1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Молекулярная биология
  4. T. 57, № 1, 2023

Молекулярная биология, 2023, T. 57, № 1, стр. 101-105

Активность антирестрикционного белка ArdB в отношении эндонуклеазы EcoAI

А. А. Кудрявцева a, *, В. А. Алехин a, М. Д. Лебедева b, E. Csefalvay c, M. Weiserova d, И. В. Манухов a, e

a Московский физико-технический институт (Национальный исследовательский университет)
141707 Московская обл., Долгопрудный, Россия

b Автономная некоммерческая общеобразовательная организация “Физтех-лицей” им. П.Л. Капицы
141707 Московская обл., Долгопрудный, Россия

c Laboratory of Structural Biology and Bioinformatics, Institute of Microbiology, Academy of Sciences of the Czech Republic
37333 Nove Hrady, Zamek 136, Czech Republic

d Institute of Microbiology, Academy of Sciences of the Czech Republic
14220 Praha 4, Vídeňská 1083, Czech Republic

e Московский государственный университет пищевых производств
125080 Москва, Россия

* E-mail: kudryavtseva@phystech.edu

Поступила в редакцию 30.07.2022
После доработки 08.08.2022
Принята к публикации 08.08.2022

Полный текст (PDF)

Аннотация

Белки семейства ArdB подавляют активность белков системы рестрикции–модификации I типа (RM-I). Механизм действия ArdB к настоящему моменту остается неизвестным; спектр ингибируемых ими мишеней исследован недостаточно. Нами показано, что присутствие гена ardB из конъюгативной плазмиды R64 подавляет активность EcoAI – представителя семейства IB системы рестрикции–модификации. Ввиду обнаруженного отсутствия специфичности ArdB к определенному семейству рестриктаз системы RM-I (ингибирует как IA-, так и IB-семейство) можно предполагать, что механизм антирестрикционной активности этого белка не зависит от последовательности как ДНК в сайте узнавания, так и структуры рестриктазы системы RM-I.

Ключевые слова: антирестрикция, RM-I, ArdB, EcoAI

Для защиты генетического материала от гидролиза системами рестрикции–модификации вирусы, плазмиды и транспозоны используют ряд стратегий, одна из которых – продукция антирестрикционных белков. К ним относятся такие ингибиторы рестриктаз, как Ocr, ArdA и ArdB [1–3]. Некоторые антирестриктазы (Ocr и ArdA) относятся к ДНК-миметиками, т.е. структурно и электростатически имитируют В-форму ДНК и за счет этого функционируют как конкурентные ингибиторы ферментов рестрикции [4, 5]. Белок ArdB не относится к ДНК-миметикам, так как его структура не имеет ничего общего со структурой ДНК [6]. Ранее была высказана гипотеза, согласно которой механизм действия белков семейства ArdB состоит в том, что они неспецифически связываются с ДНК [7], поэтому рестриктаза I типа, транслоцируя ДНК перед ее гидролизом, “сталкивается” с молекулой антирестрикционного белка. В результате R-субъединица рестриктазы образуется комплекс с ArdB, что блокирует транслокацию и соответственно рестрикцию [8]. Однако пока это только неподтвержденная гипотеза.

Антирестрикционная активность ArdB описана А. Белогуровым (А. Belogurov) и др. [9] для представителя семейства IА ‒ EcoKI. А D. Serfiotis-Mitsa и соавт. [10] показали, что ArdB ингибирует рестриктазы из семейств IВ, IС и ID. Однако авторы не сравнивали активность ArdB против семейств IA и IB системы рестрикции–модификации I типа (RM-I), так как гены исследованных рестриктаз были локализованы в хромосомах бактерий неизогенных штаммов.

В представленной работе проведено сравнение антирестрикционной активности ArdB по отношению к ферментам EcoKI и EcoAI системы RM-I в штамме Escherichia coli TG1.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Бактериальные штаммы и условия культивирования. Штамм Escherichia coli TG1 (thi relA supE44 hsdR17 hsdM Δ(lac-proAB) [F' traD36 proAB lacIqZ ΔM15]) был получен из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) НИЦ “Курчатовский институт” (Москва, Россия). Клетки культивировали в среде LB (“Диа-М”, Россия) с добавлением антибиотиков: ампициллин (400 мкг/мл), канамицин (80 мкг/мл) или хлорамфеникол (20 мкг/мл). Агаризованная среда содержала 1.5% Бактоагара (“Диа-М”). Верхний слой содержал 0.7% Бактоагара и при индукции промотора гена PrhaB – 2 г/л рамнозы (“Диа-М”).

Конструирование плазмид. В качестве источника гена ardB использовали конъюгативную плазмиду R64, в качестве источника генов, определяющих экспрессию EcoKI, – хромосому штамма E. coli MG1655 (ВКПМ НИЦ “Курчатовский институт”). В качестве источника генов, определяющих экспрессию EcoAI, использовали хромосому E. coli NK354 [10].

ПЦР-амплификацию клонированных генов, эндонуклеазную обработку, электрофорез в агарозном геле, изолирование фрагментов ДНК проводили по общепринятой методике [11].

Наборы последовательно расположенных генов hsd (hsdS, hsdR, hsdM) с конститутивными промоторами, определяющими экспрессию систем рестрикции–модификации EcoKI и EcoAI, были клонированы в вектор pACYC184 по сайтам рестрикции BamHI, HindIII.

Полученные конструкции представлены в табл. 1.

Таблица 1.

Плазмиды, использованные в работе

Плазмида Описание Источник
pAM35 В вектор pACYC184 вставлены гены субъединиц S, M и R рестриктазы EcoAI под контролем собственного промотора, Cmr Эта работа
pACYCEcoKI В вектор pACYC184 вставлены гены субъединиц S, M и R рестриктазы EcoКI под контролем собственного промотора, Cmr Эта работа
pTZArdB Вектор pTZ57R содержит ген ardB из плазмиды R64 под контролем промотора Plac, Apr [12]
pArdBRam Вектор pRhamhIL-10LT содержит ген ardB из плазмиды R64 под контролем сильного, индуцируемого рамнозой промотора гена rhaB, Kmr Эта работа

Трансформацию бактерий плазмидами проводили кальциевым методом [11].

Анализ ферментативной активности рестриктаз. Эндонуклеазную активность ферментов определяли с использованием фаговой методики [13] – по эффективности посева (ЕОР – efficiency of plating) фага λ.0 – и выражали как отношение числа бляшек на газоне штамма E. coli TG1 с тем или иным набором плазмид к их числу на газоне того же штамма, не несущего плазмид. Активность рестриктаз оценивали по снижению ЕОР по отношению к штамму TG1 без плазмид.

Экспрессия и анализ антирестрикционной активности ArdB. Для проверки антирестрикционной активности клетки инкубировали в среде LB в течение 4 ч с аэрацией 200 об/мин с последующим добавлением фага λ (любезно предоставлен проф. R. Devoret, Laboratoire d’Enzymologie, Centre National de la Recherche Scientifique, Франция) и высевом на агаризованную среду. Величину EOP оценивали как отношение числа полученных негативных колоний на газоне с исследуемыми клетками к числу негативных колоний, образованных E. coli TG1.

Для индукции экспрессии гена, определяющего синтез ArdB(R64) под контролем промотора PrhaB, в среду LB добавляли рамнозу (2 мг/мл) через 2 ч после засева (OD600 ~ 0.1).

Уровень экспрессии ArdB контролировали методом электрофореза в 15%-ном ПААГ в денатурирующих условиях (SDS-PAGE) с окрашиванием Кумасси G-250 [14].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для оценки антирестрикционной активности ArdB клетки E. coli TG1 трансформировали плазмидами, содержащими гены системы RM-I: p-ACYCEcoKI (семейство IA) или pAM35 (семейство IB), – и плазмидами с геном ardB: pTZArdB или pArdBRam. Их исследовали по отдельности или в комбинации (рестриктаза + антирестриктаза). В результате отслеживали влияние трех разных концентраций ArdB в клетке: с плазмидой pTZArdB (ardB под промотором гена Plac, но без индукции ИПТГ), pArdBRam с промотором гена PrhaB, который сильнее Plac, и pArdBRam с добавлением рамнозы для индукции экспрессии с промотора PrhaB.

На полученные трансформанты высевали фаг λ.0 для определения ЕОР, как описано выше. Результаты проведенных экспериментов представлены в табл. 2.

Таблица 2.  

Антирестрикционная активность ArdB

Штамм E. coli EOPa Штамм E. coli EOP
EcoАI (семейство IВ) EcoKI
(семейство IA)b
TG1 1.00 ± 0.11 TG1 1.0 ± 0.11
TG1-pAM35 (5.5 ± 1.78) × 10–2 TG1-pACYCEcoKI (4.7 ± 2.12) × 10–4
TG1-pAM35-pTZArdB (1.6 ± 0.23) × 10–1 TG1-pACYCEcoKI-pTZArdB (4.7 ± 0.52) × 10–2
TG1-pAM35-pArdBRam (без индукции) (2.9 ± 0.15) × 10–1 TG1-pACYCEcoKI-pArdBRam + индукция (3.9 ± 0.89) × 10–1
TG1-pAM35-ArdBRam + индукция (5.7 ± 0.95) × 10–1    

[i] a Эффективность посева фага λ.0 определяли как отношение числа бляшек, образованных трансформированными клетками E. coli, к числу бляшек, образованных штаммом TG1; чем меньше это соотношение, тем выше эндонуклеазная активность исследуемого фермента. Представлены средние результаты трех независимых экспериментов.

b Положительный контроль.

Как видно из данных, представленных в табл. 2, рестрикционная активность эндонуклеазы EcoАI, экспрессируемой трансформантом E. coli TG1-pAM35, значительно ниже, чем EcoKI в клетках E. coli TG1-pACYCEcoKI: снижение EOP на 1.5 и на 4 порядка соответственно. По всей видимости, это обусловлено разным числом сайтов узнавания этих рестриктаз в геноме фага λ (5 для EcoКI и 1 для EcoАI).

По результатам экспериментов можно заключить, что белок ArdB активен в отношении EcoАI – типового представителя семейства IВ системы RM-I. Даже экспрессия ArdB с относительно слабого лактозного промотора вызывала частичное восстановление уровня ЕОР. При экспрессии ArdB с более сильного промотора PrhaB выявлено повышение антирестрикционной активности ArdB, связанное с увеличением количества белка в клетке (рис. 1).

Рис. 1.

Электрофоретический анализ лизатов клеток E. coli TG1. Дорожки: 1 – маркер молекулярной массы белков PageRuler Unstained Protein Ladder (“Thermo Fisher Scientific”, США); 2 – E. coli TG1; 3 – E. coli TG1-pAM35-pArdBRam без индукции; 4 – E. coli TG1-pAM35-pArdBRam + рамноза.

Полученные результаты можно рассматривать как важное подтверждение упомянутых выше результатов D. Serfiotis-Mitsa и др. [10] о способности ArdB ингибировать активность EcoAI.

Сравнение эффективности ингибирования активности двух различных RM-систем белком ArdB позволяет выдвинуть гипотезу о неспецифичности его работы, то есть способности ингибировать RM-I независимо от последовательности сайта узнавания.

На основании данных, представленных в табл. 2, можно говорить о проявлении антирестриктазной активности ArdB как против эндонуклеаз семейств IA, так и IB (EcoKI и EcoAI соответственно). Отметим, что для этих экспериментов EcoKI и EcoAI экспрессировали, используя изогенные штаммы E. coli TG1. Эффективность ингибирования EcoKI и EcoAI с помощью ArdB практически одинакова и для обеих эндонуклеаз составляет более 98% (табл. 2). Эндонуклеазы EcoAI и EcoKI узнают разные последовательности ДНК [15, 16], поэтому одинаковую эффективность ингибирования их активности можно рассматривать как подтверждение высказанной гипотезы о неспецифичности ArdB относительно нуклеотидной последовательности ДНК, узнаваемой S-субъединицей комплекса RM-I. Скорее всего, ArdB распознает пространственную структуру ДНК в сайте расщепления рестриктазой или вблизи него.

Ранее в работах Г.Б. Завильгельского и И.В. Манухова [7, 8] был предположен механизм работы ArdB, объясняющий природу его антирестрикционной активности. В частности предполагалось, что ArdB ингибирует транслокацию ДНК R-субъединицами комплекса RM-I и, как следствие, независимо от работы S-субъединицы комплекса, а значит и от последовательности узнаваемого ею сайта. Теперь нами подтверждено одно из основных следствий этой гипотезы ‒ универсальность механизма действия ArdB. Таким образом, вся накопленная к настоящему времени информация по особенностям структуры, каталитической активности и другим важным свойствам ArdB вполне согласуется с гипотезой, хотя ее доказательность нуждается в дальнейшей проверке.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (22-74-00027). Теоретическая оценка применимости результатов работы в биотехнологии, обзор литературы и редактирование текста публикации были выполнены Мануховым Ильей Владимировичем при финансировании Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (проект 1022060200069-0-1.6.2;1.6.4;1.6.5;1.6.10;1.6.19 по теме “Разработка технологии рационального и высокопродуктивного использования агро- и биоресурсов, их эффективной переработки и получения безопасных и качественных источников пищевых и не пищевых продуктов”).

В работе не использовались животные в качестве объектов исследования.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Список литературы

  1. Samson J.E., Magadán A.H., Moineau S., Sabri M. (2013) Revenge of the phages: defeating bacterial defences. Nat. Rev. Microbiol. 11, 675‒687.

  2. Tock M.R., Dryden D.T. (2005) The biology of restriction and anti-restriction. Curr. Opin. Microbiol. 8, 466–472.

  3. Liang W., Xie Y., Lu Y, Xiong W., Tang Y., Li G., Jiang X., Lu Y. (2017) Anti-restriction protein, KlcAHS, promotes dissemination of carbapenem resistance. Front. Cell. Infect. Microbiol. 7, 150.

  4. McMahon S.A., Roberts G.A., Johnson K.A., Cooper L.P., Liu H., White J.H., Carter L.G., Sanghvi B., Oke M., Walkinshaw M.D., Blakely G.W., Naismith J.H., Dryden D.T. (2009) Extensive DNA mimicry by the ArdA anti-restriction protein and its role in the spread of antibiotic resistance. Nucleic Acids Res. 37, 4887–4897.

  5. Roberts G.A., Stephanou A.S., Kanwar N., Dawson A., Cooper L.P., Chen K., Nutley M., Cooper A., Blakely G.W., Dryden D.T. (2012) Exploring the DNA mimicry of the Ocr protein of phage T7. Nucleic Acids Res. 40, 8129–8143.

  6. Goryanin I.I., Kudryavtseva A.A., Balabanov V.P., Biryukova V.S., Manukhov I.V., Zavilgelsky G.B. (2018) Antirestriction activities of KlcA (RP4) and ArdB (R64) proteins. FEMS Microbiol. Lett. 365, fny227.

  7. Кудрявцева А.А., Охрименко И.С., Дидина В.С., Завильгельский Г.Б., Манухов И.В. (2020) Антирестрикционный белок ArdB (R64) взаимодействует с ДНК. Биохимия. 85, 369–377.

  8. Balabanov V.P., Kudryavtseva A.A., Melkina O.E., Pustovoit K.S., Khrulnova S.A., Zavilgelsky G.B. (2019) ArdB protective activity for unmodified λ phage against EcoKI restriction decreases in UV-treated Escherichia coli. Curr. Microbiol. 76, 1374–1378.

  9. Belogurov A.A., Delver E.P., Rodzevich O.V. (1993) Plasmid pKM101 encodes two nonhomologous antirestriction proteins (ArdA and ArdB) whose expression is controlled by homologous regulatory sequences. J. Bacteriol. 175, 4843–4850.

  10. Serfiotis-Mitsa D., Herbert A.P., Roberts G.A., Soares D.C., White J.H., Blakely G.W., Uhrín D., Dryden D.T. (2010) The structure of the KlcA and ArdB proteins reveals a novel fold and antirestriction activity against type I DNA restriction systems in vivo but not in vitro. Nucleic Acids Res. 38, 1723–1737.

  11. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. (1984) Молекулярное клонирование. Москва: Мир.

  12. Кудрявцева А.А., Осетрова М.С., Ливинюк В.Я., Манухов И.В., Завильгельский Г.Б. (2017) С-концевой остаток аспарагиновой кислоты (D141) необходим для антирестрикционной активности белка ArdB (R64). Молекуляр. биология. 51(5), 831–835.

  13. Завильгельский Г.Б., Мершавка В.Ю., Юсифов Т.Н., Белогуров А.А. (1984) Ослабление рестрикции ЕсоК ДНК бактериофага в присутствии плазмиды pKM101 ard+. I. Общая характеристика и генетическая локализация. Молекуляр. биология. 18(6), 1590–1596.

  14. Манухов И.В., Коноплева М.Н., Баженов С.В. (2016) Практикум по генетической инженерии. Черноголовка: Редакционно-издательский отдел ИПХФ РАН.

  15. Kan N.C., Lautenberger J.A., Edgell M.H., Hutchison C.A. (1979) The nucleotide sequence recognized by the Escherichia coli K12 restriction and modification enzymes. J. Mol. Biol. 130(2), 191–209. https://doi.org/10.1016/0022-2836(79)90426-1

  16. Kröger M., Hobom G. (1984) The nucleotide sequence recognized by the Escherichia coli A restriction and modification enzyme. Nucleic Acids Res. 12(2), 887–899. https://doi.org/10.1093/nar/12.2.887

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Молекулярная биология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал