Молекулярная биология, 2022, T. 56, № 3, стр. 476-490

Семейство L18-транспозонов у Cnidaria

При поиске транспозонов L18 Cnidaria в качестве образца мы использовали аминокислотную последовательность транспозазы элемента Mariner-18_CGi устрицы C. gigas, первого обнаруженного представителя группы L18 [35]. При анализе результатов, полученных с помощью tBLASTn, мы выбирали гомологичные последовательности с наилучшим сочетанием длины покрытия с процентом идентичности и расстоянием между вторым (аспартат) и третьим (глутамат) маркерными аминокислотными остатками каталитического домена DDE, равным 37 а.о. (DD37E). В некоторых случаях в анализ брали последовательности с высокой идентичностью к транспозазе Mariner-18_CGi, но с паттерном каталитического домена, отличным от DD37E. Встречались транспозазы, у которых в DDE-домене вместо глутамата в третьей позиции находился глутамин (Q), аспартат (D), аргинин (R) или лизин (K) (табл. 2).

В результате анализа 78 полногеномных последовательностей 35 организмов (30 видов) нами идентифицирован 51 элемент L18 при этом полноразмерные копии обнаружены только у 10 из них. В качестве образцов для дополнительного поиска гомологичных МГЭ использовали транспозазы полноразмерных элементов.

Структурные особенности L18-транспозонов Cnidaria

Длина обнаруженных полноразмерных элементов L18 колебалась от 1341 до 1993 п.н. Длина транспозаз составляла 315–387 а.о. КИП найдены у 30 элементов, их длина колебалась от 20 до 60 п.н. и лишь у одного элемента – L18-1_HVul/GCA_ 000004095.1 – достигала 163 п.н. Субконцевые инвертированные повторы (СИП) не обнаружены (табл. 2).

Если сравнить L18 и родственные группы элементов MLE и TLE, длина которых не превышает 1300–1400 п.н., длина КИП равна примерно 30 п.н., а длина транспозазы около 340–360 а.о. [39, 40], то заметны некоторые различия. Общая длина элементов L18 и длина транспозазы соответствуют длинам в семействах MLE и TLE, лишь у отдельных элементов эти цифры незначительно отличаются (табл. 2). Длина КИП у большинства элементов L18 соответствует длине КИП MLE и TLE, однако у отдельных элементов, например, у L18-1_HVul/GCA_000004095.1, L18-1_AYon и L18-1_AHya, встречаются значительно более длинные КИП (табл. 2). Длина элементов L18, имеющих делеции, варьировала от 123 до 2951 п.н. (табл. 2). Подобное увеличение общей длины – 2198 и 2951 п.н. у поврежденных элементов L18-1_AIn и L18-1_AAwi, объясняется тем, что они содержат, по всей видимости, вставки в некодирующие части, в то время как их ОРС укорочена.

Наличие и целостность PAIRED-домена, GRPR-подобного мотива, NLS и каталитического домена DDE могут свидетельствовать о сохранении функциональности транспозазы. Мы изучали структурные особенности транспозазы у всех полноразмерных элементов, так как нас интересовала их потенциальная функциональность. В анализ мы включили также полноразмерные элементы, имеющие стоп-кодоны в ОРС, чтобы иметь больше последовательностей для сравнения, хотя их потенциальная функциональность в данном случае исключалась.

PAIRED-домен в полном или урезанном виде представлен во всех изученных нами транспозазах. Первые три альфа-спирали отсутствовали только в транспозазе элемента L18-1_NVec, в которой эта часть белка оказалась делетированной. Третья альфа-спираль была фрагментирована в L18-1_HVul/GCA_000004095.1, L18-1_HVul/GCA_000219015.1 и L18-1_MCaс. Вторые три альфа-спирали имеют четкие границы в транспозазах элементов L18-1_HVul/GCA_000004095.1, L18-1_HVul/GCA_000219015.1 и L18-1_MCap. В остальных случаях альфа-спирали домена RED не имеют четкого рисунка, они фрагментированы, укорочены, слиты или отсутствуют (рис. 1). GRPR-подобный мотив в семи транспозазах из восьми имел последовательность GRPT/S, в транспозазе элемента L18-1_PRus он был малоузнаваемым, а в белках элементов L18-1_MCaс и L18-1_NVec не обнаружен вовсе. Расположение мотива было типичным – между первой и второй триадами альфа-спиралей (рис. 1). NLS-последовательность обнаружена в транспозазах пяти элементов L18, в двух из них найдено по два NLS, но наиболее типичным было расположение NLS между PAIRED-доменом и каталитическим доменом DDE (рис. 1).

Рис. 1.

Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей L18-транспозаз. Серым выделены шесть α-спиралей, формирующих PAIRED-домен; жирным обозначен гипотетический сигнал ядерной локализации (NLS); выделен жирным и подчеркнут GRPR-подобный мотив; черным показаны маркерные локусы DD37E-домена.

Каталитический домен DD37E обнаружен у всех исследованных полноразмерных элементов L18 (рис. 1), но в аминокислотной последовательности транспозазы элемента L18-1_MCap первый аспартат в домене DDE заменен на глутамин (Q), а расстояние между D и E в каталитическом домене элемента L18-1_HVir/GCA_014706445.1 равно 35 а.о. (табл. 2).

Анализ структуры белка и строения элементов L18 позволяет заключить, что функциональной активностью потенциально обладают только четыре элемента – L18-1_HVul/GCA_000004095.1, L18-1_HVul/GCA_000219015.1, L18-1_HVir/GCA_ 014706445.1 и L18-1_AMyr, при этом один из них – L18-1_HVul/GCA_000219015.1 – представлен двумя копиями, остальные – только одной (табл. 2). Столь малое число потенциально функциональных элементов L18, обнаруженных у Cnidaria, вполне согласуется с данными других исследований, которые также показывают, что наряду со значительным общим пулом элементов, имеющих делеции, потенциально функциональные элементы встречаются в единичном количестве [41–44].

Филогенетический анализ L18-транспозонов Cnidaria

Филогенетический анализ, в который вошли транспозазы всех обнаруженных нами L18-транспозонов стрекающих и некоторые L18-транспозазы иглокожих, моллюсков и рыб [35], а также транспозазы, представляющие семейство TLE (Intruder, Incomer, Traveler, TLEWI, Tc1, Zvezda, TRT, ctmTLE) и семейство MLE (в качестве внешней группы) [40, 45–49], показал, что группа элементов L18 не является подсемейством группы TLE, как считалось ранее [35] (рис. 2). L18-транспозоны с достаточно высокой значимостью (значение бутстреп-теста 67%) формируют единую кладу, тогда как их объединение с другими группами семейства TLE недостоверно (значение бутстреп-теста менее 50%). Таким образом, мы полагаем, что L18-транспозоны – это отдельное монофилетическое семейство внутри суперсемейства Tc1/mariner.

Рис. 2.

Эволюционные взаимоотношения транспозонов L18 и TLE. Черными кругами обозначены ДНК-транспозоны, обнаруженные в этой работе. Филогенетический анализ выполнен в программе MEGA X c помощью метода максимального правдоподобия. Используемая модель WAG+G. Достоверность топологии оценивали с использованием бутстреп-теста (1000 репликаций). Значения коэффициентов поддержки бутстреп-теста менее 50% не показаны.

Филогенетическое исследование L18-транспозонов позволило выделить внутри семейства четыре кластера (A, B, C, D) (рис. 2). В кластеры мы объединили элементы, которые формируют группы, включающие более двух L18-транспозонов и имеющие значение бутстреп-теста более 50%. В кластеры A, B и C вошли транспозоны, обнаруженные у представителей класса Anthozoa. При этом в кластер С объединяют преимущественно элементы, обозначенные нами как L18-2. Эти элементы обнаружены также у представителей класса Anthozoa в качестве второго, альтернативного элемента L18. Кластер D содержал только транспозоны L18 класса Hydrozoa.

Внутривидовое разнообразие

Поскольку на момент исследования в NCBI были депонированы по две сборки геномов пяти видов Cnidaria: H. viridissima, H. vulgaris, A. digitifera, A. millepora и Orbicella faveolata (табл. 3), мы получили возможность изучить внутривидовое разнообразие МГЭ.

ДНК H. viridissima была выделена из образцов, представляющих различные популяции – из лабораторной линии (Европа) и природной популяции (Австралия). Элементы L18-1_HVir/GCA_014706445.1 и L18-1_HVir/GCA_ 004118115.1 существенно различаются, перекрывание нуклеотидных последовательностей этих двух транспозонов равно 4%, идентичность транспозаз этих элементов также была низкий – 32.51% (табл. 3). Такой уровень сходства белков транспозазы характерен для отдаленных видов. Элемент L18-1_HVir/GCA_014706445.1 считается потенциально активным, тогда как L18-1_HVir/GCA_ 004118115.1 сильно укорочен и содержит стоп-кодоны, а длина транспозазы равна 174 а.о. По всей видимости, эволюция элемента L18 в этих двух популяциях из-за их географической удаленности проходила по-разному – в лабораторной линии элемент подвергся деградации, а в природной популяции сохранил свою активность.

Обе сборки генома H. vulgaris получены из лабораторной линии 105. Обнаруженные в них транспозоны L18 идентичны, что, вероятно, обусловлено высокой гомогенностью особей внутри лабораторной линии (табл. 3).

Секвенированные геномы A. digitifera принадлежали особям, выловленным на побережье Японии с интервалом 7 лет (табл. 3). В обеих сборках обнаружены по два элемента L18 (табл. 2). Сходство между первой и второй парой элементов довольно высокое как на уровне нуклеотидной (88–89%), так и аминокислотной (75–79%) последовательности. Транспозоны относятся к достаточно быстро мутирующим элементам генома, поскольку на них не действует стабилизирующий (очищающий) отбор. Поэтому идентичность нуклеотидных последовательностей различных копий одного и того же ДНК-транспозона внутри одного генома может варьировать от 80 до 100%, а в некоторых случаях достигать 70% [35]. По всей вероятности, столь высокую идентичность транспозонов можно объяснить тем, что образцы принадлежат к одной и той же популяции.

Две особи A. millepora собраны в Индонезии и Австралии с интервалом 18 лет. В каждой сборке генома этого вида также обнаружено по два элемента L18. Выявлена очень высокая идентичность обоих элементов на уровне нуклеотидной и аминокислотной последовательностей (табл. 3). Обращает на себя внимание низкая перекрываемость (%) элементов L18-1, но это объясняется тем, что самая протяженная копия (L18-1_AMil/ GCA_013753865.1) кодирует фрагмент транспозазы длиной всего 56 а.о. Высокая идентичность элементов может объясняться географической близостью Индонезии и Австралии и высокой вероятностью того, что образцы принадлежат к одной популяции. Сходная ситуация наблюдается и у образцов O. faveolata (табл. 3), собранных во Флориде (США) и государстве Панама. Очень высокая идентичность нуклеотидных последовательностей этих элементов (95%) также может объясняться географической близостью Флориды и Панамы.

В общем, можно сделать вывод о довольно высокой гомогенности одной и той же популяции по “старым” транспозонам, которые уже утратили свою активность. В разобщенных популяциях, как в случае H. viridissima, транспозоны сильно различаются.

Жизненный цикл L18-транспозонов

Степень активности элементов L18 в геномах Cnidaria, а также давность их вторжения мы попытались оценить по их копийности в геномах стрекающих. У пяти элементов общее число копий было очень высоким – от 137 до 406. Еще у пяти элементов общее число копий оказалось достаточно высоким – 47–81. У оставшегося большинства элементов количество копий не превышало 20. Число полноразмерных копий 10 элементов L18 распределялось таким образом: семь имели не более 10 копий и только у трех элементов количество полноразмерных копий было умеренно высоким – 22, 35 и 46 (табл. 2). Подобное распределение позволяет предположить, что элементы L18-1_HVul/GCA_000219015.1 и L18-1_ AMyr могут быть активными в геномах данных организмов в настоящее время, поскольку они имеют много полноразмерных копий (46 и 22), в том числе и одну–две потенциально функциональных. Элементы L18-1_PSpe могли быть активными в недавнем прошлом, поскольку на фоне довольно высокого общего числа копий (56) обнаружено много (35) их полноразмерных копий, но ни одной потенциально функциональной. Общее высокое число копий и отсутствие полноразмерных копий, как, например, у элементов L18-1_AHya, L18-1_AInt, L18-1_ASel, может свидетельствовать о высокой активности этих элементов в прошлом, что привело к их амплификации, но в настоящее время наблюдается элиминация этих элементов из геномов хозяина. Низкое общее число копий и отсутствие полноразмерных копий, которое встречается в большинстве случаев (табл. 2), может свидетельствовать о том, что эти элементы завершают свой жизненный цикл в геноме данных хозяев и большая их часть уже элиминирована. Это согласуется с данными, приведенными в работе [50], в которой выдвинута гипотеза о том, что активное заселение видов МГЭ осталось в далеком прошлом, сегодня же мы наблюдаем лишь завершающую стадию жизненного цикла подавляющего большинства элементов.

Эволюция элементов L18

Элементы семейства L18 обнаружены только в двух из шести классов стрекающих (полные геномы которых представлены в NCBI): Hydrozoa и Anthozoa (рис. 3). Наибольшее их число (в 29 из 30 геномов) выявлено у организмов отряда Scle-ractinia (подкласс Hexacoralia; класс Anthozoa), при этом у 16 представителей подотряда Astrocoeniina найдены по два различных МГЭ группы L18 (рис. 2, табл. 1). В другом отряде (Actiniaria) того же подкласса в исследованных 9 геномах L18-транспозон обнаружен только в одном семействе (Edwardsiidae). В подклассе Octocorallia у трех организмов также обнаружен только один L18-транспозон (подотряд Stolonifera; отряд Alcyonacea). МГЭ группы L18 идентифицированы также в четырех геномах (из семи) представителей класса Hydrozoa (подотряд Aplanulata). Элементы семейства L18 представителей Hydrozoa входят в кластер D и имеют большую идентичность с L18-транспозоном иглокожих, тогда как элементы представителей Anthozoa с достаточно высокой значимостью (бутстреп 50%) формируют отдельную группу, включающую кластеры A, B и C (рис. 2). Сопоставление результатов филогенетического анализа и распространенности L18 среди представителей Cnidaria дает основания полагать, что имели место несколько инвазий L18-транспозонов в геномы древних стрекающих. Горизонтальный перенос Тc1/mariner-элементов встречается относительно часто [51–53].

Рис. 3.

Представленность элементов L18 у представителей стрекающих. На таксономическом дереве приведены только те группы организмов, геномы представителей которых секвенированы. В столбцах (в серых прямоугольниках) указано количество доступных для анализа полногеномных последовательностей и число геномов, в которых обнаружены соответствующие группы ДНК-транспозонов.

Согласно данным TimeTree (http://www.timetree.org/), дивергенция представителей класса Anthozoa и представителей классов Hydrozoa, Cubozoa и Scyphozoa произошла в диапазоне от 540 до 667 м.л.н. Поскольку L18-транспозоны обнаружены в обоих подклассах, то инвазия предкового транспозона могла произойти в этот период. С другой стороны, в подклассе Octocorallia обнаружен только один L18-транспозон (L18-1_TSp) – в кладе Stolonifera (рис. 3). При этом на филогенетическом дереве он занял обособленное место, не войдя ни в один из кластеров (рис. 2) других Anthozoa. Кластеры A, B и C оказались ближе к элементу моллюсков (Mariner-18_CGi), чем к L18-1_TSp. Данные о времени возникновения клады Stolonifera отсутствуют, тогда как отряд Alcyonacea (включающий эту кладу) дивергировал 368 м.л.н. (TimeTree, http://www.timetree.org/). По-видимому, предок L18-1_TSp вторгся в геном организма позднее 368 м.л.н. Эти временные оценки согласуются с тем, что данный элемент представлен всего двумя достаточно сильно поврежденными копиями. Нельзя исключить как более ранней инвазии элемента и полной элиминации из геномов других представителей Octocorallia, так и более поздней инвазии, слабой транспозиционной активности и быстрой деградации. Более точные заключения можно будет сделать с появлением новых данных.

L18-транспозоны подкласса Hexacorallia представлены тремя кластерами A, B и C. Если эти элементы являются потомками одного транспозона, то предположительное время инвазии – 540–667 м.л.н. С другой стороны, каждый кластер может быть результатом независимых событий горизонтального переноса. Но поскольку в кластерах присутствуют элементы различных таксонов подкласса Hexacorallia, то вероятно, что горизонтальные переносы происходили в рамках этой группы животных, тогда время этих событий оценить затруднительно.

В классе Hydrozoa L18-транспозоны выявлены только в отряде Anthoathecata, который обособился 440–459 м.л.н. (TimeTree, http://www.timetree.org/). Виды H. viridissima и H. vulgaris дивергировали около 193 м.л.н. (TimeTree, http:// www.timetree.org/). Таким образом, мы предполагаем, что L18-транспозоны появились у организмов этой группы в результате горизонтального переноса в промежутке от 193 до 459 м.л.н. Однако, опираясь на то, что у обоих видов гидр сохранились потенциально функциональные копии L18, и они, соответственно, являются относительно молодыми, мы полагаем время инвазии ближе к 193 м.л.н. Более точные оценки можно будет дать после того, как будут секвенированы и станут доступными для анализа геномы представителей других подотрядов Anthoathecata.