Молекулярная биология, 2022, T. 56, № 4, стр. 628-641

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Штаммы и условия их выращивания. В работе использовали штаммы Saccharomyces cerevisiae 334t rpn4-Δ (MATα, pep4-3, prb1-1122, ura3-52, leu2-3,112, reg1-501, gal1, rpn4::G418) с делецией гена RPN4 [8], штамм дикого типа BY4742 (MATα, his3D1, leu2D0, lys2D0, ura3D0) (“Euroscarf”, Германия) и производные от него мутантные штаммы rpn4-∆ (BY4742 YDL020c::kanMX4) (“Euroscarf”) и YPL (BY4742 pre1-8 nat+) [15], а также штамм PJ69-4A (MATα, trp1-901, leu2-3,112, ura3-52, his3-200, gal4-Δ, gal80-Δ, LYS2::GAL1-HIS3, GAL2-ADE2, met2::GAL7-lacZ) [19]. Дрожжевые культуры растили при 30°C на среде YPD (2% глюкозы, 2% пептона, 1% дрожжевого экстракта) и трансформировали, используя литий-ацетатный метод [20]. Штаммы, трансформированные экспрессионными плазмидами, выращивали в минимальной среде, содержащей YNB (6.7 г/л), смесь 20 аминокислот, глюкозу (2%), а также козаминовые кислоты (0.5%) без добавления урацила. В случае двугибридной системы дрожжевые трансформанты растили на селективной среде без триптофана, лейцина, гистидина и аденина. Использовали компоненты питательных сред производства “Sigma” (США). Плазмиды, использованные в работе, описаны в табл. 1.

Получение плазмид pPRPN4ΔNLS и pPRPN4ΔNZnF. Варианты гена RPN4, содержащие делецию предполагаемого сигнала ядерной локализации и N-концевого “цинкового пальца”, получали путем двухстадийного сайт-направленного мутагенеза с помощью высокоточной ДНК-полимеразы KAPA HiFi (“Roche Molecular Systems, Inc.”, США), используя пары праймеров RPN4-NcoI-F/RPN4-ΔNLS-R и RPN4-ΔNLS-F/Rpn4-XhoI-R и RPN4-NcoI-F/RPN4-ΔNZnF-R и RPN4-ΔNZnF-F/Rpn4-XhoI-R (табл. 2) соответственно. Полученные ПЦР-фрагменты очищали c использованием набора GeneJET PCR Purification Kit (“Thermo Fisher Scientific”, США) и клонировали в вектор pPDX2 по сайтам эндонуклеаз BamHI и XhoI. Отсутствие посторонних мутаций и наличие целевых делеций в последовательностях клонированных фрагментов проверяли секвенированием.

Двугибридная дрожжевая система. Гены RPN2, NAS2 и RPN4 амплифицировали с геномной ДНК дрожжей с помощью высокоточной ДНК-полимеразы KAPA HiFi (“Roche Molecular Systems, Inc.”), используя пары праймеров RPN2-EcoRI-F/RPN2-XhoI-R, NAS2-NcoI-F/XhoI-R и RPN4-NcoI-F/RPN4-XhoI-R. Полученные ПЦР-фрагменты очищали с помощью набора GeneJET PCR Purification Kit (“Thermo Fisher Scientific”). ПЦР-фрагмент гена RPN2 обрабатывали эндонуклеазами EcoRI и XhoI и клонировали в векторы pGBT9 и pGAD424, гидролизованные по сайтам эндонуклеаз EcoRI и SalI. Сайты XhoI и SalI после гидролиза соответствующими эндонуклеазами образуют комплементарные липкие концы. Отсутствие посторонних мутаций в последовательностях клонированных фрагментов проверяли секвенированием. Полученные плазмиды назвали pGBT-Rpn2 и pGAD-Rpn2 (табл. 1).

Перед клонированием генов NAS2 и RPN4 в векторы двугибридной системы ввели сайт NcoI. Векторы pGAD424 и pGBT9 обрабатывали эндонуклеазой EcoRI и лигировали с двухцепочечным олигонуклеотидом, имеющим липкие концы, комплементарные EcoRI, и образованным путем отжига олигонуклеотидов – pGAD-GBT-iMCS-F/pGAD-GBT-iMCS-R. Наличие вставки олигонуклеотида проверяли путем рестрикционного анализа по сайтам NcoI и PvuI с последующим секвенированием. Полученные плазмиды назвали pGAD425 и pGAD10. ПЦР-фрагменты генов NAS2 и RPN4 очищали набором GeneJET PCR Purification Kit (“Thermo Fisher Scientific”), обрабатывали эндонуклезами NcoI и XhoI и клонировали в модифицированные векторы двугибридной системы, обработанные эндонуклезами NcoI и SalI. Отсутствие посторонних мутаций в последовательностях клонированных фрагментов проверяли секвенированием. Полученные плазмиды назвали pGBT-Rpn4, pGBT-Nas2, pGAD-Rpn4 и pGAD-Nas2 (табл. 1).

Штамм PJ69-4a котрансформировали парой плазмид, производных векторов pGBT9 и pGAD424, с помощью стандартного литий-ацетатного метода [20]. Колонии выращивали на селективной среде без триптофана и лейцина. Затем колонии рассевали штрихом на чашках Петри с агаризованной селективной средой без триптофана, лейцина, гистидина и аденина в присутствии 5 мМ 3‑амино-1,2,4-триазола (3-AT) в качестве ингибитора фоновой активации экспрессии гена HIS3. Чашки инкубировали при 30°С в течение 2–3 суток.

Определение устойчивости дрожжей к стрессовым условиям путем выращивания серийных разведений дрожжевой культуры на чашках Петри. Дрожжевые культуры растили до стационарной фазы в течение ночи при 30°С. Культуры разводили до конечной оптической плотности OD₆₀₀ = 1, готовили пятикратные разведения и высевали на твердую селективную среду с добавлением стрессовых агентов в виде капель объемом 5 мкл. В контроле штаммы растили на среде без добавления стрессовых агентов. Устойчивость к стрессу исследуемых дрожжевых штаммов определяли качественно по скорости формирования колоний при 30°С.

Определение активности Dam-метилазы (DamID). Плазмиду YCp-GDR-∆NCZnF, кодирующую химерный белок Dam-Rpn4∆NCZnF с делецией ДНК-связывающего домена, получали путем клонирования ПЦР-фрагмента гена RPN4, полученного с праймерами RPN4-NcoI-F и RPN4-∆NCZnF-R, в плазмиду YCp-GDR по сайтам NcoI и XhoI. Отсутствие посторонних мутаций в последовательностях клонированных фрагментов проверяли секвенированием.

Клетки штамма rpn4-∆, продуцирующие Dam-метилазу, соединенную с убиквитинзависимым дегроном Rpn4 (U-dam), гибридный белок Dam-Rpn4 или гибридные белки Dam-Rpn4-C/A и Dam-Rpn4∆NCZnF с нарушенной ДНК-связывающей активностью Rpn4, растили при 30°С до оптической плотности 1‒1.5 при длине волны 600 нм. Из полученной культуры выделяли геномную ДНК с использованием смеси фенол-хлороформ [27]. Далее 1 мкг геномной ДНК обрабатывали эндонуклеазами рестрикции MboΙ (“Thermo Fisher Scientific”) в концентрации 1 ед./мкл не менее 18 ч при 37°С. Обработанную ДНК амплифицировали методом ПЦР в реальном времени с праймерами, фланкирующими исследуемый GATC-сайт. Референтной последовательностью служил фрагмент гена RPT6, не содержащий сайтов GATC. Использованные в работе праймеры указаны в табл. 2. Каждую реакцию проводили в трех технических повторах на приборе LightCycler 480-II (“Roche Diagnostics”, США) в присутствии флуоресцентного красителя Eva Green (“Синтол”, Россия). Метилирующую активность (R) определяли по соотношению сигналов от обработанной и необработанной ферментом пробы. Относительную метилирующую активность (R_rel) определяли как соотношение метилирующих активностей Dam-Rpn4, или Dam-Rpn4-C/A, или Dam-Rpn4∆NCZnF к U‑dam. Разброс данных рассчитывали по ранее описанной методике [23].

ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией (ОТ). Относительные уровни мРНК интересующих генов определяли с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени, как описано ранее [8].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Картирование доменов Rpn4p, обеспечивающих устойчивость дрожжей к стрессовым факторам

Ранее нами проведен делеционный анализ RPN4 и оценена роль участков этого фактора в активации транскрипции протеасомных генов [8, 25]. Теперь полученный ранее набор мутантных производных RPN4 дополнен вариантами с делецией предполагаемого сигнала ядерной локализации (участок, кодирующий аминокислотные остатки 381‒398) и N-концевого домена “цинковых пальцев” (участок, кодирующий аминокислотные остатки 444‒468) (рис. 1а). В предыдущих работах картирование важных участков Rpn4p проводили в нормальных условиях роста дрожжей. Теперь основной задачей было определение участков Rpn4p, необходимых для обеспечения устойчивости дрожжевых клеток к различным стрессовым воздействиям, а именно: окислительному стрессу, вызванному действием перекиси водорода, ацетату кадмия и ингибитору трансляции – циклогексимиду. Согласно полученным данным (рис. 1б), как и ожидалось, продукция полноразмерного белка Rpn4p, его более активного производного Rpn4(4K-R) с заменой лизинов на аргинины в N-концевом трансактиваторном домене (NTAD) [8] или варианта с делецией N-концевого кислого домена (NAD), служащего убиквитинзависимым сигналом деградации Rpn4p [28], восстанавливает устойчивость мутантного штамма с делецией гена RPN4, ко всем стрессовым воздействиям. Делеция участка, состоящего из первых 56 аминокислот (Rpn4∆56), который входит в состав N-концевого сигнала убиквитиннезависимой деградации Rpn4p [29], лишь немного снижает защитную функцию Rpn4p.

Рис. 1.

Определение участков Rpn4p, обеспечивающих устойчивость дрожжей к стрессу. a – Схема положения делеций в Rpn4p. б – Результаты теста на устойчивость к стрессовым агентам штамма 334t rpn4-Δ, синтезирующего делеционные формы Rpn4p. Представлены фотографии репрезентативных чашек Петри после инкубации в течение 2 или 3 суток. В качестве положительного контроля использовали мутантный штамм rpn4-Δ, трансформированный плазмидой, кодирующей полноразмерный ген RPN4 (самый верхний ряд разведений), а в качестве негативного контроля – штамм rpn4-Δ, трансформированный вектором pPDX2 (второй ряд разведений сверху). CHX – циклогексимид.

Неожиданно дальнейшая делеция N-концевого домена Rpn4p привела к полной потере устойчивости дрожжей ко всем видам стресса, несмотря на то, что форма Rpn4∆109 сохраняла довольно высокую транскрипционную активность в отношении протеасомных генов [8]. Далее, хотя делеция 210 N-концевых а.о. полностью инактивировала Rpn4p в отношении транскрипции протеасомных генов [8, 25], мутантный вариант защищал клетки от действия окислительного стресса и кадмия. Следует отметить, что вариант с делецией 180 а.о. не обеспечивал защиту дрожжей от действия кадмия и окислительного стресса. Эти данные указывают на то, что между 180 и 210 а.о. может находится репрессорный домен, действующий в отношении непротеасомных генов-мишеней Rpn4p. Ранее нами и другими авторами выявлена способность Rpn4p функционировать в качестве репрессора транскрипции [12, 30]. Делеция С-концевого кислого домена (CAD), функционирующего как трансактиваторный домен [8], ожидаемо подавляла устойчивость дрожжей к окислительному стрессу и кадмию, но при этом защитные свойства в отношении циклогексимида сохранялись. Делеция центральной части белка, включающей оба кислых домена и участок между ними, инактивировала фактор в случае действия кадмия и значительно ослабляла при воздействии циклогексимида и окислительного стресса. Можно предположить, что полной инактивации не происходит из-за наличия NTAD у этих делеционных вариантов белка. На основании этих данных можно говорить о том, что делеция предполагаемого сигнала ядерной локализации Rpn4p не влияет на его функции, а также предположить наличие в его структуре еще одного сигнала ядерной локализации или возможность его транспорта в ядро в качестве белка, ассоциированного с протеасомой [4, 29]. Наиболее значимым и неожиданным результатом оказалось то, что при полной делеции ДНК-связывающего домена Rpn4p дрожжи сохраняют устойчивость к циклогексимиду и перекиси водорода, но становятся чувствительными к кадмию. Следует отметить, что при этом удаление N-концевого “цинкового пальца” с сохранением С-концевого “цинкового пальца” инактивировало Rpn4p в отношении всех видов стресса. Таким образом, для функционирования Rpn4p как антистрессорного фактора необязательно наличие ДНК-связывающего домена. Возможно, в этом случае Rpn4p вовлечен в белок-белковые взаимодействия.

Мутантный штамм с нарушенной экспрессией субъединицы 20S протеасомы проявляет повышенную устойчивость к циклогексимиду

Ранее при поиске мутаций, вызывающих сверхустойчивость к циклогексимиду, выявлены штаммы с мутациями в генах 20S протеолитического субкомплекса протеасомы [31]. Поскольку Rpn4p c делецией ДНК-связывающего домена не активирует транскрипцию протеасомных генов [8, 25], интересно было выяснить, способен ли мутантный штамм YPL с нарушенной Rpn4-зависимой регуляцией гена субъединицы PRE1 [15] проявлять сверхустойчивость к циклогексимиду. Согласно полученным результатам (рис. 2), штамм YPL проявлял повышенную устойчивость к циклогексимиду по сравнению со штаммом дикого типа при концентрации циклогексимида 50 нг/мкл. Однако при более высокой концентрации циклогексимида, 75 нг/мкл, разница в скорости формирования колоний мутанта и дикого типа отсутствовала. Ранее U. Gerlinger и соавт. сообщали [31], что не все мутации, в частности в гене PRE1, ведут к четко выраженному фенотипу сверхустойчивости к циклогексимиду. Как правило, таким фенотипом обладают штаммы, несущие мутации одновременно в двух генах (например, pre1-1 pre4-1), что соответствует очень сильному нарушению протеасомзависимого протеолиза. Можно отметить, что в штамме 334t rpn4-∆ нарушена деградация белков в двух внутриклеточных протеолитических системах: УПС (отсутствие трансактиватора) и автофагии (отсутствие ключевой протеазы Prb1p, обеспечивающей активацию других протеаз в аутофагосомах [32]). Возможно, такое серьезное нарушение внутриклеточного протеолиза функционально соответствует двойным мутациям в протеасомных генах и вносит вклад в наблюдаемый фенотип устойчивости к циклогексимиду в присутствие Rpn4∆210 и Rpn4∆NCZnF.

Рис. 2.

Проверка устойчивости к циклогексимиду (CHX) штаммов дикого типа и мутантов с нарушенной функцией протеасомы. Представлены фотографии репрезентативных чашек Петри после инкубации в течение 2 или 3 суток при 30°С. В эксперименте использованы штамм дикого типа BY4742 (WT), производный от него вариант с делецией гена RPN4 (rpn4-Δ) и две независимые колонии штамма YPL с нарушенной Rpn4-зависимой регуляцией экспрессии гена PRE1, кодирующего субъединицу 20S протеолитического комплекса протеасомы.

Rpn2p и Nas2p не взаимодействуют с Rpn4 в двугибридной дрожжевой системе

Полученные нами данные указывают на то, что нарушение экспрессии протеасомных генов вряд ли служит основным механизмом, посредством которого мутант Rpn4∆NCZnF обеспечивает устойчивость дрожжей к стрессу. Логично предположить, что в отсутствие ДНК-связывающей активности мутантный Rpn4p функционирует за счет взаимодействия с белками-партнерами и белковыми комплексами. Ранее показано, что Rpn4p может очищаться вместе с протеасомой [33] и способен связываться с отдельными субъединицами 19S регуляторного комплекса протеасомы, включая Rpn2p [4, 29]. Кроме того, в масштабных исследованиях белок-белковых взаимодействий показано, что Rpn4p физически взаимодействует с Nas2p [34], который служит одним из специализированных шаперонов, обеспечивающих сборку 19S регуляторного субкомплекса протеасомы [35]. Чтобы проверить полученные ранее данные о взаимодействии Rpn4p с Rpn2p и Nas2p, мы использовали дрожжевую двугибридную систему. Положительным контролем служили конструкции, продуцирующие белки Su(Hw) и Mod(mdg4), взаимодействие между которыми в двугибридной системе показано ранее [26]. Согласно полученным данным (рис. 3a), Rpn4p, будучи соединенным с ДНК-связывающим доменом Gal4p, может активировать экспрессию репортерных генов и в отсутствие белка-партнера с трансактиваторным доменом. Очевидно, это происходит благодаря наличию собственных трансактиваторных доменов Rpn4p. В парах pGBT-Rpn2/pGAD425-Rpn4 и pGBT-Nas2/pGAD425-Rpn4 не выявлено активации репортерных генов, что выражается в отсутствии роста дрожжевых колоний на селективной среде. Следует отметить, что дрожжи растили в присутствии 5 мМ 3-AT, ‒ чтобы надежно подавлять фоновую активацию репортерных генов. Полученные нами данные согласуются с результатами систематичного анализа, проведенного G. Cagney и др. [36], по взаимодействию между субъединицами протеасомы в дрожжевой двугибридной системе. Авторы тоже не обнаружили продуктивного взаимодействия между Rpn4p и Rpn2p при использовании 3-AT, но выявили взаимодействие Rpn4p со структурной субъединицей 20S протеасомы Pre7p. Однако позже S. Ha и соавт. [29] с помощью высокочувствительного метода переноса биотиновой метки показали взаимодействие Rpn4p in vitro с такими субъединицами 19S регуляторного комплекса протеасомы, как Rpn2p, Rpn5p, Rpt1p и Rpt6. Можно предположить, что выявленные взаимодействия Rpn4p с протеасомными субъединицами кратковременные и служат “инструментом” деградации Rpn4p в протеасоме.

Рис. 3.

Анализ взаимодействия Rpn4p с субъединицей 19S регуляторного комплекса протеасомы Rpn2p и шапероном Nas2p в дрожжевой двугибридной системе. а – Фотография репрезентативной чашки Петри. б – Схема комбинаций плазмид, использованных при трансформации дрожжей. Штамм PJ69-4a, трансформированный комбинацией плазмид pGBT-Su(Hw) и pGAD-mod, служил положительным контролем наличия белок-белковых взаимодействий.

Rpn4p может привлекаться к промоторным областям генов за счет белок-белковых взаимодействий

В ходе исследования взаимодействия Rpn4p с промоторными областями генов, как содержащих его сайты связывания (PACE или MACE), так и не содержащих их, нами неожиданно обнаружено, что Rpn4p может привлекаться к промотору гена циклина CLN2, который не содержит сайтов связывания фактора. Более того, мутантный Rpn4p с ДНК-связывающим доменом, инактивированным путем внесения замен остатков цистеина на аланины, также привлекается к промотору CLN2, хотя и с меньшей силой (рис. 4а). Полученные данные указывают на то, что Rpn4p может привлекаться к регуляторным областям генов, по-видимому, за счет белок-белковых взаимодействий. Из литературных данных известно, что привлечение фактора транскрипции к гену может быть непродуктивным, то есть не приводить к изменению экспрессии гена [37]. С целью выяснить, продуктивно ли привлечение Rpn4p к CLN2, мы определили уровень мРНК CLN2 в штамме BY4742 с мутацией rpn4-∆ относительно изогенного штамма дикого типа. Оказалось, что в мутантном штамме уровень мРНК CLN2 повышен в среднем в 2 раза (рис. 4б). Из этого следует, что Rpn4p служит репрессором гена CLN2. Кроме того, проверили происходит ли взаимодействие мутантного Rpn4p с делецией ДНК-связывающего домена, Rpn4∆NCZnF, с геном CLN2. Согласно полученным данным (рис. 4в), взаимодействие Rpn4∆NCZnF усилилось и превысило уровень, наблюдаемый в случае белка дикого типа. Взаимодействие Rpn4∆NCZnF усилилось также и с промоторными областями Rpn4p-зависимых генов: RPT6, содержащего PACE, и MAG1, содержащего MACE. Эти результаты можно объяснить полученными нами ранее данными о том, что уровень экспрессии мутантного белка Rpn4∆NCZnF значительно выше, чем белка дикого типа [25]. Таким образом, показано, что Rpn4p может привлекаться к регулируемым им генам за счет белок-белковых взаимодействий и этот процесс стимулируется в случае делеции ДНК-связывающего домена.

Рис. 4.

Rpn4p может привлекаться к промоторным областям регулируемых им генов за счет белок-белковых взаимодействий. а – Привлечение Rpn4p к промоторным областям генов-мишеней и генов, не регулируемых Rpn4p. В анализе DamID за единицу активности принят сигнал, полученный при метилировании гена ACT1 химерным белком Dam-Rpn4. б – Анализ относительного уровня мРНК гена CLN2 с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. В качестве референсного гена использован PDA1. в – Результаты анализа DamID с использованием химерного белка Dam-Rpn4∆NCZnF. Данные представлены в виде среднего для трех независимых повторов, разброс данных представлен стандартным отклонением. В экспериментах использованы штаммы BY4742 и производный от него BY4742 rpn4-∆. Статистическая значимость различий в средних определена с помощью t-критерия Стьюдента. NS – отличия статистически незначимы; **0.001 < p-value < 0.01; ***p-value < 0.001.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В этой работе мы использовали набор делеционных производных Rpn4p, чтобы картировать функционально важные участки этого транскрипционного фактора, ответственные за его “работу” в условиях воздействия различных видов стресса. Установлено, что бóльшая часть N-концевой области, содержащая трансактиваторный домен NTAD, а также кислый трансактиваторный домен CAD нужны для устойчивости дрожжей ко всем видам стресса. В то же время без NAD, предполагаемого сигнала ядерной локализации или ДНК-связывающего домена Rpn4p может продолжать обеспечивать защиту дрожжей от стрессовых воздействий. Результаты, полученные с помощью DamID-анализа, указывают на возможность Rpn4p, лишенного ДНК-связывающего домена, участвовать в регуляции экспрессии генов за счет белок-белковых взаимодействий.

Отметим, что мутантные варианты Rpn4p без NAD и NCZnF наиболее активны в отношении устойчивости дрожжей к циклогексимиду и окислительному стрессу (рис. 1б). Эти данные можно объяснить повышением содержания соответствующих мутантных вариантов Rpn4p, которые наблюдали ранее [25]. В случае делеции NAD стабилизация Rpn4p связана, по-видимому, с нарушением его деградации по убиквитинзависимому пути [28]. На данный момент неясно, по какой причине происходит стабилизация Rpn4p при делеции ДНК-связывающего домена.

Отсутствие активности предполагаемого сигнала ядерной локализации можно рассматривать как указание на наличие, как минимум, еще одного сигнала транспорта Rpn4p в ядро, который компенсирует отсутствие этого участка. Таким сигналом может служить N-концевой дегрон, который распознается α-кариоферином Srp1p в комплексе с Sts1p [38]. Это предположение согласуется с полученными нами данными, указывающими на то, что делеция первых 56 а.о., включающих значительную часть N-дегрона, незначительно влияет на активность Rpn4p. Однако делеция 109 а.о., включающая в себя полный N-дегрон, подавляет способность Rpn4 обеспечивать устойчивость дрожжей к стрессу (рис. 1б). Отметим, что мутантный белок сохраняет некоторую активность активатора транскрипции протеасомных генов [8]. Это не исключает того, что делеция 109 а.о. может подавлять способность Rpn4p регулировать экспрессию непротеасомных генов. Не исключено также, что предполагаемый сигнал ядерной локализации менее активен, чем N-концевой дегрон.

Полученные нами и другими авторами данные позволяют сформулировать несколько предположений о том, каким образом Rpn4p, лишенный ДНК-связывающей функции, обеспечивает устойчивость дрожжей к стрессу.

Первое предположение заключается в том, что Rpn4p без ДНК-связывающего домена может нарушать деградацию субстратов протеасомы, включая белки, обеспечивающие устойчивость к рассматриваемым видам стресса. Эта гипотеза основана на данных о том, что делеция ДНК-связывающего домена повышает содержание Rpn4 [25], а так как при этом сохранена N-концевая область Rpn4p, обеспечивающая взаимодействие с 19S регуляторным комплексом протеасомы [29], то мутантный Rpn4p продолжает более интенсивно связываться с протеасомой, конкурируя с другими ее субстратами. Кроме того, мутантный Rpn4p сохраняет также Ubr2-зависимый дегрон [28], благодаря чему может конкурировать за связывание и полиубиквитинирование с другими субстратами Ubr2-лигазы, вызывая их стабилизацию.

Второе предположение заключается в привлечении Rpn4p в качестве трансактиваторного домена к генам, не имеющим его сайтов связывания. В отсутствие ДНК-связывающего домена происходит диссоциация мутантного Rpn4p от участков его связывания в геноме и тогда, взаимодействуя с другими факторами транскрипции, он становится участником регуляции другого набора генов, в том числе вовлеченных в устойчивость к исследуемым видам стресса.

И, наконец, третье предположение состоит в том, что Rpn4p связывается с другими белками, не имеющими отношение к регуляции транскрипции генов, но вовлеченными в экспрессию генетической информации на других этапах, в том числе и в устойчивость дрожжей к циклогексимиду и окислительному стрессу. Так, согласно информации, представленной в базе данных Saccharomyces cerevisiae database (https://www.yeastgenome.org/ посещение 06.02.2022), обнаружено физическое взаимодействие Rpn4p с 29 белками. Почти половину из этих белков составляют субъединицы протеасомы или ее шапероны (Nas2p, Pre2p, Pre7p, Rpn2p, Rpn5p, Rpn6p, Rpn10p, Rpn12p, Sem1p, Rpt1p, Rpt2p, Rpt3p, Rpt5p, Rpt6p), а также ферменты системы полиубиквитинирования белков (Ubr1p и Mub1p) и Hsp40p (Apj1p), вовлеченный в SUMO-опосредованную деградацию белковых агрегатов. Взаимодействие с этими белками, по-видимому, функционально ведет к деградации Rpn4p. К этой же группе можно отнести Srp1p, гомолог кариоферина-α, который, помимо импорта белков в ядро, взаимодействует с рибосомой и протеасомой и опосредует деградацию новосинтезированных белков [38]. Показано, что Srp1p взаимодействует с областью N-концевого дегрона Rpn4p и обеспечивает его деградацию в протеасоме, а нарушение функционирования Srp1p повышает чувствительность дрожжей к циклогексимиду и другим стрессовым факторам, вызывающим накопление неправильно свернутых белков [38]. Помимо Srp1p в связывании и транспорте Rpn4p в ядро может участвовать Mog1p, который, в свою очередь, связывается с Ran-GTPазой [39]. Другая часть белков, взаимодействующих с Rpn4, вовлечена в регуляцию экспрессии генов на уровне организации хроматина (Ccr4p, Esa1p, Isw1p), метаболизма мРНК (Nab2p, Dhh1p, Puf3p), регуляции трансляции (Caf20p, Hek2p) и cворачивания новосинтезированных белков (Ssb2p). Отдельно нужно отметить взаимодействие Rpn4p c Dpb2p – второй большой субъединицей ДНК-полимеразы II, участвующей в репликации и репарации ДНК [40]. Известно, что ДНК-полимераза II, участвует в репаративном синтезе ДНК в ходе устранения повреждений ДНК, вызванных окислительным стрессом [41].

Полученные нами и другими авторами [36] данные указывают на то, что взаимодействие Rpn4p с компонентами УПС имеет временный характер и ведет к расщеплению Rpn4p. Возможно, такое же значение имеют взаимодействия Rpn4p с шаперонами, участвующими в сворачивании новосинтезированных белков. Взаимодействие Rpn4p (прямое или опосредованное) с белками, участвующими в регуляции экспрессии генов на уровне организации хроматина, по-видимому, связано с его функциями как регулятора экспрессии генов. На сегодняшний день неясно, имеет ли функциональное значение взаимодействие Rpn4p с регуляторами трансляции и ДНК-полимеразой II, которые, в свою очередь, имеют отношение к ответу дрожжей на действие циклогексимида и окислительный стресс. Очевидно, что взаимодействие с этими белками не требует участия ДНК-связывающего домена Rpn4p. Таким образом, имеющиеся на сегодняшний день данные указывают на то, что Rpn4p может быть вовлечен в белок-белковые взаимодействия, которые выходят за рамки его функций как субстрата протеасомы или фактора транскрипции. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы верифицировать обнаруженные белки-партнеры и установить значение взаимодействий Rpn4p с ними.

Авторы выражают благодарность Центру высокоточного редактирования генома и генетических технологий для биомедицины ИМБ РАН за предоставленные вычислительные мощности и методики для анализа данных.

Работа выполнена при поддержке Российского Научного Фонда (грант № 17-74-30030).

Работа выполнена с использованием оборудования центра коллективного пользования “Геном” ИМБ РАН (http://www.eimb.ru/ru1/ckp/ccu_genome_ce.php).

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследований.

Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.