены, кодирующие PtrWOX13c и данные ТФ, экспрессируются в проводящих тканях [251].

WOX14

WOX14 регулирует развитие проводящих тканей и рост растений в целом. Потеря функции WOX14 приводит к карликовости растений, задержке цветения и гиполигнификации сосудов, однако эти дефекты компенсируются при добавлении гиббереллинов. WOX14 стимулирует экспрессию GA3ox1 и подавляет экспрессию GA2ox1 – генов, кодирующих ферменты биосинтеза и инактивации гиббереллинов соответственно [199]. WOX14 вместе с WOX4 стимулирует пролиферацию клеток проводящих тканей. Сосудистые пучки двойных мутантов с нарушением функции генов WOX4 и 14 (wox4-1 wox14-1) содержат меньше клеток, чем одиночные мутанты wox4-1 [198]. Обнаружена связь WOX14 с другими ТФ, стимулирующими деление клеток проводящих тканей – TMO6 и LBD4. WOX14, вероятно, связываясь с его локусом, стимулирует экспрессию TMO6, белковый продукт которого, в свою очередь, вместе с WOX14 стимулирует экспрессию LBD4 [252]. Экспрессия WOX14, как и WOX4, стимулируется CLE-пептидом TDIF. При этом обработка этим пептидом растений дикого типа вызывает активацию LBD4 и TMO6, тогда как у мутантов wox4-1 wox14-1 или у растений с мутацией в гене PXY этого не происходит [252]. Промотор WOX14 активен в примордиях боковых корней, в перицикле и проводящей системе корня, а также на ранних стадиях развития тычинок. Потеря функции WOX14 приводит к подавлению развития боковых корней и увеличению количества придаточных корней, а также к недоразвитию тычинок и частичной стерильности [244]. Также WOX14 важен для регенерации побегов in vitro в системе CIM–SIM, а при образовании каллусов его экспрессия активируется гистон-ацетилтрансферазой HAG1 [149].