Молекулярная биология, 2023, T. 57, № 5, стр. 827-832

ВВЕДЕНИЕ

Обмороки, или синкопе, представляют собой состояния, характеризующееся транзиторной потерей сознания; их испытывает каждый третий человек хотя бы раз в жизни. Этиология обмороков весьма гетерогенна и до конца не ясна. К наиболее часто встречающимся синкопальным состояниям относятся вазовагальные обмороки (ВВО). Для этого многофакторного заболевания выявлена генетическая предрасположенность. Хотя выявление генетической составляющей ВВО затруднено из-за ряда факторов, таких как высокая распространенность, трудности дифференциальной диагностики различных видов обмороков и наличие коморбидности, обнаружены полиморфные варианты генов, ассоциированные с этим заболеванием [1, 2]. Подавляющее большинство этих исследований проведено с применением подхода “ген-кандидат” на небольших выборках. Исключение составляют два исследования [3, 4]. В работе K. Hadji-Turdeghal и соавт. [3] с помощью полногеномного поиска ассоциаций (Genome-Wide Association Studies, GWAS) на обширной выборке пациентов из ресурса Британского биобанка (The UK Biobank resource), страдающих, согласно Международной классификации заболеваний, обмороками или коллапсом (код 780.2 по МКБ-9 и код R55 по МКБ-10), была показана значимая на полногеномном уровне (P < 5 × 10^–8) ассоциация этих состояний с однонуклеотидными полиморфизмами (SNP) в области 2q32.1. Самой значимой оказалась ассоциация с rs12465214 (P  =  5.8  ×  10^–15), что позже подтвердили в мета-анализе [4]. K. Hadji-Turdeghal и соавт. [3] предположили, что ассоциация rs12465214 с ВВО определяется непосредственной близостью этого SNP к гену ZNF804A. Кодируемый этим геном транскрипционный фактор C2H2-типа, содержащий цинковый палец 804А (ZNF804A), может играть центральную роль в сети белок-белковых взаимодействий, участвуя в различных регуляторных и сигнальных путях, вовлеченных в процессы развития обмороков и коллапса. Однако прямых данных, свидетельствующих о роли гена ZNF804 в патогенезе обмороков и коллапса, нет.

Представляет несомненный интерес провести анализ ассоциации исследованных в работе [3] SNP в области 2q32.1 в подгруппах индивидов, страдающих различными типами синкопе. Мы провели анализ ассоциации rs12465214 с риском возникновения ВВО – самой распространенной формой обмороков – на однородной выборке таких больных и включили в анализ еще два SNP: rs12621296 и rs17582219, ‒ которые расположены в области 2q32.1 рядом с rs12465214. Эти SNP также были исследованы K. Hadji-Turdeghal и соавт. [3] на объединенной группе пациентов с обмороками и коллапсом. Исходя из предположения авторов о роли гена ZNF804 в патогенезе этой группы заболеваний, мы добавили в панель также SNP rs1344706, локализованный в интроне 2 гена ZNF804A. Ассоциацию этих SNP с ВВО анализировали по отдельности и в составе биаллельных сочетаний друг с другом.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объект исследования. Исследование генетической предрасположенности к ВВО проводили методом “случай‒контроль”. В исследование были включены пациенты Института клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ “НМИЦК им. акад. Е.И. Чазова” Минздрава России: 175 неродственных больных ВВО (средний возраст 34.5 ± ± 15.7 лет), из них 63 мужчины (средний возраст 34.5 ± 15.5 лет) и 117 женщин (средний возраст 36 ± 15.9 лет). Диагноз ВВО ставили на основе комплексного исследования, включающего анализ клинических данных и результаты инструментального обследования. Во всех случаях были исключены иные (кардиальные, неврологические и метаболические) причины приступов потери сознания.

Контрольная группа включала 200 индивидов (средний возраст 36.7 ± 13.7 лет) без обмороков в анамнезе, из них 108 мужчин (средний возраст 36.1 ± 12.9 лет) и 92 женщины (средний возраст 37.4 ± 14.6 лет). Эту группу составили 72 человека, у которых при проведении обследования не было выявлено каких-либо заболеваний, и 128 пациентов, проходивших стационарное обследование и лечение либо в связи с различными нарушениями ритма сердца (редкие пароксизмы атриовентрикулярной узловой реципрокной тахикардии, трепетания или фибрилляции предсердий), либо по поводу транзиторной артериальной гипертензии. При их обследовании ни в одном случае не было обнаружено признаков органического поражения миокарда, а также других соматических или неврологических заболеваний. От всех участников исследования было получено информированное согласие.

Генотипирование. Выделение геномной ДНК из периферической крови проводили с использованием коммерческого набора QIAamp DNA Blood Mini Kit (“QIAGEN”, Германия). Геномное типирование полиморфных участков rs12465214, rs12621296, rs17582219 и rs1344706 в области 2q32.1 проводили методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени с применением соответствующих коммерческих наборов TaqMan® SNP Genotyping Assay (“Applied Biosystems”, США) по инструкциям производителя на приборе StepOnePlus™. Для подтверждения правильности анализа проводили повторное генотипирование случайно выбранных проб в количестве 10% от исходной выборки.

Статистический анализ. Оценку отклонения наблюдаемых частот генотипов от равновесия Харди‒Вайнберга по критерию χ² и анализ неравновесия по сцеплению (LD) проводили с помощью алгоритма максимизации математического ожидания (expectation maximization, EM) с использованием программного обеспечения (ПО) Haploview 4.2 (http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview/index.php). Значению D' = 1 и LOD ≥ 2 соответствует сильное сцепление между локусами, D' < 1 и LOD > 2 – значительное сцепление, D' < 1 и LOD < 2 – слабое сцепление (где D' ‒ стандартизованная мера неравновесия по сцеплению, LOD ‒ логарифм отношения шансов за и против наличия сцепления). Ассоциацию носительства выбранных SNP и их биаллельных сочетаний с ВВО оценивали с помощью ПО APSampler (http://apsampler.sourceforge.net/) [5]. APSampler выявляет ассоциации, используя метод Монте-Карло марковскими цепями и байесовскую непараметрическую статистику, а затем для оценки значимости найденных ассоциаций использует значения p_f, определяемые согласно точному критерию Фишера, и значения отношения шансов (OШ) и его 95%-го доверительного интервала (95% ДИ). Сочетание относили к позитивному или негативному фактору генетического риска, если оба входящих в его состав аллеля/генотипа характеризуются меньшей значимостью ассоциации, чем само сочетание. Отдельные SNP и их сочетания считали значимо ассоциированными с ВВО, если различия сравниваемых частот характеризовались значением p_f < 0.05, при условии, что 95% ДИ для ОШ не пересекает 1.

Природу взаимодействия между компонентами сочетаний оценивали с помощью точного трехфакторного теста, подобного критерию Фишера (the exact three-way Fisher-like interaction numeric test, FLINT), и фактора синергии (synergy factor, SF) [6], входящих в состав инструментов APSampler. Взаимодействие считали эпистатическим, если величина p_FLINT была менее 0.05, а значение 95% ДИ для SF не пересекало 1.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

У 175 неродственных больных ВВО и 200 индивидов контрольной группы проведено генотипирование следующих SNP: rs17582219, rs12621296, rs12465214 и rs1344706, ‒ расположенных на хромосоме 2 в области 2q32.1.

Проведенный с использованием ПО Haploview 4.2 анализ не выявил отклонений от равновесия Харди–Вайнберга (p > 0.01) для всех исследуемых SNP ни у пациентов с ВВО, ни в контрольной группе.

Анализ возможного сцепления полиморфных участков, которые расположены в области 2q32.1 (табл. 1), обнаружил значительное сцепление (D' < 1, LOD > 2) между участками rs17582219, rs12621296 и rs12465214. Для участка rs1344706 выявлено очень слабое сцепление с rs12465214 (D' < 1, LOD < 2) и не наблюдалось сцепления с rs17582219 и rs12621296.

Мы сравнили частоты носительства аллелей и генотипов полиморфных участков rs17582219, rs12621296, rs12465214 и rs1344706 в области 2q32.1 у неродственных больных ВВО и индивидов контрольной группы как по отдельности, так и в составе биаллельных сочетаний друг с другом для оценки их возможного кумулятивного эффекта (табл. 2). Ассоциация с предрасположенностью к ВВО наблюдалась по отдельности для единственного SNP ‒ rs12621296: носительство генотипа G/G оказалось фактором риска (ОШ = 1.80). С помощью мультилокусного анализа обнаружено четыре биаллельных сочетания, ассоциация каждого из которых с ВВО характеризуется бóльшим уровнем значимости, чем любого входящего в это сочетание аллеля/генотипа; причем каждое из этих сочетаний включает по меньшей мере один SNP, не ассоциированный с ВВО сам по себе. Три из выявленных сочетаний: rs12621296*A + + rs17582219*A, rs12621296*G/G + rs12465214*A и rs12621296*G/G + rs1344706*A ‒ содержат SNP rs12621296, сам по себе значимо ассоциированный с ВВО, и по одному из трех остальных SNP. Эти биаллельные сочетания характеризуются значениями р_f, равными 0.00017, 0.0011 и 0.0011 соответственно, то есть имеют ассоциацию с ВВО с бóльшим уровнем значимости, чем rs12621296 сам по себе (p_f = 0.0078). В зависимости от того, какой вариант rs12621296 входит в состав сочетания, эффект может быть протективным (для rs12621296*A + rs17582219*A, ОШ = 0.45) или предрасполагающим (для rs12621296*G/G + + rs12465214*A, ОШ = 2.22, и rs12621296*G/G + + rs1344706*A, ОШ = 2.24). Оба компонента четвертого обнаруженного сочетания, rs17582219*A + + rs1344706*C (p_f = 0.025, ОШ = 0.64), по отдельности были незначимыми.

В табл. 2 представлены также результаты оценки природы кумулятивного эффекта между генетическими вариантами в составе ассоциированных с ВВО биаллельных сочетаний. Выявлено нелинейное (эпистатическое) взаимодействие между компонентами в сочетании rs12621296*A + + rs17582219*A (SF = 0.039, 95% ДИ (0.00182‒0.841), p_FLINT = 0.016), приводящее к усилению протективного эффекта. Для других ассоциированных с ВВО сочетаний взаимодействие между аллелями, скорее всего, носит аддитивный характер, то есть определяется суммой их независимых вкладов.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Аccоциация SNP rs17582219, rs12621296 и rs12465214 с обмороками или коллапсом (группой заболеваний с кодом R55 по МКБ-10) была первоначально показана на обширной выборке пациентов из ресурса Британского биобанка [3]. Эти результаты подтверждены нами на значительно меньшей, но однородной выборке пациентов, страдающих ВВО – самой распространенной формой обмороков. Контрольную группу в двух сопоставляемых работах формировали по принципу отсутствия у них исследуемого заболевания: у K. Hadji-Turdeghal и соавт. [3] в нее были включены пациенты Британского биобанка без диагноза “обмороки или коллапс”, у нас ‒ индивиды без ВВО. Однако мы сочли нужным повысить однородность контрольной группы и включили в нее индивидов не только без ВВО, но и без органического поражения миокарда и других соматических или неврологических заболеваний в анамнезе.

rs12621296 – единственный из исследованных нами SNP, для которого выявлена ассоциация с ВВО по отдельности. С помощью мультилокусного анализа, повышающего статистическую мощность исследования [7], нами выявлена связь с ВВО носительства аллелей rs17582219 и rs12465214 в составе биаллельных сочетаний с rs12621296. Кроме того, мы обнаружили биаллельные сочетания rs12621296*G/G + rs1344706*A и rs17582219*A + rs1344706*C, второй SNP в составе которых локализован в интроне-2 гена ZNF804A и не входил в панель SNP, исследованных авторами работы [3]. Таким образом, хотя мы и подтвердили ассоциацию SNP rs17582219, rs12621296 и rs12465214, находящихся на хромосоме 2 в значительном сцеплении между собой (см. табл. 1), с развитием обмороков, лидирующим SNP среди них в выборке пациентов, страдающих ВВО, оказался rs12621296. Для сравнения, в упоминаемых выше работах [3, 4] у пациентов с обмороками и коллапсом наиболее значимой была ассоциация с rs12465214. Показательно, что два сочетания: rs12621296*G/G + rs12465214*A и rs12621296*G/G + rs1344706*A ‒ характеризуются практически одинаковыми значениями p_f и ОШ (см. табл. 2), при этом rs1344706 непосредственно локализован в гене ZNF804A.

На рис. 1 представлено схематичное изображение области 2q32.1 хромосомы 2 человека и известных транскриптов в этой области; указана локализация исследованных SNP, которая совмещена с полученными нами данными по ассоциации с ВВО носительства аллелей/генотипов rs12621296 (по отдельности), а также аллелей rs17582219, rs12465214 и rs1344706 (входящих в состав биаллельных сочетаний с rs12621296).

Рис. 1.

Схематическое изображение области 2q32.1 хромосомы 2 человека, совмещенное с данными по ассоциации с ВВО аллелей/генотипов rs12621296 и аллелей других SNP, входящих в состав биаллельных сочетаний с rs12621296. Изображение области 2q32.1 создано на основе схемы, полученной с веб-сайта NCBI Sequence Viewer для Genomic Sequence: NC_000002.12 Chromosome 2 Reference GRCh38.p14 Primary Assembly (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/sviewer/?id=NC_000002). Локализация rs17582219 показана вертикальной зеленой линией, rs12621296 – красной, rs12465214 – голубой и rs1344706 – бирюзовой. Для ассоциированных с ВВО генетических вариантов (голубые столбцы) представлены значения ‒lgp_f (левая шкала), а также значения ОШ и 95% ДИ (правая шкала). Красные точки соответствуют значениям ОШ для предрасполагающих к ВВО генетических вариантов, зеленые – для протективных; вертикальные отрезки – диапазон ДИ. Эпистатическое сочетание указано звездочкой (*).

Как видно из рис. 1, полиморфизм rs12621296 находится внутри гена некодирующей РНК LOC102724340 и расположен примерно на 30 т.п.н. выше старта транскрипции гена некодирующей РНК LOC105373777, возможно, в участке, регулирующем его экспрессию. Два других полиморфизма, ассоциированных с ВВО в сочетании с rs12621296, а именно rs12465214 и rs17582219, та-кже колокализованы с LOC102724340 и LOC105373777: rs12465214 (как и rs12621296) лежит внутри LOC102724340, а rs17582219 примерно на 80 т.п.н. выше старта транскрипции LOC102724340 и примерно на 30 т.п.н. ниже 3'-конца LOC105373777 (лежащего на цепи, обратной референсной). Расположенный в LOC105373777 rs7602025 ассоциирован с систолическим артериальным давлением [8], а расположенный в LOC102724340 rs41434646 – с показателем максимальной вентиляции легких [9]. Кроме того, rs12465214 локализован в гене микроРНК MIR548AE; множество вариантов этого гена ассоциировано с самыми разными фенотипическими признаками (GWAS Catalog для гена MIR548AE1: https://www.ebi.ac.uk/gwas/genes/MIR548AE1). В целом, полученные нами результаты в большей степени соответствуют представлению, что установленные ассоциации определяются колокализацией этих SNP c генами некодирующих РНК, чем с геном ZNF804A, в отличие от более раннего предположения авторов работы [3]. Действительно, ген ZNF804A расположен намного дальше от рассматриваемых SNP (на расстоянии 260 т.п.н. до ближайшего из них – rs12465214), чем гены некодирующих РНК. Только один из исследованных нами SNP ‒ rs1344706 ‒ лежит внутри белоккодирующего гена ZNF804A, однако более значимой ассоциации с ВВО в сравнении с другими SNP локуса для rs1344706 не выявлено.

Обнаруженное нами эпистатическое взаимодействие вариантов локусов rs17582219 и rs12621296 может быть связано с тем, что один из них (rs17582219), находясь вне известных транскриптов, влияет на регуляцию экспрессии близлежащих генов (LOC105373777 и LOC102724340) по энхансерному механизму. Если учесть, что SNP rs12621296 локализован в гене LOC102724340, то можно предположить, что энхансерное действие rs17582219 на этот ген проявляется в форме эпистаза.

В целом, проведенное нами исследование свидетельствует о том, что синкопальные состояния различных типов имеют отнюдь не идентичную генетическую составляющую. Следовательно, ассоциативные исследования, ценность которых для установления природы заболеваний и поиска их маркеров трудно переоценить, необходимо проводить на однородных выборках пациентов с использованием адекватных контрольных групп.

Исследование выполнено в рамках Государственного задания ФГБУ ^“Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии им. академика Е.И. Чазова” Минздрава России (№ 121031300196-1).

От всех индивидов, принимавших участие в исследовании, было получено информированное согласие. Исследование проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией 1964 года и одобрено этическим комитетом ФГБУ “НМИЦК им. академика Е.И. Чазова” Минздрава России (протокол № 252 от 12 сентября 2019 года).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.