1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Молекулярная биология
  4. T. 57, № 5, 2023

Молекулярная биология, 2023, T. 57, № 5, стр. 807-818

Эффективность экспрессионных систем на основе Escherichia coli и Bacillus subtilis для получения мутантов рибонуклеазы биназы

А. И. Надырова a, *, А. С. Коснырев a, В. В. Ульянова a, Е. В. Дудкина a, В. И. Вершинина a, О. Н. Ильинская a

а Институт фундаментальной медицины и биологии, Казанский федеральный университет
420008 Казань, Россия

* E-mail: alsu.nadyrova@yandex.ru

Поступила в редакцию 05.04.2023
После доработки 24.04.2023
Принята к публикации 24.04.2023

Аннотация

Рибонуклеаза Bacillus pumilus (биназа) обладает выраженными цитотоксическими и онколитическими свойствами, а в высоких концентрациях может оказывать генотоксическое действие. Добиться снижения токсического действия фермента на организм позволит использование мутантов, обладающих пониженной каталитической активностью с сохранением противоопухолевых свойств нативного фермента. В представленной работе методом сайт-направленного мутагенеза получены мутантные формы биназы с единичными заменами: Lys26Ala и His101Glu. В результате проведенного сравнительного анализа систем экспрессии на основе Esсherichia coli и Bacillus subtilis показана целесообразность использования гетерологичной системы на основе бацилл для продукции мутантов биназы. Методом ионообменной хроматографии выделены и очищены мутанты биназы со сниженной каталитической активностью в гомогенном состоянии с максимальным выходом 25 мг/л. Каталитическая активность мутанта Lys26Ala составила 11, а His101Glu – 0.02%. Установлено, что мутант Lys26Ala, как и нативная биназа, обладает цитотоксичностью по отношению к опухолевым клеткам линий А549, ВТ-20 и HuTu 80, не оказывая при этом существенного влияния на популяцию нормальных клеток WI-38. Для мутанта His101Glu не выявлено цитотоксической активности.

Ключевые слова: рибонуклеаза, биназа, экспрессионная система, Escherichia coli, Bacillus subtilis, каталитическая активность, цитотоксичность

Список литературы

  1. Ulyanova V., Nadyrova A., Dudkina E., Kuznetsova A., Ahmetgalieva A., Faizullin D., Surchenko Y., Novopashina D., Zuev Y., Kuznetsov N., Ilinskaya O. (2022) Structural and functional differences between homologous bacterial ribonucleases. Int. J. Mol. Sci. 23, 1867.

  2. Ильинская О.Н., Шах М.Р. (2014) Рибонуклеазы как противовирусные агенты. Молекуляр. биология. 48, 707–717.

  3. Makarov A.A., Ilinskaya O.N. (2003) Cytotoxic ribonucleases: molecular weapons and their targets. FEBS Lett. 540, 15–20.

  4. Ardelt B., Ardelt W., Pozarowski P., Kunicki J., Shogen K., Darzynkiewicz Z. (2007) Cytostatic and cytotoxic properties of Amphinase: a novel cytotoxic ribonuclease from Rana pipiens oocytes. Cell Cycle. 6, 3097‒3102.

  5. Makarov A.A., Kolchinsky A., Ilinskaya O.N. (2008) Binase and other microbial RNases as potential anticancer agents. BioEssays. 30, 781–790.

  6. Митькевич В.А., Макаров А.А., Ильинская О.Н. (2014) Клеточные мишени противоопухолевых рибонуклеаз. Молекуляр. биология. 48, 214–222.

  7. Roiz L., Smirnoff P., Bar-Eli M., Schwartz B., Shoseyov O. (2006) ACTIBIND, an actin-binding fungal T2-RNase with antiangiogenic and anticarcinogenic characteristics. Cancer. 106, 2295–2308.

  8. Leland P.A., Schultz L.W., Kim B.M., Raines R.T. (1998) Ribonuclease A variants with potent cytotoxic activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 10407–10412.

  9. Ilinskaya O.N., Vamvakas S. (1997) Nephrotoxic effects of bacterial ribonucleases in the isolated perfused rat kidney. Toxicology. 120, 55–63.

  10. Yakovlev G.I., Moiseyev G.P., Struminskaya N.K., Borzykh O.A., Kipenskaya L.V., Znamenskaya L.V., Leschinskaya I.B., Chernokalskaya E.B., Hartley R.W. (1994) Mutational analysis of the active site of RNase of Bacillus intermedius (BINASE). FEBS Lett. 354, 305–306.

  11. Rosano, G.L., Ceccarelli E.A. (2014) Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Front. Microbiol. 5, 172.

  12. Yoon S.H., Kim S.K., Kim J.F. (2010) Secretory production of recombinant proteins in Escherichia coli. R-ecent Pat. Biotechnol. 4, 23–29.

  13. Pohl S., Bhavsar G., Hulme J., Bloor A.E., Misirli G., Leckenby M.W., Radford D.S., Smith W., Wipat A., Williamson E.D., Harwood C.R., Cranenburgh R.M. (2013) Proteomic analysis of Bacillus subtilis strains engineered for improved production of heterologous proteins. Proteomics. 13, 3298–3308.

  14. Hartley R.W., Rogerson D.L. Jr., Smeaton J.R. (1972) Production and purification of the extracellular ribonuclease of Bacillus amyloliquefaciens (barnase) and its intracellular inhibitor (barstar). II. Barstar. Prep. Biochem. 2, 243‒250.

  15. Herzberg C., Weidinger L.A.F., Dörrbecker B., Hübner S., Stülke J., Commichau F.M. (2007) SPINE: a method for the rapid detection and analysis of protein–protein interactions in vivo. Proteomics. 7, 4032–4035.

  16. Sambrook J., Russell D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Third Edition. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Lab. Press.

  17. Harwood C.R., Cutting S.M. (1991) Molecular Biological Methods for Bacillus. Chichester: Wiley.

  18. Kim R. (2011) Native agarose gel electrophoresis of multiprotein complexes. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, 884–887.

  19. Dudkina E., Ulyanova V., Shah Mahmud R., Khodzhaeva V., Dao L., Vershinina V., Kolpakov A., Ilinskaya O. (2016) Three-step procedure for preparation of pure Bacillus altitudinis ribonuclease. FEBS Open Bio. 6, 24–32.

  20. Li W., Zhou X., Lu P. (2004) Bottlenecks in the expression and secretion of heterologous proteins in Bacillus subtilis. Res. Microbiol. 155, 605–610.

  21. Ульянова В.В., Ходжаева В.С., Дудкина Е.В., Лайков А.В., Вершинина В.И., Ильинская О.Н. (2015) Препараты секретируемой РНКазы Bacillus pumilus: один фермент или два? Микробиология. 84, 425–425.

  22. Makarov A.A., Protasevich I.I., Kuznetsova N.V., Fedorov B.B., Korolev S.V., Struminskaya N.K., Bazhulina N.P., Leshchinskaya I.B., Hartley R.W., Kirpichnikov M.P., Yakovlev G.I., Esipova N.G. (1993) Comparative study of thermostability and structure of close homologues ‒ barnase and binase. J. Biomol. Struct. Dyn. 10, 1047–1065.

  23. Голубенко И., Балабан Н., Лещинская И., Волкова Т., Клейнер Г., Чепурнова Н., Афанасенко Г., Дудкин С. (1979) Рибонуклеаза Bacillus intermedius 7P. Очистка хроматографией на фосфоцеллюлозе и некоторые характеристики гомогенного фермента. Биохимия. 44(4), 640–648.

  24. Шульга А.А., Окороков А.Л., Панов К.И., Курбанов Ф.Т., Чернов Б.К., Скрябин К.Г., Кирпичников М.П. (1994) Cуперпродукция рибонуклеазы Bacillus intermedius 7Р (биназы) в E. coli. Молекуляр. биология. 28(2), 453–463.

  25. Kaur J., Kumar A., Kaur J. (2018) Strategies for optimization of heterologous protein expression in E. coli: roadblocks and reinforcements. Int. J. Biol. Macromol. 106, 803–822.

  26. Bhatwa A., Wang W., Hassan Y.I., Abraham N., Li X.Z., Zhou T. (2021) Challenges associated with the formation of recombinant protein inclusion bodies in Escherichia coli and strategies to address them for industrial applications. Front. Bioeng. Biotechnol. 9, 630551.

  27. Zhang K., Su L., Wu J. (2020) Recent advances in recombinant protein production by Bacillus subtilis. Ann-u. Rev. Food Sci. Technol. 11, 295–318.

  28. Okorokov A.L., Panov K.I., Kolbanovskaya E.Y., Karpeisky M.Y., Polyakov K.M., Wilkinson A.J., Dodson G.G. (1996) Site-directed mutagenesis of the base recognition loop of ribonuclease from Bacillus intermedius (binase). FEBS Lett. 384, 143–146.

  29. Okorokov A.L., Panov K.I., Offen W.A., Mukhortov V.G., Antson A.A., Karpeisky M.Ya., Wilkinson A.J., Dodson G.G. (1997) RNA cleavage without hydrolysis. Splitting the catalytic activities of binase with Asn101 and Thr101 mutations. Protein Eng. 10, 273–278.

  30. Yoshida H. (2001) The ribonuclease T1 family. Methods Enzymol. 341, 28–41.

  31. Бачинский А.Г. (1976) Структура и помехоустойчивость генетического кода. Журнал общей биологии. 37, 163–173.

  32. Sneath P.H. (1966) Relations between chemical structure and biological activity in peptides. J. Theor. Biol. 12, 157–195.

  33. Castro J., Ribó M., Vilanova M., Benito A. (2021) Strengths and challenges of secretory ribonucleases as antitumor agents. Pharmaceutics. 13, 82.

  34. Gotte G., Menegazzi M. (2019) Biological activities of secretory RNases: focus on their oligomerization to design antitumor drugs. Front. Immunol. 10, 2626.

  35. Dudkina E.V., Ulyanova V.V., Ilinskaya O.N. (2020) Supramolecular organization as a factor of ribonuclease cytotoxicity. Acta Naturae. 12, 24–33.

  36. Ilinskaya O., Singh I., Dudkina E., Ulyanova V., Kayumov A., Barreto G. (2016) Direct inhibition of oncogenic KRAS by Bacillus pumilus ribonuclease (binase). Biochim. Biophys. Acta Mol. 1863, 1559–1567.

  37. Hollestelle A., Elstrodt F., Nagel J., Kallemeijn W., Schutte M. (2007) Phosphatidylinositol-3-OH kinase or RAS pathway mutations in human breast cancer cell lines. Mol. Cancer Res. 5, 195–201.

  38. Medico E., Russo M., Picco G., Cancelliere C., Valtorta E., Corti G., Buscarino M., Isella M., Lamba S., Martinoglio B., Veronese S., Siena S., Sartore-Bianchi A., Beccuti M., Mottolese M., Linnebacher M., Cordero F., Di Nicolantonio F., Bardelli A. (2015) The molecular landscape of colorectal cancer cell lines unveils clinically actionable kinase targets. Nat. Commun. 6, 7002.

  39. Chen Y. H., Lv H., Shen N., Wang X. M., Tang S., Xiong B., Ding J., Geng M., Huang, M. (2020) EPHA2 feedback activation limits the response to PDEδ inhibition in KRAS-dependent cancer cells. Acta Pharmacol. Sin. 41, 270–277.

  40. Ulyanova V., Dudkina E., Nadyrova A., Kalashnikov V., Surchenko Y., Ilinskaya O. (2020) The cytotoxicity of RNase-derived peptides. Biomolecules. 11, 16.

  41. Зеленихин П.В., Еад Мохамед И.С., Надырова А.И., Сироткина А.А., Ульянова В.В., Миронова Н.Л., Митькевич В.А., Макаров А.А., Зенкова М.А., Ильинская О.Н. (2020) Рибонуклеаза Bacillus pumilus ингибирует миграцию клеток аденокарциномы двенадцатиперстной кишки человека HuTu 80. Молекуляр. биология. 54, 146–152.

  42. Alford S.C., Pearson J.D., Carette A., Ingham R.J., Howard P.L. (2009) Alpha-sarcin catalytic activity is not required for cytotoxicity. BMC Biochem. 10, 9.

  43. Navarro S., Aleu J., Jiménez M., Boix E., Cuchillo C.M., Nogués M.V. (2008) The cytotoxicity of eosinophil cationic protein/ribonuclease 3 on eukaryotic cell lines takes place through its aggregation on the cell membrane. Cell. Mol. Life Sci. 65, 324–337.

  44. Ilinskaya O., Ivanchenko O.B., Karamova N.S. (1995) Bacterial ribonuclease: mutagenic effect in microbial test-systems. Mutagenesis. 10, 165–170.

  45. Ilinskaya O.N., Karamova N.S., Ivanchenko O.B., Kipenskaya L.V. (1996) SOS-inducing ability of native and mutant microbial ribonucleases. Mutat. Res. 354, 203–209.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Молекулярная биология

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал