Молекулярная биология, 2022, T. 56, № 4, стр. 652-662

Релевантность экспонированных на поверхности лакказы остатков лизина, предназначенных для ее функционализации

A. A. Arteaga-Castrejón a, M. R. Trejo-Hernández a, Y. Mekmouche b, A. Amouric b, P. Rousselot-Pailley b, V. Robert b, T. Tron b*, F. Martínez-Morales a**

a Centro de Investigación en Biotecnología
62209 Cuernavaca, Morelos, Av. Universidad 1001 Col. Chamilpa, México

b Centrale Marseille, CNRS, Aix Marseille Université
13397 Marseille, iSm2 UMR 7313, France

* E-mail: thierry.tron@univ-amu.fr
** E-mail: fernandomm@uaem.mx

Поступила в редакцию 05.09.2021
После доработки 02.12.2021
Принята к публикации 10.12.2021

Аннотация

Лакказы грибов ‒ это оксидоредуктазы с низкой субстратной специфичностью. Для получения гибридных катализаторов с новыми свойствами на основе лакказы необходимо знать характеристики поверхности этого фермента. Мишенями для реакций иммобилизации служат молекулы лизина, экспонированные на поверхности лакказы. В качестве платформы для выявления экспонированных на поверхности лакказы сайтов, потенциально пригодных для замещения остатками лизина, мы использовали LAC3-K0, лишенный остатков лизина. На основе 3D модели LAC3-K0 были выбраны семь сайтов и с помощью сайт-направленного мутагенеза получены мутанты с единичными остатками лизина (UNIKn, где n ‒ номер остатка). Все мутанты экспрессировали в клетках Saccharomyces cerevisiae W303-1A. По способности окислять гваякол или 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновую кислоту (ABTS) на чашках с агаром их отнесли к функционально секретируемым белкам. Все варианты, как и ожидалось, были активными при кислых, но не при нейтральных значениях рН. Эти варианты оставались стабильными при температуре 15‒55°C и полностью утрачивали активность при 70°C. Показано, что замена одного или двух поверхностных остатков лизина сильно влияла на активность фермента и его субстратную специфичность независимо от расстояния этих остатков от сайта Т1. Каталитические параметры ($K_{{\text{M}}}^{{{\text{app}}}}$ и $k_{{{\text{cat}}}}^{{{\text{app}}}}$), измеренные по отношению к ABTS, различались у разных вариантов; $V_{{\max }}^{{{\text{app}}}}$ была в 1.5‒2 раза выше у UNIK269 и у тройного мутанта с $V_{{\text{M}}}^{{{\text{app}}}}$ = 0.27 и 0.30 соответственно; $k_{{{\text{cat}}}}^{{{\text{app}}}}$ равна 30.25 у UNIK238 и 32.34 у тройного мутанта. Установлено, что свойства гидрофобных областей на поверхности LAC3-K0 следует учитывать при взаимодействии гибридных материалов. Все полученные нами варианты с уникальными поверхностными остатками лизина содержат сайты, пригодные для контролируемой ориентации лакказы при дизайне гибридных материалов.

Keywords: laccase, oriented functionalization, site-directed mutagenesis, UNIK

Список литературы

  1. Mate D.M., Alcalde M. (2017) Laccase: a multi-purpose biocatalyst at the forefront of biotechnology. Microbial Biotechnol. 10, 1457‒1467.

  2. Stanzione I., Pezzella C., Giardina P., Sannia G., Piscitelli A. (2020) Beyond natural laccases: extension of their potential applications by protein engineering. Appl. Microbiol. Biotechnol. 104, 915‒924.

  3. Bertrand B., Martinez-Morales F., Trejo-Hernandez M.R. (2017) Upgrading laccase production and biochemical properties: strategies and challenges. Biotechnol. Prog. 33, 1015‒1034.

  4. Martínez A.T., Ruiz-Dueñas F.J., Camarero S., Serrano A., Linde D., Lund H., Vind J., Tovborg M., Herold-Majumdar O.M., Hofrichter M., Liers C., Ullrich R., Scheibner K., Sannia G., Piscitelli A., Pezzella C., Sener M.E., Kılıç S., van Berkel W.J.H., Guallar V., Lucas M.F., Zuhse R., Ludwig R., Hollmann F., Fernández-Fueyo E., Record E., Faulds C.B., Tortajada M., Winckelmann I., Rasmussen J.-A., Gelo-Pujic M., Gutiérrez A., Del Río J.C., Rencoret J., Alcalde M. (2017) Oxidoreductases on their way to industrial biotransformations. Biotechnol. Adv. 35, 815‒831.

  5. Pardo I., Rodríguez-Escribano D., Aza P., de Salas F., Martínez A.T., Camarero S. (2018) A highly stable laccase obtained by swapping the second cupredoxin domain. Sci. Rep. 8, 15669.

  6. Su J., Fu J., Wang Q., Silva C., Cavaco-Paulo A. (2018) Laccase: a green catalyst for the biosynthesis of poly-phenols. Crit. Rev. Biotechnol. 38, 294‒307.

  7. Pardo I., Camarero S. (2015) Exploring the oxidation of lignin-derived phenols by a library of laccase mutants. Molecules. 20, 15929‒15943.

  8. Yin Q., Zhou G., Peng C., Zhang Y., Kües U., Liu J., Xiao Y., Fang Z. (2019) The first fungal laccase with an alkaline pH optimum obtained by directed evolution and its application in indigo dye decolorization. AMB Express. 9, 151.

  9. Pezzella C., Guarino L., Piscitelli A. (2015) How to enjoy laccases. Cell. Mol. Life Sci. 72, 923‒940.

  10. Mateo C., Palomo J.M., Fernandez-Lorente G., Guisan J.M., Fernandez-Lafuente R. (2007) Improvement of enzyme activity, stability and selectivity via immobilization techniques. Enzyme Microbial. Technol. 40, 1451‒1463.

  11. Hoarau M., Badieyan S., Marsh E.N.G. (2017) Immobilized enzymes: understanding enzyme – surface interactions at the molecular level. Org. Biomol. Chem. 15, 9539‒9551.

  12. Shen L., Zhu J. (2016) Oriented protein nanoarrays on block copolymer template. Macromol. Rapid Commun. 37, 494‒499.

  13. Liu Y., Ogorzalek T.L., Yang P., Schroeder M.M., Marsh E.N.G., Chen Z. (2013) Molecular orientation of enzymes attached to surfaces through defined chemical linkages at the solid–liquid interface. J. Am. Chemical Soc. 135, 12660‒12669.

  14. Lalaoui N., Rousselot-Pailley P., Robert V., Mekmouche Y., Villalonga R., Holzinger M., Cosnier S., Tron T., Le Goff A. (2016) Direct electron transfer between a site-specific pyrene-modified laccase and carbon nanotube/gold nanoparticle supramolecular assemblies for bioelectrocatalytic dioxygen reduction. ACS Catalysis. 6, 1894‒1900.

  15. Gentil S., Rousselot-Pailley P., Sancho F., Robert V., Mekmouche Y., Guallar V., Tron T., Le Goff A. (2020) Efficiency of site-specific clicked laccase–carbon nanotubes biocathodes towards O2 reduction. Chemistry – A Eur. J. 26, 4798‒4804.

  16. Klonowska A., Gaudin C., Asso M., Fournel A., Rég-lier M., Tron T. (2005) LAC3, a new low redox potential laccase from Trametes sp. strain C30 obtained as a recombinant protein in yeast. Enzyme Microbial. Technol. 36, 34‒41.

  17. Mekmouche Y., Schneider L., Rousselot-Pailley P., Faure B., Simaan A.J., Bochot C., Réglier M., Tron T. (2015) Laccases as palladium oxidases. Chem. Sci. 6, 1247‒1251.

  18. Robert V., Monza E., Tarrago L., Sancho F., De Falco A., Schneider L., Npetgat Ngoutane E., Mekmouche Y., Pailley P.R., Simaan A.J., Guallar V., Tron T. (2017) Probing the surface of a laccase for clues towards the design of chemo-enzymatic catalysts. ChemPlusChem. 82, 607‒614.

  19. Hebditch M., Warwicker J. (2019) Web-based display of protein surface and pH-dependent properties for assessing the developability of biotherapeutics. Sci. Rep. 9, 1969.

  20. Gietz R.D., Woods R.A. (2006) Yeast transformation by the LiAc/SS carrier DNA/PEG method in yeast protocol. Ed. Xiao W. Totowa, N.J.: Humana Press, pp. 107‒120.

  21. Zhou S., Rousselot-Pailley P., Ren L., Charmasson Y., Dezord E.C., Robert V., Tron T., Mekmouche Y. (2018) Production and manipulation of blue copper oxidases for technological applications. Methods Enzymol. 613, 17‒61.

  22. Bradford M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein–dye binding. Analyt. Biochem. 72, 248‒254.

  23. Wang X., Yao B., Su X. (2018) Linking enzymatic oxidative degradation of lignin to organics detoxification. Int. J. Mol. Sci. 19, 3373.

  24. Li Y., Zhang J., Huang X., Wang T. (2014) Construction and direct electrochemistry of orientation controlled laccase electrode. Biochem. Biophys. Res. Commun. 446, 201‒205.

  25. Koschorreck K., Schmid R.D., Urlacher V.B. (2009) Improving the functional expression of a Bacillus licheniformis laccase by random and site-directed mutagenesis. BMC Biotechnol. 9, 12.

  26. Mollania N., Khajeh K., Ranjbar B., Hosseinkhani S. (2011) Enhancement of a bacterial laccase thermostability through directed mutagenesis of a surface loop. Enzyme Microb. Technol. 49, 446‒452.

  27. Festa G., Autore F., Fraternali F., Giardina P., Sannia G. (2008) Development of new laccases by directed evolution: functional and computational analyses. Proteins: Structure, Function, Bioinformatics. 72, 25‒34.

  28. Ming D., Chen R., Huang H. (2018) Amino-acid network clique analysis of protein mutation non-additive effects: a case study of lysozyme. Int. J. Mol. Sci. 19, 1427.

  29. Konishi A., Ma X., Yasukawa K. (2014) Stabilization of Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase by site-directed mutagenesis of surface residue Val433. Biosci. Biotechnol. Biochem. 78, 75‒78.

  30. Glazunova O.A., Trushkin N.A., Moiseenko K.V., Filimonov I.S., Fedorova T.V. (2018) Catalytic efficiency of basidiomycete laccases: redox potential versus substrate-binding pocket structure. Catalysts. 8, 152.

  31. Mateljak I., Monza E., Lucas M.F., Guallar V., Aleksejeva O., Ludwig R., Leech D., Shleev S., Alcalde M. (2019) Increasing redox potential, redox mediator activity, and stability in a fungal laccase by computer-guided mutagenesis and directed evolution. ACS Catalysis. 9, 4561‒4572.

  32. Lijnzaad P., Berendsen H.J.C., Argos P. (1996) Hydrophobic patches on the surfaces of protein structures. Proteins: Structure, Function, Bioinformatics. 25, 389‒397.

  33. Ernst H.A., Jørgensen L.J., Bukh C., Piontek K., Plattner D.A., Østergaard L.H., Larsen S., Bjerrum M.J. (2018) A comparative structural analysis of the surface properties of asco-laccases. PLoS One. 13, e0206589.

Дополнительные материалы

скачать ESM_1.docx
Supplementary