Молекулярная биология, 2023, T. 57, № 2, стр. 299-306

ВВЕДЕНИЕ

Серотонин (5-HT) действует как ключевой медиатор в мозге и гормон на периферии. В мозге позвоночных 5-HT синтезируется в 5-HT нейронах, тела которых расположены в стволовой части мозга [1], тогда как на периферии он синтезируется в энтерохромаффинных клетках кишечника, тучных клетках кожи и эпифизе. Нарушения 5-HT системы мозга связывают с риском различных психопатологий, тогда как транспортер и рецепторы 5-HT служат мишенями для клинически эффективных антидепрессантов, анксиолитиков и антипсихотиков [2–4].

В организме млекопитающих 5-HT синтезируется из незаменимой аминокислоты – L-триптофана. Ключевыми ферментами синтеза 5-HT являются триптофангидроксилазы 1 и 2 (ТПГ1 и ТПГ2), которые гидроксилируют L-триптофан до 5-гидрокситриптофана (5-HTP) [5, 6]. Основным геном считается Tph2, который экспрессируется в 5-HT нейронах, тогда как Tph1 экспрессируется исключительно в периферических клетках, таких как энтерохромаффинные клетки кишечника, тучные клетки и пинеалоциты эпифиза [5–9]. Однако транскрипты гена Tph1 найдены в мозге крысы [10], мыши [11, 12] и человека [13–15], причем концентрации транскриптов Tph1 и Tph2 были соизмеримыми. Стресс может усиливать экспрессию гена Tph1 в мозге мышей [12].

Вопрос об экспрессии гена Tph1 принципиально важен для понимания роли ТПГ2 и ТПГ1 в функционировании 5-HT системы мозга в норме и при патологиях, поэтому основная цель нашей работы состояла в определении соотношения этих ферментов в мозге в норме и при патологии. Изучена экспрессия мРНК генов Tph1 и Tph2 в структурах головного мозга, содержащих тела 5-HT нейронов (средний мозг), в которых экспрессируется ген Tph2, и окончания этих нейронов (кора, гиппокамп, стриатум и гипоталамус), в которых данный ген не экспрессируется, в норме и через 5 сут после активации иммунной системы мышей бактериальным липополисахаридом (ЛПС). Состояние иммунной системы оценивали по массе селезенки и тимуса, а 5-HT системы – по уровню 5-HT и его основного метаболита, 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-HIAA), а также по активности ТПГ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Животные и воздействия. Опыты проводили на мышах линии C57BL/6 (24 молодых самца в возрасте 4 недель с массой тела 16.7 ± 0.4 г). Выбор молодых животных обусловлен их повышенной чувствительностью к ЛПС и лабильностью 5-HT системы мозга.

Для снятия группового эффекта животных сразу после получения рассаживали поодиночно в вентилируемые клетки Optimice (“Animal Care Systems, Inc.”, США) и содержали в течение всего эксперимента при температуре 24°С, влажности 45–50% и стандартном для вивария световом режиме (14 ч свет, 10 ч темнота). Стерильный корм и воду животные получали без ограничения. Все мыши были разделены на три выровненные по весу группы: интактную (n = 8, масса 16.4 ± 0.5 г), контрольную (n = 8, масса 17.1 ± 0.7 г) – мышам этой группы в/б вводили физиологический раствор; и опытную (n = 8, масса 16.7 ± 0.8 г.) – мышам этой группы в/б вводили 2 мг/кг ЛПС (“Sigma-Aldrich”, Германия), растворенного в физиологическом растворе. Через 5 сут после введения физиологического раствора или ЛПС животных усыпляли углекислым газом, декапитировали, выделяли головной мозг, селезенку и тимус. Последние взвешивали с точностью до мг на весах Ohaus AX124 (“Ohaus Corp.”, США). Из головного мозга выделяли структуры, содержащие окончания (переднюю кору, гиппокамп, стриатум, гипоталамус) и тела (средний мозг) 5-HT нейронов, замораживали в жидком азоте и хранили при –80°С.

Биохимические протоколы. В работе использовали метод, позволяющий определять содержание 5-HT, активность ТПГ и уровень мРНК целевых генов в одних и тех же образцах ткани. Для сохранения активности ТПГ кору, стриатум и гипоталамус гомогенизировали в 250 мкл, гиппокамп в 300 мкл и средний мозг в 400 мкл холодного 50 мМ Трис-HCl, pH 7.6, содержащего 1 мМ дитиотреитола. Одну аликвоту (50 мкл) суспензии немедленно переносили в пробирку эппендорф (1.5 мл), содержащую 150 мкл 0.6 М HClO₄, для экстракции 5-HT и 5-HIAA. Другую аликвоту (100 мкл) суспензии немедленно переносили в пробирку эппендорф (1.5 мл), содержащую 500 мкл Trizol Reagent (“Ambion, Life Technologies”, США) для экстракции РНК. Остальной гомогенат центрифугировали в течение 15 мин при +4°С и 12700 об./мин, чистый супернатант переносили в пробирки, хранили при –80°С и использовали для определения активности ТПГ2. Процедура гомогенизации в буфере и аликвотирования одной пробы занимает меньше 1 мин и не вызывает деградации ни 5-HT, ни РНК.

Определение уровня 5-HT и 5-HIAA. Смесь суспензии (50 мкл) и 0.6 М HClO₄ (150 мкл) центрифугировали в течение 20 мин при 12700 об./мин (+4°С). Полученный супернатант разбавляли в 2 раза водой MilliQ и использовали для определения уровня 5-HT и 5-HIAA с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке Luna C18(2) (частицы 5 мкм, L × I.D = = 75 × 4.6 мм, “Phenomenex”, США) и электрохимического детектора (750 мВ, DECADE II™ Electrochemical Detector; “Antec”, Нидерланды). Осадок растворяли в 0.1 М NaOH для определения концентрации общего белка в пробе по Брэдфорду (“BioRad”, США) согласно протоколу производителя. Концентрации 5-НТ и 5-HIAA в пробе определяли по площади пика с помощью программы LabSolution LG/GC (“Shimadzu Corp.”, Япония) и нормировали по калибровочной кривой, полученной с использованием стандартов 1, 2 и 3 нг для 5-HT и 5-HIAA [16]. Содержание 5-HT и 5-HIAA выражали в нг/мг белка.

Определение активности ТПГ2. Аликвоту супернатанта (15 мкл) инкубировали в течение 15 мин при 37°С в присутствии 1 мМ дитиотреитола, 0.4 мМ субстрата, L-триптофана (“Sigma-Aldrich”), 0.3 мМ кофактора – 6-метилтетрагидроптерина (“Sigma-Aldrich”), 0.3 мМ ингибитора декарбоксилазы – 3-гидроксибензилгидразина (“Sigma-Aldrich”) и 5 ед. каталазы (“Sigma-Aldrich”), в конечном объеме 25 мкл. Реакцию останавливали, приливая 75 мкл 0.6 М HClO₄, центрифугировали в течение 20 мин при 12 700 об./мин (+4°С). Чистый супернатант разбавляли в 2 раза водой MilliQ и использовали для определения уровня синтезированного 5-HTP с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке Luna C18(2) (размер частиц 5 мкм, L × I.D = 75 × 4.6 мм, “Phenomenex”) и электрохимического детектора (750 мВ, DECADE II™ Electrochemical Detector; “Antec,” США) согласно [16]. Концентрации 5-HTP в пробе определяли по площади пика с помощью программы LabSolution LG/GC (“Shimadzu Corp.”) и нормировали по калибровочной кривой, полученной с использованием стандартов 50, 100 и 200 пмоль 5-HTP [16]. В контрольные пробирки добавляли те же реактивы, но не инкубировали, а немедленно приливали 75 мкл 0.6 М HClO₄. Аликвоту супернатанта (10 мкл) смешивали с 90 мкл 0.1 М NaOH и определяли белок по Брэдфорду (“BioRad”) согласно протоколу производителя. Активность ТПГ2 выражали в пмолях 5-HTP, синтезированных за 1 мин в пересчете на 1 мг белка (пмоль/мг/мин).

Выделение РНК и ОТ-ПЦР. РНК выделяли из аликвоты (100 мкл) гомогената с помощью Trizol Reagent (“Ambion, Life Technologies”, США) согласно протоколу производителя. Следы геномной ДНК удаляли, используя ДНКазу, свободную от РНКазы (“Promega”, США). Целостность РНК определяли с помощью электрофореза в 0.8%-ном агарозном геле. кДНК синтезировали с помощью набора R01-250 (“Биолабмикс”, Россия) согласно протоколу производителя. Концентрацию мРНК определяли методом количественной ОТ-ПЦР с помощью наборов R-402 (“Синтол”, Россия) и специфически подобранных праймеров (табл. 1). Использовали следующие условия: денатурация 94°С, 4 мин, (денатурация 94°С, 15 с; отжиг и элонгация при температуре отжига (табл. 1), 60 с; измерение флуоресценции – 80°С, 2 с) 40 циклов (“Синтол”, Россия). Праймеры подбирали таким образом, чтобы продукты (ампликоны) не включали интроны. Это условие необходимо для использования геномной ДНК мыши в качестве внешнего стандарта. Уровень экспрессии оценивали с использованием калибровочной кривой, построенной по известным концентрациям геномной ДНК мыши и нормировали на 100 транскриптов гена Polr2a в пробе, служащей внутренним стандартом [16–18]. Такой метод позволяет измерить реальное число копий кДНК целевых генов и гена домашнего хозяйства и нормировать экспрессию целевых генов на ген домашнего хозяйства [17].

Статистика. Результаты представляли как среднее ± ошибка среднего и анализировали с помощью однофакторного метода ANOVA. Сравнение post hoc проводили по Фишеру. Уровень значимости принят равным 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изменение массы селезенки и тимуса через 5 суток после введения мышам физиологического раствора или ЛПС

Нами выявлены значительные различия в массе селезенки (F(2,21) = 15.5, p < 0.001) и тимуса (F(2,21) = 36.9, p < 0.001) у мышей разных групп. В группе мышей, которым вводили ЛПС (2 мг/кг), отмечено резкое увеличение массы селезенки и снижение массы тимуса через 5 сут после инъекции по сравнению с животными, которым вводили физиологический раствор (селезенка, p <0.001; тимус, p < 0.001), или интактными мышами (селезенка, p = 0.001; тимус, p <0.001) (рис. 1). При этом введение физиологического раствора не влияло на массу селезенки и тимуса, которые оставались такими же, как у интактных животных (селезенка, p = 0.18; тимус, p = 0.84) (рис. 1).

Рис. 1.

Масса селезенки и тимуса у интактных мышей и через 5 дней после однократной в/б инъекции физиологического раствора или ЛПС в дозе 2 мг/кг. ***p < 0.001 по сравнению с интактными.

Изменения активности ТПГ2 в структурах мозга мышей через 5 суток после введения физиологического раствора или ЛПС

Как и ожидалось, активность ТПГ2 в коре, гиппокампе, стриатуме и гипоталамусе мышей была ниже, чем в среднем мозге. Не выявлено межгрупповых различий в активности фермента в коре (F(2,21) = 1.3, p = 0.29), гиппокампе (F(2,21) = 1.76, p = 0.2), стриатуме (F(2,21) = 1.57, p = 0.23) и среднем мозге (F(2,21) < 1). Однако введение физиологического раствора и ЛПС снижало активность ТПГ2 в гипоталамусе (F(2,21) = 8.88, p = 0.0016) (рис. 2).

Рис. 2.

Активность ТПГ (пмоль/мг/мин) в коре, гиппокампе, стриатуме, гипоталамусе и среднем мозге интактных мышей и через 5 дней после однократной в/б инъекции физиологического раствора или ЛПС (2 мг/кг). ***p < 0.001 по сравнению с интактными.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Нами впервые оценены отдаленные последствия (5 суток) однократного введения ЛПС на уровень 5-HT, 5-HIAA, активность ТПГ, экспрессию генов Tph1 и Tph2 в головном мозге мышей. Мы намеренно выбрали молодых животных, поскольку они более чувствительны к стрессу и инфекциям.

Однократное введение ЛПС (2 мг/кг) приводит к активации иммунной системы, которая сохраняется по крайней мере в течение 5 суток в виде увеличения массы селезенки и снижения массы тимуса по сравнению с интактными животными и животными, которым вводили физиологический раствор.

Нами обнаружено увеличение уровня 5-HIAA и 5-HT в среднем мозге, а также снижение уровня 5-HIAA в гипоталамусе через 5 суток после введения ЛПС по сравнению с интактными животными. Важно отметить, что введение физиологического раствора вызывало изменения в уровне 5-HT и 5-HIAA в этих структурах, сходные с вызванными ЛПС. Это свидетельствует о том, что наблюдаемые изменения в уровнях 5-HT и 5-HIAA вызваны, скорее всего, отдаленными последствиями стресса, сопряженного с в/б инъекцией, чем с активацией иммунной системы. Действительно, ранее мы показали увеличение уровня 5-HIAA в мозге мышей при эмоциональном стрессе [19].

Снижение уровня 5-HIAA в гипоталамусе мышей, которым вводили физиологический раствор и ЛПС, по-видимому, вызвано снижением активности ТПГ2 и сопряженным снижением синтеза медиатора. В то же время, увеличение уровня 5-HT и 5-HIAA в среднем мозге мышей, которым вводили физиологический раствор и ЛПС, вероятно, не связано с увеличением синтеза медиатора, поскольку мы не выявили изменений активности ТПГ в данной структуре у этих мышей.

Длительные изменения в 5-HT системе в ответ на введение физиологического раствора кажутся странными. Однако до нас никто не оценивал отдаленных последствий одной инъекции физиологического раствора на 5-HT систему мозга. Можно предположить, что молодые мыши очень чувствительны к стрессу, вызванному всего одной инъекцией физиологического раствора, и его последствия сохраняются длительное время. Однако это предположение нуждается в дальнейшей проверке.

Главной целью нашего исследования было сравнение уровней транскриптов генов Tph2 и Tph1 в различных структурах головного мозга. В качестве внешнего стандарта мы использовали заданные концентрации геномной ДНК, что позволяет построить калибровочную кривую зависимости порогового цикла от исходного количества матрицы и, следовательно, определить абсолютную концентрацию транскриптов в исследуемых пробах [17, 18]. Измерение абсолютных значений концентрации транскриптов позволило нам не только оценить влияние введения физиологического раствора и ЛПС на экспрессию генов Tph1 и Tph2 в каждой структуре мозга по отдельности, но и оценить соотношение транскриптов этих генов в разных структурах.

Как и следовало ожидать, наибольшей концентрация транскриптов гена Tph2 была в среднем мозге, где локализованы тела серотониновых нейронов и транскрибируется данный ген. Мы обнаружили также небольшие, но хорошо детектируемые концентрации транскриптов гена Tph2 и в структурах, не содержащих тела 5-HT нейронов (в коре, гиппокампе, стриатуме и гипоталамусе), где теоретически этот ген не должен транскрибироваться. Мы не знаем причин присутствия мРНК гена Tph2 в коре, гиппокампе, стриатуме и гипоталамусе, однако можно предположить два гипотетических механизма появления транскриптов гена Tph2 в этих структурах: аксональный транспорт мРНК данного гена из тел 5-HT нейронов и наличие небольшого числа клеток, способных экспрессировать ген Tph2. Этот вопрос требует дальнейшего исследования.

Важно отметить, что концентрация транскриптов Tph1 во всех исследованных структурах находится примерно на одинаковом и довольно низком, практически следовом, уровне по сравнению с концентрацией транскриптов гена Tph2. Этот контраст в экспрессии генов Tph1 и Tph2 проявляется в полной мере в среднем мозге, где концентрация транскриптов гена Tph2 в несколько сотен раз больше, чем гена Tph1. Этот результат хорошо согласуется с данными других авторов [8], которые не нашли мРНК гена Tph1 [7] и белка ТПГ1 в мозге грызунов. Данные RNA-Seq показали, что в ядрах шва среднего мозга мыши уровень экспрессии генов Tph2 и Tph1 составляет 1680 и 0.8 ТРМ (число транскриптов генов Tph2 и Tph1 на миллион транскриптов) соответственно [20]. Более того, наши результаты хорошо согласуются с данными, согласно которым нокаут гена Tph1 снижает уровень 5-HT в мозге мышей всего на несколько процентов, тогда как нокаут гена Tph2 драматически снижает уровень этого биогенного амина [9]. Можно предполагать, что в мозге мыши имеется небольшое число клеток, способных экспрессировать ТПГ1. В любом случае, вклад ТПГ1 в синтез 5-HT в мозге мышей значительно ниже, чем ТПГ2.

Поскольку уровень мРНК гена Tph1 возрастал в 1.8 раза через несколько часов после стресса, было высказано предположение о возможности повышения относительной роли ТПГ1 в мозге при патологиях [12]. В нашем исследовании мы моделировали патологическое состояние, вызванное введением ЛПС, и не выявили существенных изменений в экспрессии гена Tph1 в структурах мозга. Синтез белка ТПГ1 может происходить только в телах 5-HT нейронов. Поэтому о вкладе ТПГ1 и ТПГ2 в синтез 5-HT в 5-HT нейронах можно судить по относительной экспрессии генов Tph1 и Tph2 в среднем мозге, где локализованы тела 5-HT нейронов. Поскольку экспрессия гена Tph2 в этой структуре в несколько сотен раз превышает экспрессию Tph1, вклад ТПГ2 в синтез серотонина в 5-HT нейронах во много раз превышает вклад ТПГ1. Даже стресс, который может увеличить экспрессию гена Tph1 в 1.8 раза [12], не способен изменить доминирование ТПГ2 в синтезе 5-HT.

Тем не менее, соизмеримые концентрации мРНК генов Tph1 и Tph2 найдены в мозге грызунов [10–12] и человека [13–15]. Проанализируем подробно эти результаты. В работах, выполненных на грызунах [10–12], использовали метод 2^–∆∆Ct, который не позволяет определить абсолютную концентрацию транскриптов, а оценивает только степень изменения концентрации при воздействии по сравнению с животными контрольной группы, уровень транскриптов у которых принимается за 1 (или 100) [21]. Поэтому измеренная методом 2^–∆∆Ct экспрессия разных генов вне зависимости от абсолютной концентрации их транскриптов всегда будет 1 (или 100), что мы и наблюдаем в работах [10–12]. Иными словами, одинаковость экспрессии генов Tph1 и Tph2 в мозге грызунов в этих работах является иллюзорной и обусловлена особенностью метода. Авторы, изучающие экспрессию генов Tph1 и Tph2 в мозге человека [13–15], использовали модифицированный протокол, позволяющий оценить концентрацию мРНК целевого гена относительно гена домашнего хозяйства. В этих работах обнаружен высокий уровень мРНК гена Tph1 в мозге человека. Поскольку анализировали посмертные образцы, то нельзя исключить, что относительно высокая экспрессия гена Tph1 может быть обусловлена изменениями в мозге, вызванными агонией. Наконец, высокий уровень экспрессии гена Tph1 в мозге может быть видовой особенностью человека. Недавно мы показали, что одинаковый уровень экспрессии генов Tph1a, Tph1b и Tph2 в мозге является видовой особенностью рыб Nothobranhius furzeri [22] и Danio rerio [16].

Таким образом, нами получены три существенных результата. Во-первых, стресс (инъекция) оставляет продолжительный след (5 cуток) на уровне метаболизма 5-HT в мозге молодых мышей. Во-вторых, наибольший уровень мРНК гена Tph2 наблюдается в среднем мозге, где расположены тела 5-HT нейронов, тогда как в коре, гиппокампе, стриатуме и гипоталамусе, где расположены их аксоны и окончания, уровень мРНК данного гена в несколько раз ниже. В-третьих, в мозге мышей в норме и при воспалении выявлены лишь следовые количества мРНК Tph1. Это свидетельствует о том, что ТПГ1, по-видимому, не играет существенной роли в синтезе 5-HT в мозге мышей как в норме, так и при патологиях.

Мышей содержали и разводили в Российском национальном центре генетических ресурсов лабораторных животных, который поддерживается бюджетными проектами № FWNR-2022-0023 и RFMEFI62117X0015.

Выполнение данной работы поддержано Российским научным фондом (грант № 21-15-00035).

Содержание и экспериментальные процедуры проведены в соответствии с правилами Совета Европейского Парламента (Директива 2010/63/EU от 22 сентября 2010 г) и одобрены Комиссией по биоэтике ИЦиГ СО РАН.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.