Молекулярная биология, 2022, T. 56, № 3, стр. 468-475

ВВЕДЕНИЕ

Рассеянный склероз (РС) – тяжелое хроническое заболевание ЦНС, сочетающее в своем патогенезе аутоиммунную и нейродегенеративную компоненты и сопровождающееся прогрессирующей неврологической дисфункцией [1]. Следствием неуклонного нарастания неврологического дефицита является необратимая инвалидизация пациентов в молодом трудоспособном возрасте, что обуславливает высокую социальную и экономическую значимость заболевания.

РС – это комплексное заболевание, которое развивается у лиц с генетической предрасположенностью под воздействием факторов внешней среды. При этом влияние внешних факторов на риск развития РС может быть в значительной мере опосредовано эпигенетическими механизмами регуляции экспрессии генов [2].

Течение РС обладает выраженной клинической гетерогенностью. В большинстве случаев у больных наблюдается ремиттирующая форма РС (РРС), характеризующаяся сменами периодов обострения и ремиссии [3]. Однако у 10–15% пациентов с самого начала болезни происходит непрерывное нарастание неврологического дефицита; такая тяжелая клинически обособленная форма РС получила название первично-прогрессирующего РС (ППРС) [4].

ППРС существенно отличается от РРС как по механизмам развития патологического процесса [5], так и по целому ряду демографических и клинических характеристик, таких как соотношение больных мужчин и женщин, средний возраст дебюта заболевания, клинические признаки дебюта, скорость прогрессирования и др. [4, 6]. Эти отличия могут объясняться особенностями эпигенетических механизмов регуляции генной экспрессии при ППРС.

Эпигенетические модификации генома не затрагивают последовательности ДНК, но при этом способны влиять на экспрессию генов в различных клетках и/или тканях [2]. Один из ключевых эпигенетических процессов – метилирование ДНК в положении С5 цитозинового основания в составе CpG-динуклеотидов. Метилирование CpG-сайтов в области промотора приводит к быстрому подавлению экспрессии генов с участием репрессорных белков [7]. Поиск специфических паттернов метилирования, характеризующих ППРС, может помочь в понимании особенностей развития заболевания.

Наибольшей информативностью при изучении метилирования ДНК обладает полногеномный анализ с использованием ДНК-микрочипов высокой плотности или высокопроизводительного секвенирования. Применение этих методов позволило выявить различия в паттернах метилирования ДНК из различных клеток и тканей больных РРС и здоровых добровольцев [8–12].

Первое исследование метилирования ДНК из мононуклеарных клеток периферической крови (МНК) больных ППРС выявило паттерн метилирования, отличающий эту форму заболевания и от больных РРС, и от здоровых доноров [8]. Однако МНК представляют собой гетерогенную клеточную популяцию, а, как показано ранее, паттерны метилирования ДНК в различных типах клеток могут значительно отличаться как в норме, так и при патологии [13]. Это приводит к необходимости изучения особенностей метилирования ДНК в отдельных субпопуляциях клеток крови при ППРС.

В настоящей работе мы изучили метилирование ДНК CD4+ T-лимфоцитов – одной из ключевых для патогенеза РС популяций лейкоцитов крови – у больных ППРС [14].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Характеристика групп. В исследование включены восемь больных ППРС (шесть женщин и двое мужчин) в возрасте от 28 до 58 лет. Диагноз устанавливали согласно критериям МакДональда в редакции 2014 года [15]. Средний балл по расширенной шкале инвалидизации (Expanded Disability Status Scale, EDSS) составил 4.29 ± 0.39. Больные, включенные в исследование, никогда не принимали иммуномодулирующих препаратов. В контрольную группу вошли восемь здоровых добровольцев (шесть женщин, двое мужчин) в возрасте от 28 до 50 лет без признаков неврологических заболеваний.

Все включенные в исследование индивиды были (согласно данным анкетирования) этническими русскими, все подписали информированное согласие на участие в эксперименте. Проведение исследования одобрено этическим комитетом ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова МЗ РФ.

Выделение ДНК и полногеномный анализ профилей метилирования. Образцы периферической крови собирали в вакуумные пробирки с EDТА. МНК выделяли из крови путем центрифугирования в градиенте фиколл-гипака. Фракцию CD4+ Т-лимфоцитов выделяли из МНК с помощью микробус, конъюгированных с антителами к CD4-антигенам (“Miltenyi Biotec”, Германия). Геномную ДНК выделяли из CD4+ Т-лимфоцитов с помощью набора DNA Mini Kit (“Qiagen”, Германия) по методике производителя. Бисульфитную конверсию геномной ДНК проводили при помощи набора EZ DNA Methylation-Gold Kit (“Zymo Research”, США). Уровень метилирования ДНК оценивали с помощью биологических микрочипов высокой плотности Infinium HumanMethylation450 BeadChip на сканере чипов iScan (“Illumina”, США) в Центре коллективного пользования “Геномика” (ИХБФМ СО РАН).

Биоинформатический анализ. Анализ данных, в том числе первичная обработка данных и их нормирование, выполнены с использованием пакета methylumi [16] и стандартных средств среды R. Из анализа исключали пробы на ДНК-микрочипе, которые содержали однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) на расстоянии ≤10 п.н. от исследуемого CpG-сайта; пробы, перекрывающиеся с повторяющимися последовательностями генома; и пробы, расположенные в половых хромосомах. Из рассмотрения также исключили пробы, у которых величина значимости обнаружения сигнала (detection p-value) была больше 0.05 хотя бы в одном из исследованных образцов. Для оценки уровней метилирования CpG-сайтов вычисляли показатель β, который определяется как отношение интенсивности сигнала метилирования от соответствующей пробы на ДНК-микрочипе к общей интенсивности сигнала (сумма интенсивностей метилированного и неметилированного сигналов) данной пробы. Значения β варьировали от 0 для неметилированных проб до 1 – в полностью метилированных.

Дифференциальное метилирование сайтов определяли с помощью пакета limma [17] среды R. CpG-сайт считали дифференциально метилированным (ДМС), если средние значения показателя бета этого сайта в сравниваемых группах различались более чем на 10% (|Δβ| > 0.1), а соответствующая величина p, определенная с помощью t-теста Стьюдента, была меньше 0.01. Локализацию конкретного CpG-сайта в CpG-островке определяли, используя аннотацию UCSC в hg19; ДМС, расположенные в 2 т.п.н. от CpG-островков, относили к соседним с ними областям (shore); локализованные в 2 т.п.н. от соседних областей – к отдаленным областям (shelf). Построение карт интенсивности сигналов ДМС осуществляли с использованием пакетов pheatmap и ggplot2 для среды R.

Статистический анализ перепредставленности известных биологических процессов (Biological Process) из базы данных Gene Onthology (GO) генами, содержащими ДМС, проводили с использованием web-инструмента GO Panther (http://www.pantherdb.org/ [18]). Отбирали значимо обогащенные процессы (p < 0.05), включающие не менее двух идентифицированных генов. В случае обогащения нескольких вложенных друг в друга процессов анализировали только обобщающий процесс более высокого уровня.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Чтобы оценить вовлечение эпигенетического механизма метилирования ДНК CD4+ Т-лимфоцитов в развитие ППРС, мы провели профилирование паттернов метилирования более 450 000 CpG-сайтов генома этой клеточной популяции в репрезентативных группах больных ППРС и здоровых индивидов. Сравнение уровней метилирования CpG-сайтов в этих группах позволило нам выявить 108 ДМС при ППРС. При иерархической кластеризации образцов ДНК на картах интенсивности сигналов ДМС (рис. 1) больные ППРС и здоровые индивиды группируются в обособленные кластеры.

Рис. 1.

Карта интенсивности сигналов ДМС генома CD4+ Т-лимфоцитов у больных ППРС и здоровых индивидов. Градиент серого от темного к светлому отражает повышение уровня метилирования ДНК в образцах. Дендрограмма сверху показывает иерархическую кластеризацию образцов: серый цвет – образцы больных ППРС, черный – здоровых индивидов. Слева представлена иерархическая кластеризация ДМС, где черным показана их локализация в CpG-островках (island), темно-серым – в соседних с ними областях (shore), светло-серым – в отдаленных областях (shelf), белым – в прочих областях (sea).

Характеристика выявленных ДМС представлена в табл. 1. Большая их часть (81%) оказалась гиперметилированной у больных при сравнении с контрольной группой. Более половины всех ДМС (66%) располагаются в области генов (всего выявлено 53 таких гена). Из них ген OR2L13 содержал восемь ДМС, ген IGF2BP1 – три ДМС, а гены ERICH1, HKR1, IGSF9B, LCLAT1, NPAS3, RHOJ, SP140, HCG4B и HLA-H – по два ДМС. Уровни метилирования всех ДМС в области генов C11orf58, CCDC172, CLRN3, RASA3, PTCD3, SP140, TONSL, FAM157B были снижены у больных ППРС по сравнению с контрольной группой. У больных ген HLA-H содержал один гипометилированный и один гиперметилированный ДМС, а остальные 44 гена содержали гиперметилированые ДМС.

Выявлены различия в уровне метилирования 16 ДМС в сравниваемых группах более чем на 20% (13 из них расположены в восьми генах). Гиперметилированными на 20–37% были ДМС cg08260406, cg20507276 и cg08944170 (ген OR2L13), cg07157030 (RHOJ), cg19980771 (SLC22A16), cg17749961 и cg12454169 (LCLAT1), cg15070894 и cg18786623 (HCG4B), cg01053087 и cg05875700 (ERICH1). Сg04824555 (FAM157B) и cg02938066 (TONSL) были гипометилированными у больных на 21 и 22% соответственно.

Для оценки возможного влияния выявленных ДМС на экспрессию генов, в области которых они расположены, проведен анализ их локализации по отношению к функционально значимым скоплениям CpG-сайтов. Как видно из рис. 2, более половины ДМС находятся в функционально наиболее важных областях: в CpG-островках (43%) и в соседних с ними областях (24%).

Рис. 2.

Локализация ДМС, выявленных при анализе метилирования ДНК CD4+ Т-лимфоцитов больных ППРС и здоровых индивидов, по отношению к функционально значимым скоплениям CpG-сайтов. В секторах диаграммы указано абсолютное число ДМС (% от общего числа ДМС).

Проведен статистический анализ перепредставленности известных биологических процессов (GO Biological Process) генами, содержащими ДМС. Как можно видеть из табл. 2, наиболее значимое обогащение наблюдается для процессов “Процессирование и презентация антигена” (GO:0019882) и “Развитие иммунной системы” (GO:0002520). Остальные идентифицированные процессы относятся к глобальным механизмам поддержания жизнедеятельности клетки: “Внутриклеточный метаболизм аминокислот” (GO:0006520), “Регуляция удержания в клетке ионов Ca²⁺” (GO:0051282), “Регуляция адгезии клеток к внеклеточному матриксу” (GO:0001952), “Транспорт мРНК” (GO:0051028), “Регуляция морфогенеза клеток” (GO:0022604).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящей работе мы впервые идентифицировали различия профилей метилирования ДНК в популяции CD4+ Т-лимфоцитов, ключевой для патогенеза РС, у больных ППРС и здоровых индивидов контрольной группы. Более половины выявленных ДМС находится в области известных генов и входят в состав CpG-островков и соседних с ними областей, что говорит о высокой функциональной значимости этих ДМС в патологическом процессе.

При ППРС наблюдается повышение уровня метилирования ДНК CD4+ Т-лимфоцитов (81% ДМС гиперметилированы), что полностью согласуется с данными, полученными нами ранее при анализе ДНК из МНК (86% ДМС гиперметилированы) [8]. Подобное повышение уровней метилирования ДНК иммунных клеток, по-видимому, отличает ППРС от более распространенного РРС, при котором гиперметилированы 43% CpG-сайтов в ДНК МНК [8] и 41–50% – в CD4+ T-лимфоцитах [9, 19, 20].

Основной областью генома, определяющей наследственную предрасположенность к РС независимо от его клинической формы, признан локус HLA хромосомы 6 [21]. В настоящей работе мы выявили гиперметилирование ДНК трех генов, расположенных в этом локусе: HLA-DRB5, кодирующего β-цепь молекул HLA II, псевдогена HLA-H и белокнекодирующего гена HCG4B с неизвестной функцией. Дифференциальное метилирование генов HLA-DRB5 и HCG4B ранее уже обнаруживали при сравнении уровней метилирования ДНК CD4+ Т-лимфоцитов больных РРС и здоровых индивидов [9, 20]. Дифференциальное метилирование различных генов локуса HLA показано ранее и в других популяциях лимфоцитов больных РРС [10, 22] и ППРС [8] при сравнении с контрольной группой. В то же время, прямое сравнение не выявило различий в уровнях метилирования генов локуса HLA при этих двух формах РС [23]. Это еще раз подтверждает ключевую роль локуса HLA в патогенезе РС независимо от его формы и указывает на вовлечение эпигенетических механизмов в регуляцию экспрессии генов локуса HLA при развитии заболевания.

Мы сравнили спектры генов, содержащих ППРС-специфические ДМС, впервые полученные методом полногеномного профилирования ДНК из CD4+ Т-лимфоцитов (настоящее исследование), и из МНК [8]. Найдены четыре гена, повышение уровня метилирования которых наблюдали в обоих исследованиях: OR2L13, IGSF9B, HKR1 и TMEM44.

В промоторной области первого из этих генов, OR2LI3, обнаружено сразу восемь ДМС (см. табл. 1); несколько из них гиперметилированы более чем на 20%. Этот ген кодирует один из белков обширного семейства обонятельных рецепторов, сопряженных с G-белками. Рецепторы этого семейства широко экспрессируются в самых разных тканях и органах, включая ЦНС, и могут участвовать в выполнении множества различных функций [24]. Хотя ген OR2L13 к настоящему моменту практически не изучен, обнаружена его связь с несколькими заболеваниями ЦНС. Показано, что при развитии болезни Паркинсона в ЦНС снижается экспрессия OR2L13 [25], а у больных аутизмом наблюдается гиперметилирование гена в цельной крови [26].

Продукт второго гена, IGSF9B, представляет собой трансмембранный белок с высоким уровнем экспрессии в интернейронах и связанный с регуляцией развития тормозных синапсов [27]. Интересно, что SNP rs10894768, расположенный во втором экзоне, ассоциирован с тяжестью РС, а сам ген IGSF9B экспрессируется в астроцитах и макрофагах из хронически активных очагов демиелинизации [28]. Данные о функциях генов HKR1 и TMEM44 человека и их связи с аутоиммунными или нейродегенеративными заболеваниями в настоящий момент отсутствуют.

Отдельного упоминания заслуживают гены ERICH1 и LCLAT1. В нашем исследовании уровни метилирования ДМС в областях обоих этих генов у больных ППРС оказались более чем на 20% выше, чем у здоровых индивидов контрольной группы. Интересно, что, напротив, наблюдали снижение уровня метилирования и ERICH1, и LCLAT1 в CD4+ клетках больных РРС [9, 20], что может указывать на вовлечение эпигенетической регуляции экспрессии этих генов в формирование клинической формы РС. Функция ERICH1 остается пока неизученной. Показано участие продукта гена LCLAT1 в модификации фосфолипидов, в том числе митохондриального кардиолипина. Снижение экспрессии LCLAT1 коррелирует с повышением продукции активных форм кислорода и индукцией апоптоза [29].

Cтатистический анализ перепредставленности генов, содержащих ДМС, в основных биологических процессах показал, что часть из них вовлечена в процессинг и презентацию антигена (HLA-DRB5, HLA-H), развитие иммунной системы (CBFA2T3, DCLRE1C, FLI1, SLC46A2, TGFBR3), а также в регуляцию адгезии клеток к внеклеточному матриксу (CORO1C, PLEKHA2), во многом определяющую миграцию лейкоцитов. Остальные гены, содержащие ДМС, по-видимому, участвуют в патогенезе ППРС на уровне общих интегральных систем регуляции жизнедеятельности клетки.

В целом, проведенный нами анализ позволил идентифицировать паттерн метилирования ДНК, характерный для ППРС. Полученные нами данные, после соответствующего подтверждения на независимых выборках, могут помочь в углублении знаний об особенностях патогенеза ППРС, что, в свою очередь, может быть использовано при разработке новых эффективных препаратов для терапии этого заболевания.

Исследование выполнено в рамках Государственного задания ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова МЗ РФ №121040600400-8.

От всех включенных в исследование индивидов получено информированное согласие на участие в эксперименте. Проведение исследования одобрено этическим комитетом ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова МЗ РФ.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.