Молекулярная биология, 2022, T. 56, № 4, стр. 604-618

Эффективная вирусная доставка в нейрональную культуру генетических конструкций для моделирования и генной терапии GNAO1-энцефалопатии

Е. А. Лунев abc, А. А. Шмидт a, С. Г. Васильева a, И. М. Савченко a, В. А. Логинов a, В. И. Марина b, Т. В. Егорова a, М. В. Бардина abc*

a Институт биологии гена Российской академии наук
119334 Москва, Россия

b ООО “Марлин Биотех”
354340 Сочи, Россия

c Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины, Институт биологии гена Российской академии наук
119334 Москва, Россия

* E-mail: maryana.bardina@gmail.com

Поступила в редакцию 31.01.2022
После доработки 25.02.2022
Принята к публикации 28.02.2022

Аннотация

GNAO1-энцефалопатия – орфанное генетическое заболевание, которое характеризуется ранней младенческой эпилепсией, нарушением контроля над движениями и серьезной задержкой развития. Заболевание вызывается мутациями в гене GNAO1, приводящими к нарушению функций кодируемого этим геном белка Gαo1. Методы лечения GNAO1-энцефалопатии отсутствуют, а симптоматическая терапия неэффективна. Фенотипическая гетерогенность заболевания указывает на необходимость персонализированного подхода к разработке терапии пациентов с конкретным патогенным вариантом GNAO1, что требует изучения механизма заболевания на животных и клеточных моделях. В настоящей работе разработан подход к созданию клеточных моделей GNAO1-энцефалопатии на первичной культуре нейронов здоровой мыши, а также к тестированию препаратов генной терапии in vitro. С этой целью нами оптимизирована доставка трансгенов в Gαo1-экспрессирующие клетки с помощью аденоассоциированных вирусов (ААВ). Оценен тропизм пяти нейротропных серотипов ААВ (1, 2, 6, 9, DJ) к Gαo1-позитивным нейронам в культуре из цельного мозга мыши. Самый высокий потенциал в качестве средства доставки репортера показал серотип DJ, который заражал до 66% таргетных нейронов без выраженной цитотоксичности. AAВ-DJ также обеспечивал эффективную доставку и экспрессию генетических конструкций, кодирующих нормальную и мутантную форму Gαo1, а также коротких шпилечных РНК (shРНК) для супрессии эндогенного Gnao1 в нейронах мыши. Полученные нами результаты позволят продвинуться в изучении механизма патогенеза клинических вариантов GNAO1-энцефалопатии, а также тестировать конструкции для генной терапии данного заболевания в клеточных моделях.

Ключевые слова: аденоассоциированные вирусы, орфанные заболевания, GNAO1-энцефалопатия, Gαo1, вирусная доставка, in vitro моделирование заболеваний человека, генная терапия, персонализированная медицина, первичная нейрональная культура, короткие шпилечные РНК

Список литературы

  1. Nakamura K., Kodera H., Akita T., Shiina M., Kato M., Hoshino H., Terashima H., Osaka H., Nakamura S., Tohyama J., Kumada T., Furukawa T., Iwata S., Shiihara T., Kubota M., Miyatake S., Koshimizu E., Nishiyama K., Nakashima M., Tsurusaki Y., Miyake N., Hayasaka K., Ogata K., Fukuda A., Matsumoto N., Saitsu H. (2013) De novo mutations in GNAO1, encoding a Gαo subunit of heterotrimeric G proteins, cause epileptic encephalopathy. Am. J. Hum. Genet. 93, 496–505.

  2. EuroEPINOMICS-RES Consortium, Epilepsy Phenome/Genome Project, and Epi4K Consortium (2014) De novo mutations in synaptic transmission genes including DNM1 cause epileptic encephalopathies. Am. J. Hum. Genet. 95, 360–370.

  3. Worley P.F., Baraban J.M., Van Dop C. (1986) Go, a guanine nucleotide-binding protein: immunohistochemical localization in rat brain resembles distribution of second messenger systems. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83, 4561–4565.

  4. Jiang M., Bajpayee N.S. (2009) Molecular mechanisms of go signaling. Neurosignals. 17, 23–41.

  5. Feng H., Khalil S., Neubig R.R., Sidiropoulos C. (2018) A mechanistic review on GNAO1-associated movement disorder. Neurobiol. Dis. 116, 131–141.

  6. Ananth A.L., Robichaux-Viehoever A., Kim Y.M., Hanson-Kahn A., Cox R., Enns G.M., Strober J., Willing M., Schlaggar B.L, Wu Y.W., Bernstein J.A. (2016) Clinical course of six children with GNAO1 mutations causing a severe and distinctive movement disorder. Pediatr. Neurol. 59, 81–84.

  7. Danti F.R, Serena Galosi S., Romani M., Montomoli M., Carss K.J., Raymond F.L., Parrini E., Bianchini C., McShane T., Dale R.C., Mohammad S.S., Shah U., Mahant N., Ng J., McTague A., Samanta R., Vadlamani G., Valente E.M., Leuzzi V., Kurian M.A., Guerrini R. (2017) GNAO1 encephalopathy: broadening the phenotype and evaluating treatment and outcome. Neurol. Genet. 3, 143.

  8. Menke L.A., Engelen M., Alders M., Odekerken V.J.J., Baas F., Cobben J.M. (2016) Recurrent GNAO1 mutations associated with developmental delay and a movement disorder. J. Child. Neurol. 31, 1598–1601.

  9. Saitsu H., Fukai R., Ben-Zeev B., Sakai Y., Mimaki M., Okamoto N., Suzuki Y., Monden Y., Saito H., Tziperman B., Torio M., Akamine S., Takahashi N., Osaka H., Yamagata T., Nakamura K., Tsurusaki Y., Nakashima M., Miyake N., Shiina M., Ogata K., Matsumoto N. (2015) Phenotypic spectrum of GNAO1 variants: epileptic encephalopathy to involuntary movements with severe developmental delay. Eur. J. Hum. Genet. 24, 129–134.

  10. Roddy D.W., Farrell C., Doolin K., Roman E., Tozzi L., Frodl T., O’Keane V., O’Hanlon E. (2019) The hippocampus in depression: more than the sum of its parts? Advanced hippocampal substructure segmentation in depression. Biol. Psychiatry. 85, 487–497.

  11. Kim S.Y., Shim Y., Ko Y.J., Park S., Jang S.S., Lim B.C., Ki Joong Kim K.J., Chae J. (2020) Spectrum of movement disorders in GNAO1 encephalopathy: in-depth phenotyping and case-by-case analysis. Orphanet. J. Rare. Dis. 15, 1–6.

  12. Feng H., Sjögren B., Karaj B., Shaw V., Gezer A., Neubig R.R. (2017) Movement disorder in GNAO1 encephalopathy associated with gain-of-function mutations. Neurology. 89, 762–770.

  13. Arya R., Spaeth C., Gilbert D.L., Leach J.L., Holland K.D. (2017) GNAO1-associated epileptic encephalopathy and movement disorders: c.607G>A variant represents a probable mutation hotspot with a distinct phenotype. Epileptic. Disord. 19, 67–75.

  14. Bedbrook C.N., Deverman B.E., Gradinaru V. (2018) Viral strategies for targeting the central and peripheral nervous systems. Annu. Rev. Neurosci. 41, 323–348.

  15. Haery L., Deverman B.E., Matho K.S., Cetin A., Woodard K., Cepko C., Guerin K.I., Rego M.A., Ersing I., Bachle S.M., Joanne Kamens J., Fan M. (2019) Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation. Front. Neuroanat. 13. https //doi.org /10.3389 /fnana.2019.0093

  16. Hammond S.L., Leek A.N., Richman E.H., Tjalkens R.B. (2017) Cellular selectivity of AAV serotypes for gene delivery in neurons and astrocytes by neonatal intracerebroventricular injection. PLoS One. 12, e0188830.

  17. Kondratov O., Kondratova L., Mandel R.J., Coleman K., Savage M.A., Gray-Edwards H.L., Ness T.J., Rodriguez-Lebron E., Bell R.D., Rabinowitz J., Gamlin P.D., Zolotukhin S. (2021) A comprehensive study of a 29-capsid AAV library in a non-human primate central nervous system. Mol. Ther. 29, 2806–2820.

  18. Wang D., Tai P.W.L., Gao G. (2019) Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat. Rev. Drug. Discov. 18, 358–378.

  19. Hocquemiller M., Giersch L., Audrain M., Parker S., Cartier N. (2016) Adeno-associated virus-based gene therapy for CNS diseases. Hum. Gene. Ther. 27, 478–496.

  20. Borel F., Kay M.A., Mueller C. (2014) Recombinant AAV as a platform for translating the therapeutic potential of RNA interference. Mol. Ther. 22, 692–701.

  21. Wang D., Zhang F., Gao G. (2020) CRISPR-based therapeutic genome editing: strategies and in vivo delivery by AAV vectors. Cell. 181, 136–150.

  22. Moffat J., Grueneberg D.A., Yang X., Kim S.Y., Kloepfer A.M., Hinkle G., Piqani B., Eisenhaure T.M., Luo B., Grenier J.K., Carpenter A.E., Foo S.Y., Stewart S.A., Stockwell B.R., Hacohen N., Hahn W.C., Lander E.S., Sabatini D.M., Root D.E. (2006) A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124, 1283–1298.

  23. Addgene: Protocol pLKO.1–TRC Cloning Vector. https://www.addgene.org/protocols/plko/ (accessed January 31, 2022)

  24. Starikova A.V., Skopenkova V.V., Polikarpova A.V., Reshetov D.A, Vassilieva S.G, Velyaev O.A., Shmidt A.A., Savchenko I.M., Soldatov V.O., Egorova T.V., Bardina M.V. (2022) Therapeutic potential of highly functional codon-optimized microutrophin for muscle-specific expression. Sci. Rep. 12, 1–13.

  25. Buclez P.O., Dias Florencio G., Relizani K., Beley C., Garcia L., Benchaouir R. (2016) Rapid, scalable, and low-cost purification of recombinant adeno-associated virus produced by baculovirus expression vector system. Mol. Ther. Methods. Clin. Dev. 3, 16035.

  26. Nikitin E.S., Bal N.V., Malyshev A., Ierusalimsky V.N., Spivak Y., Balaban P.M., Volgushev M. (2017) Encoding of high frequencies improves with maturation of action potential generation in cultured neocortical neurons. Front. Cell. Neurosci. 11, 28.

  27. Geissler M., Gottschling C., Aguado A., Rauch U., Wetzel C.H., Hatt H., Faissner A. (2013) Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation. J. Neurosci. 33, 7742.

  28. Schindelin J., Arganda-Carreras I., Frise E., Kaynig V., Longair M., Pietzsch T., Preibisch S., Rueden C., Saalfeld S., Schmid B., Tinevez J., White D.J., Hartenstein V., Eliceiri K., Tomancak P., Cardona A. (2012) Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676–682.

  29. Carpenter A.E., Jones T.R., Lamprecht M.R., Clarke C., Kang I.H., Friman O., Guertin D.A., Chang J.H., Lindquist R.A., Moffat J., Golland P., Sabatini D.M. (2006) CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, 1–11.

  30. Masuho I., Mototani Y., Sahara Y., Asami J., Nakamura S., Kozasa T., Inoue T. (2008) Dynamic expression patterns of G protein-regulated inducer of neurite outgrowth 1 (GRIN1) and its colocalization with Gαo implicate significant roles of Gαo-GRIN1 signaling in nervous system. Dev. Dyn. 237, 2415.

  31. Choi J.M., Kim S.S., Choi C.Il., Cha H.L., Oh H.H., Ghil S., Lee Y.D., Birnbaumer L. (2016) Development of the main olfactory system and main olfactory epithelium-dependent male mating behavior are altered in Go-deficient mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 113, 10974–10979.

  32. GNAO1 protein expression summary – The Human Protein Atlas. https://www.proteinatlas.org/ENSG00000087258-GNAO1 (accessed January 25, 2022)

  33. Vandenberghe L.H., Xiao R., Lock M., Lin J., Korn M., Wilson J.M. (2010) Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Hum. Gene Ther. 21, 1251–1257.

  34. Nectow A.R., Nestler E.J. (2020) Viral tools for neuroscience. Nat. Rev. Neurosci. 21, 669–681.

  35. Bulcha J.T., Wang Y., Ma H., Tai P.W.L., Gao G. (2021) Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduct. Target Ther. 6, 1–24.

  36. Howard D.B., Powers K., Wang Y., Harvey B.K. (2008) Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro. Virology. 372, 24–34.

  37. Royo N.C., Vandenberghe L.H., Ma J.Y., Hauspurg A., Yu L.Y., Maronski M., Johnston J., Dichter M.A., Wilson J.M., Watson D.J. (2008) Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Res. 1190, 15.

  38. Grimm D., Lee J.S., Wang L., Desai T., Akache B., Storm T.A., Kay M.A. (2008) In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J. Virol. 82, 5887.

  39. Muntean B.S., Masuho I., Dao M., Sutton L.P., Zucca S., Iwamoto H., Patil D.N., Wang D., Birnbaumer L., Blakely R.D., Grill B., Martemyanov K.A. (2021) Gαo is a major determinant of cAMP signaling in the pathophysiology of movement disorders. Cell Rep. 34, 108718.

  40. Aimiuwu O.V., Fowler A.M., Sah M., Teoh J.J., Kanber A., Pyne N.K., Petri S., Chana Rosenthal-Weiss C., Mu Yang M., Scott Q., Harper S.Q., Wayne N., Frankel W.N. (2020) RNAi-based gene therapy rescues developmental and epileptic encephalopathy in a genetic mouse model. Mol. Ther. 28, 1706–1716.

  41. Choudhury S.R., Harris A.F., Cabral D.J., Keeler A.M., Sapp E., Ferreira J.S., Gray-Edwards H.L., Johnson J.A., Johnson A.K., Su Q., Stoica L., DiFiglia M., Aronin N., Martin D.R., Gao G., Sena-Esteves M. (2016) Widespread central nervous system gene transfer and silencing after systemic delivery of novel AAV-AS vector. Mol. Ther. 24, 726–735.

  42. Martier R., Liefhebber J.M., García-Osta A., Miniarikova J., Cuadrado-Tejedor M., Espelosin M., Ursua S., Petry H., van Deventer S., Evers M.M., Konstantinova P. (2019) Targeting RNA-mediated toxicity in C9orf72 ALS and/or FTD by RNAi-based gene therapy. Mol. Ther. Nucl. Acid. 16, 26–37.

  43. Nobre R.J., Lobo D.D., Henriques C., Duarte S.P., Lopes S.M., Silva A.C., Lopes M.M., Mariet F., Schwarz L.K., Baatje M.S., Ferreira V., Vallès A., Almeida L., Evers M.M., Toonen L.J.A. (2021) MiRNA-mediated knockdown of ATXN3 alleviates molecular disease hallmarks in a mouse model for spinocerebellar ataxia type 3. Nucl. Acid Ther. https://doi.org/10.1089/nat.2021.0020

  44. Strings-Ufombah V., Malerba A., Kao S.C., Harbaran S., Roth F., Cappellari O., Lu-Nguyen N., Takahashi K., Mukadam S., Kilfoil G., Claudia Kloth C., Roelvink P., Dickson G., Trollet C., Suhy D. (2021) BB-301: a silence and replace AAV-based vector for the treatment of oculopharyngeal muscular dystrophy. Mol. Ther. Nucl. Acids. 24, 67–78.

Дополнительные материалы отсутствуют.