Молекулярная биология, 2023, T. 57, № 1, стр. 56-70

ВВЕДЕНИЕ

Семейство LDH2/MDH2-оксидоредуктаз (LDH/MDH-оксидоредуктазы типа 2) включает ферменты, которые участвуют в разнообразных метаболических процессах и на основании филогенетического анализа подразделяются на восемь групп [1‒4]. Охарактеризованы функции ферментов клады ComC (L-сульфолактатдегидрогеназа, SLDH), клады LDH (лактатдегидрогеназа типа 2), клады AllD (уреидогликолатдегидрогеназа), клады YiaK (2,3-дикето-L-гулонатредуктаза) и клады DpkA (Δ1-пиперидин-2-карбоксилат/Δ1-пирролин-2-карбоксилатредуктаза), в то время как функция белков трех других клад: термофильных архей, YbiC и YlbC, остается неизвестной. Поскольку в филогенетический анализ было включено только 20 аминокислотных последовательностей [4], то, возможно, в дальнейшем такая классификация будет пересмотрена.

Функция LDH2/MDH2-оксидоредуктаз на данный момент охарактеризована только у архей и бактерий [3, 4]. Недавно у эукариот выявили гены, которые кодируют белки, гомологичные SLDH архей [5]. У архей и бактерий этот фермент кодируется геном comC [6‒8]. ComC-подобные гены найдены в геномах грибов, растений и животных. Однако в царстве растений гомологи comC обнаружены только у водорослей, тогда как у мхов и семенных растений они отсутствуют. Гомологи гена выявлены у преобладающего числа эволюционных групп животных, за исключением четвероногих (земноводных, рептилий, птиц и млекопитающих) [5]. ComC-подобные гены эукариот условно названы AqE (aquatic enzyme, водный фермент) в связи с его встречаемостью преимущественно в тех таксонах, образ жизни или стадии онтогенеза которых ассоциированы с водной (жидкой) средой. Подробный анализ встречаемости и структуры гена AqE у костистых рыб показал, что в большинстве исследованных отрядов сохраняется идентичная экзон-интронная организация (11 экзонов) и характерные консервативные мотивы этого гена [9]. Однако у карпообразных (Cypriniformes) этот ген утерян полностью, а у представителей лососеобразных (Salmoniformes) претерпел значительные делеции и, по всей видимости, нефункционален [9]. Ранее предполагалось, что SLDH-подобный белок, кодируемый геном AqE, участвует в анаэробном энергообмене и его утрата отдельными таксонами как животных, так и растений связана с сопутствующей выходу на сушу перестройкой метаболизма, обусловленной насыщенностью среды кислородом и отсутствием естественной гипоксии, характерной для гидробионтов [5]. Утрата гена AqE у карпообразных и лососеобразных могла произойти из-за индивидуальной эволюции этих таксонов и соответствующей реструктуризации метаболических путей. Известно, что у предков Cypriniformes и Salmoniformes происходили независимые полногеномные дупликации (так называемая четвертая полногеномная дупликация позвоночных) [10, 11]. Избыток оксидоредуктаз, возникший в результате дупликации генома, мог стать причиной потери значимости гена AqE для метоболизма, так как появился большой “ресурс” для негомологичной замены или появления новых ферментов и новых метаболических путей [9]. Анализ дифференциальной экспрессии AqE желтого горбыля (Larimichthys crocea) показал, что уровень активности этого гена высок в печени, жабрах и коже, тогда как в других тканях он низкий. В связи с этим предположили, что функция SLDH-подобного белка рыб может быть связана с выведением продуктов метаболизма [12].

Среди таксонов, представители которых сохранили ген AqE, большой интерес представляют насекомые, поскольку они являются сухопутными организмами. Насекомые ‒ очень разнообразный класс организмов, обитающих в различных условиях, в том числе в средах, где могут сталкиваться с дефицитом кислорода. Так, например, представители отрядов Trichoptera, Megaloptera, Odonata проходят личиночную стадию развития в водной среде и дышат растворенным в воде кислородом. Также представители некоторых отрядов насекомых развиваются в почве ‒ Auchenorrhyncha, Isoptera, Diplura, Protura, в древесине ‒ Zoraptera, Hymenoptera (например Orussus abietinus) или Polyphaga (например Dendroctonus ponderosae, Anoplophora glabripennis), в разлагающихся органических субстратах ‒ некоторые представители отряда Diptera. Паразитические виды, такие как Hymenoptera, Strepsiptera, живут в тканях животных, используя для дыхания кислород, растворенный в гемолимфе. Есть среди насекомых и экстремофилы, обитающие в холодных условиях, около ледников ‒ Grylloblattodea.

Нами изучено разнообразие, структура и эволюция гена AqE в классе насекомых с таксономическим разрешением до отряда. Присутствие гена AqE в геноме насекомых, в частности комара Aedes albopictus (отряд Diptera), было отмечено ранее [5], однако детально этот ген изучен впервые.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Поиск генов AqE у насекомых. Поиск гомологов гена AqE у насекомых проводили с использованием алгоритма локального выравнивания tBLASTn [13]. В качестве референсной последовательности выбрали аминокислотную последовательность, кодируемую AqE комара A. albopictus. Эта последовательность была идентифицирована при первичном исследовании генов AqE [5]. Проанализированы полногеномные ДНК представителей 17 отрядов. Еще 10 отрядов исследованы с помощью поиска гомологий в базе данных транскриптомов. Использованы геномные и транскриптомные последовательности, размещенные на серверах NCBI. Уникальные идентификаторы полногеномных и транскриптомных сборок представителей класса насекомых, а также таксонов Diplura и Protura приведены в табл. 1.

Границы экзонов у обнаруженных генов AqE уточняли визуально по наибольшему сходству последовательностей между референсной и исследуемой последовательностями и наличию 5'- и 3'-границы сайта сплайсинга. Кодирующие последовательности AqE, полученные в результате анализа, использовали для поиска транскрибируемых последовательностей РНК. Копиям AqE в случае выявления более одной в геноме, присваивали порядковый номер в соответствии с очередностью обнаружения.

Филогенетический анализ. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей выполняли с помощью MUSCLE [14], а полученные данные использовали для построения филогенетического дерева с использованием программного обеспечения MEGA X [15] и метода максимального правдоподобия (ML). Использовали следующие параметры: бутстреп, 100 повторов; модель замещения аминокислот Ле-Гаскуэль-2008; и гамма-распределение. Анализ включал 91 аминокислотную последовательность AqE подтипа Hexapoda.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Филогенетические взаимоотношения генов AqE насекомых

Чтобы установить взаимосвязь между генами AqE насекомых, проведен филогенетический анализ, основанный на методе максимального правдоподобия, в который была включена 91 аминокислотная последовательность, кодируемая этими генами. Полученное дерево не позволило выявить четкие эволюционные отношения между различными вариантами AqE, потому что статистическая значимость превалирующей доли визуально отличных клад не превышала 70% (рис. 1). Тем не менее, мы разделили дерево по топологии на восемь условных кластеров и установили некоторые закономерности.

Рис. 1.

Эволюционные взаимоотношения генов AqE насекомых. Филогенетический анализ выполнен в программе MEGA X c помощью метода максимального правдоподобия. Приведены только бутстреп-значения, превышающие 50%. Справа от дендрограммы указаны отряды, к которым принадлежат соответствующие организмы.

Так, например, в каждом из кластеров I–IV и VI–VIII сгруппированы гены организмов, не встречающиеся ни в одном из остальных шести кластеров. (кроме B. germanica). При этом одна группа (кластер V) отличается визуально более длинными эволюционными расстояниями и содержит гены AqE организмов, которые представлены также в других группах (кластеры I, II, VI, VII). Единственное исключение ‒ это ген Pseudomallada prasinus (отряд Neuroptera). Гены AqE этого насекомого не попадают ни в один из других семи кластеров (I–IV и VI–VIII). Однако у одного представителя отряда Neuroptera (Osmylus fulvicephalus) гены AqE представлены как в кластере V, так и в кластере VI.

Кластеры I–IV и VI–VIII включают AqE, которые эволюционируют медленнее и присутствуют практически у всех изученных организмов, а кластер V содержит гены, эволюционирующие с более высокой скоростью, и многие группы, по-видимому, утратили этот вариант AqE. Гомологи гена AqE из кластера V выявлены у 10 видов: T. castaneum (AqE1), B. germanica (AqE1, AqE2, AqE3, AqE4, AqE5, AqE8 и AqE9), O. fulvicephalus (AqE2), An. glabripennis (AqE2 и AqE3), Leptinotarsa decemlineata (AqE1 и AqE2), L. kohalensis (AqE2 и AqE3), P. prasinus (AqE1), Zorotypus caudelli (AqE2 и AqE3), Drosophila busckii (AqE4 и AqE5) и D. miranda (AqE2 и AqE3).

Другое важное явление ‒ молодые дупликации, которые хорошо видны на филогенетическом дереве (рис. 1) и выявлены у четырех видов: A. albopictus, An. gambiae, Ctenocephalides felis и D. busckii. Так, например, у комара A. albopictus выявлены три копии AqE. Сходство между аминокислотными последовательностями, кодируемыми этими генами, превышает 99%. Белковый продукт гена AqE2 отличается одной аминокислотной заменой от белков, кодируемых AqE1 и AqE3. Однако белки AqE1 и AqE3 содержат на N-конце дополнительный фрагмент длиной 124 и 80 а.о. соответственно. Еще один комар (An. gambiae) имеет две копии гена, идентичные примерно на 100%, при этом белковый продукт гена AqE1 также содержит дополнительный N-концевой фрагмент (139 а.о.). У блохи C. felis обнаружены три гомолога гена AqE. Идентичность белков, кодируемых этими генами, колеблется от 93 до 97%, при этом присутствуют также вставки и делеции (табл. 1). У мухи D. busckii белковые продукты трех из пяти выявленных копий гена сходны на 99.77‒100%.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Известно, что гены остаются стабильными, если не происходит каких-то существенных изменений во внешних условиях и стабилизирующий отбор “выбрасывает” любые мутации, изменяющие или нарушающие функцию белка. Ген AqE присутствует почти во всех таксонах водных хордовых [9]. Его протяженность, интрон-экзонная структура и консервативные домены в целом достаточно постоянны, а присутствие транскриптов свидетельствует о “работоспособности” гена. У представителей класса насекомых ситуация противоположная – наблюдается выраженная неоднородность в наличии/отсутствии гена в геноме, в числе копий гена, его размере и экзон-интронной структуре (табл. 1). Причем эта неоднородность проявляется вплоть до вида, что наталкивает на мысль, что у насекомых, оказавшихся в новых условиях обитания, ген AqE попал под действие движущего отбора и активно эволюционировал/эволюционирует вплоть до настоящего момента, так как относительно недавно дивергировавшие группы организмов имеют значительные различия.

Филогенетический анализ показал, что все разнообразие AqE у насекомых делится на восемь кластеров (рис. 1). При этом статистическая значимость обособления кластеров ниже 50%. Если рассматривать распределение отрядов по кластерам, то видна выраженная мозаичность, которая не позволяет предположить пути эволюции гена AqE у насекомых (рис. 2). Возможно, что активная мультипликация AqE началась еще при обособлении эволюционной группы Pterygota около 384–442 млн лет назад. Новые копии эволюционировали независимо, а в дальнейшем возникали как новые дупликации, так и потери уже существующих генов, в связи с чем и сформировалось мозаичное распределение без корреляции филогении AqE с филогенией видов. Множественные события дупликаций и потери гена, а также быстрой эволюции свидетельствуют о том, что AqE у насекомых утратил свою консервативность и значимость в метаболических процессах. Так, например, еще одна подробно изученная группа животных Actinopterygii (костистые рыбы) дивергировала от других позвоночных примерно в тот же период: 364–409 млн лет назад. Однако ген AqE у этих животных строго консервативен [9].

Рис. 2.

Присутствие разных филогенетических кластеров гена AqE среди подтипа Hexapoda. Филогенетические отношения между отрядами и данные о времени дивергенции взяты из базы данных TimeTree (https://timetree.org/). м.л.н. ‒ миллионы лет назад.

Дупликация ‒ один из основных источников изменений, способствующих быстрой эволюции генома [17, 18]. Судьба большинства дуплицированных генов – псевдогенизация и/или элиминация из генома [19, 20]. У насекомых встречаются случаи псевдогенизации – у L. kohalensis в гене AqE2 рамка считывания нарушена стоп-кодоном, ген AqE3 остался в виде фрагмента, кодирующего продукт длиной 48 а.о. У B. germanica AqE8 представляет собой фрагмент, кодирующий пептид длиной 150 а.о. Продукт гена AqE2 An. glabripennis состоит из 147 а.о. (при этом выявлены транскрипты). У Leptinotarsa decemlineata все три гена AqE неполноценны (также выявлены транскрипты). В большинстве же случаев ген остается визуально функциональным, имеет неповрежденную ОРС, а зачастую и транскрипты. Следовательно, в подавляющем числе случаев мы имеем дело с дупликацией, которая успешно закрепилась в геноме насекомых. Ведущий эволюционный биохимик Shelley Copley предполагает, что средний фермент может иметь до 10 разных функций [21]. Соответственно, при дупликации гена любая смежная активность может быть отправной точкой для эволюции нового фермента, функция которого сходна с оригинальной или довольно сильно от нее отличается.

Дуплицированные гены могут закрепиться в геноме в результате процессов: а) неофункционализации – приобретения возникшим паралогом новой функции; б) ухода от адаптивного конфликта, когда исходный ген выполняет в организме две функции или более, а после дупликации бифункционального гена происходит разделение функций между возникшими копиями; в) субфункционализации, при которой из-за накопления мутаций оба паралога становятся необходимыми для выполнения функции, которую ранее обеспечивал предковый ген; г) консервации или мутации типа CNV (вариации числа копий), при которой копии сохраняются в неизменном состоянии, но увеличение их количества дает организму возможность синтеза большего количества специфических РНК или белков [17, 22, 23].

Мы предполагаем, что дупликации закрепились в геноме насекомых как результат неофункционализации или ухода от адаптивного конфликта. Если бы у предка насекомых дупликация привела к субфункционализации, то в настоящий момент среди потомков не должно быть организмов с одной копией гена AqE, так как при субфункционализации оба паралога необходимы для выполнения исходной функции гена. Нами же обнаружены организмы, имеющие единственный функциональный ген AqE (табл. 1). Вариация числа копий предполагает простое увеличение копийности, мы же имеем дело с очень измененными копиями AqE.

На рис. 1 видно, что AqE кластера V имеют более длинные эволюционные расстояния, чем другие. Это может быть косвенным свидетельством того, что эта группа AqE могла приобрести новую функцию. Известно, что по мере того, как организмы приобретали большее количество специализированных типов клеток, дупликация генов способствовала образованию совершенно разных ферментов, приспособленных к этим клеткам, а также увеличивала регуляторную специфичность в отношении времени их экспрессии в развитии [24‒26]. Новые ферменты могут образовываться, поскольку избыточность копий позволяет одной последовательности свободно мутировать и приобретать новые каталитические функции. Таким образом, возможно, произошло формирование большого разнообразия дегидрогеназ [27].

В ходе эволюции конкретных видов насекомых возникало множество дупликаций, которые успешно закреплялись в геноме. Среди них, помимо случаев неофункционализации или ухода от адаптивного конфликта, может быть и субфункционализация, например, у B. germanica все 9 дупликаций гена накопили достаточно мутаций и имеют давнее происхождение, судя по их расхождению на филогенетическом древе. Не исключена и возможность консервации, так у D. busckii идентичность копий 1, 2 и 3 (всего их пять) гена составляет 99.77–100%. Однако сказать наверняка вследствие чего закрепилась дупликация в каждом конкретном случае мы не можем из-за недостаточности данных.

Десять отрядов насекомых сохранили единственную копию гена, потеряв дуплицированную. Но есть случаи и полной потери гена – четыре отряда вообще не имеют гена AqE (табл. 1). Существуют различные сценарии эволюционной инактивации и/или потери гена: медленное накопление мутационных изменений в гене и превращение его в псевдоген с дальнейшей постепенной деградацией (фрагментация), или же внезапная и полная потеря гена – делеция вследствие неравного кроссинговера при мейозе или перемещения мобильных генетических элементов. Мы не обнаружили никаких остатков гена в исследованных нами геномах в группах, потерявших ген AqE, поэтому более достоверным представляется, что делеция, а, возможно, также и псевдогенизация привела к такой сильной деградации, что ген не обнаруживается при поиске.

Потеря генов – широко распространенный в эволюции феномен. Показано, что потеря генов может быть адаптивной или нейтральной. Если ген становится избыточным, то его потеря оказывает нейтральное влияние на жизнедеятельность [28, 29]. С другой стороны, потеря гена может существенно повышать адаптивный потенциал вида. Мутации, приводящие к потере функциональности гена, происходят чаще, чем мутации, которые приводят к приобретению новой функции [30]. Следовательно, потери гена сильнее влияют на адаптивную эволюцию, особенно во время быстрой адаптации к резким изменениям окружающей среды [31].

Мы не можем делать выводы об адаптивном характере потери гена у насекомых из-за отсутствия данных, свидетельствующих в пользу такой возможности. Вероятнее всего, виды, потерявшие ген, приобрели иные пути метаболизма, вследствие чего AqE утратил свою значимость и элиминировался из генома, или же аналогичные гены взяли на себя его функцию. Известны примеры негомологичной замены генов. Так, например, ферменты SLDH, которые используют оксалоацетат в качестве субстрата с относительно высокой эффективностью [32], могут действовать в качестве аналога MDH, компенсирующего отсутствие специфической MDH у метаногенной археи [6].

Насекомые – это единственный класс животных, обитающий на суше и сохранивший ген AqE, кодирующий SLDH-подобный белок [5]. Не исключено, что у насекомых AqE включен в некие метаболические пути, которые оказались полезными в условиях их обитания. Личинки насекомых, а иногда и имаго, зачастую сталкиваются с недостатком кислорода, избытком сероводорода, метана и иных газов, образующихся при брожении и разложении органических веществ. В таких стрессовых условиях, возможно, необходимы новые метаболические пути, способные обеспечить существование организма в подобных агрессивных средах. Наиболее важная функция оксидоредуктаз связана с их эколого-биохимической ролью в развитии адаптивных реакций, выражающихся, как правило, в регуляции баланса аэробных и анаэробных процессов [33]. Показано, что оксидоредуктазы могут повышать устойчивость растений к холодовому и солевому стрессу [34–36].

Функция гена AqE пока не установлена, но, возможно, его продукт является резервным метаболитом, который включается в анаэробный обмен в экстремальных ситуациях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате изучения распространенности и разнообразия гена AqE установлено, что этот ген представлен не во всех отрядах/подотрядах насекомых, при том что у некоторых видов ген AqE имеет два и более гомолога. При этом даже в пределах одного отряда/подотряда наблюдается гетерогенность как в количестве гомологов, так и в потере генов. Предполагается, что мультипликация гена AqE насекомых имеет древнюю природу, однако возможны и молодые дупликации. Более того, установлена вариабельность как длины гена, так и числа экзонов в нем (от 1 до 10). Не исключено, что в связи с появлением паралогов ген приобрел новую функцию. Такое разнообразие в представленности и в структуре создает большие сложности с идентификацией паралогов и установлением эволюционных взаимосвязей. Возможно, при более детальном (на уровне семейств и родов) исследовании разнообразия AqE удастся получить более точные данные. Дополнить картину эволюции позволит также изучение этого гена у всех членистоногих или более древних таксонов.

Предполагается, что необычное поведение гена AqE, может быть связано как с потерей его значимости для метаболизма насекомых, так и с приобретением новых функций и/или с необходимостью адаптации к разнообразным условиям, в которых обитают представители этого класса.

Исследование проведено в рамках государственного задания ФГБУН ИМБИ “Функциональные, метаболические и токсикологические аспекты существования гидробионтов и их популяций в биотопах с различным физико-химическим режимом” (номер гос. регистрации 121041400077-1).

Настоящая статья не содержит исследований с использованием животных в качестве объектов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.