Молекулярная биология, 2023, T. 57, № 6, стр. 1150-1174

Ишемия

Нарушение нормального притока и оттока крови к органам (вызванного тромбозом, атеросклерозом, передавливанием сосудов и т.д.) вызывает развитие патологического состояния – ишемии. Ишемия приводит к развитию кислородного голодания (гипоксия/аноксия), нарушению поступления питательных веществ и вывода клеточных метаболитов, провоцирующих интоксикацию пораженных тканей. Снижение уровня O₂ нарушает работу электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) митохондрий (вследствие нехватки доноров электронов NADH⁺/NAD⁺ и QH₂) и подавляет окислительное фосфорилирование, что вызывает снижение уровня ATP. Оставшиеся молекулы ATP подвергаются катаболизму до гипоксантина, основного субстрата ксантиноксидазы (XO) – патологической формы ксантиндегидрогеназы (XDH), на стадии реперфузии. Кроме того, дефицит кислорода нарушает процесс β-окисления жиров и функционирования цитрат-малатного челнока. Все это приводит к энергетическому голоданию клетки и переходу на менее эффективный анаэробный способ извлечения энергии – гликолиз, в результате чего происходит накопление молочной кислоты и закисление внутриклеточной среды (ацидоз) [6]. Ацидоз, в свою очередь, приводит к ингибированию основных ферментов гликолиза и, в конечном счете, к еще большему дефициту ATP. Снижение внутриклеточного pH вызывает дестабилизацию мембран лизосом и высвобождение гидролитических ферментов, разрушающих структурные компоненты клеток (рис. 1).

Рис. 1.

Упрощенная схема ишемически-реперфузионного поражения. Красные сплошные и пунктирные стрелки относятся к ишемическим процессам; синие стрелки – к стадии реперфузии. XDH – ксантиндегидрогеназа; XO – ксантиноксидаза; mPTP – Сa²⁺-зависимая митохондриальная пора; DAMP – сигнальные молекулы опасности, ассоциированные с повреждениями; LOOP – продукты перекисного окисления липидов. NHE – Na⁺/H⁺-обменник; NCX – Na⁺/Ca²⁺-обменник; Glut 1/4 – переносчик глюкозы типа 1 или 4; FAT – переносчик жирных кислот.

Энергетический дефицит приводит к снижению активности ATP-зависимых Na⁺/K⁺-каналов, накоплению в клетке избытка ионов Na⁺ и H₂O и, как следствие, к нарушению электролитного и осмотического гомеостаза клеток [7]. Накопление ионов Na⁺ в клетке нарушает функцию Na⁺/Ca²⁺-обменника, вызывая рост концентрации Ca²⁺ в цитозоле с последующей активацией фосфолипаз (фосфолипаза А₂) и протеаз (кальпаины), нарушающих целостность клеток, а также активирующих ряд оксидаз. Например, под действием кальпаинов происходит частичный протеолиз XDH, что вместе с окислением остатков цистеина способствует превращению XDH в XO, которая играет важнейшую роль в патогенезе И-Р на стадии реперфузии.

В попытке снизить высокую концентрацию Ca²⁺ в цитозоле клетка увеличивает транспорт ионов Ca²⁺ через митохондриальный Ca²⁺-унипортер MCU (Mitochondrial Ca²⁺Uniporter). Используя отрицательный митохондриальный потенциал, MCU обеспечивает движение положительно заряженных ионов Ca²⁺ в митохондрии. В результате происходит снижение концентрации Ca²⁺ в цитозоле и, напротив, повышение Ca²⁺ в матриксе митохондрий. Избыток Ca²⁺ в матриксе митохондрий инициирует открытие митохондриальной поры mPTP (mitochondrial Permeability Transition Pore) во внутренней мембране митохондрий, что приводит к стремительному проникновению воды и растворенных в ней веществ (размером ≤1.5 кДа) в матрикс митохондрий, вызывая тем самым отек и разрыв наружной мембраны. В результате активируется программируемая гибель клеток (митофагия, аутофагия, апоптоз) [8]. Увеличение содержания ионов Ca²⁺ в клетке приводит к образованию комплексов пирофосфата кальция и мочевой кислоты, которые относятся к DAMP – индукторам “стерильного воспаления” [9]. Повышенный уровень DAMP служит сигналом для формирования инфламмасом, которые не только распознают DAMP с использованием NOD-подобных рецепторов (NRL), но и модулируют воспалительный ответ клетки, продуцируя ряд цитокинов: IL-1β, IL-18, TNF-α, IL-18 и IL-6. Это может активировать различные факторы транскрипции, такие как NF-κB, и увеличивать вероятность развития воспалительного ответа клетки. В конечном счете это активирует аутофагию –один из основных механизмов снижения уровня DAMP [10]. Если же процесс аутофагии не справляется с утилизацией DAMP, то это приводит к их выходу во внеклеточное пространство в результате некротической гибели клетки. Появление DAMP, провоспалительных цитокинов в периферической крови вызывает реакцию сосудистого русла, связанную с активацией системы свертывания крови и образованием внеклеточных нейтрофильных ловушек – NET (Neutrophils Extracellular Traps) [11]. Образование NET индуцируется при непосредственном участии тромбоцитов. Появление NET в кровеносных сосудах способствует быстрой локальной реакции свертывания крови, предотвращающей системное распространение DAMP [12]. Сывороточные факторы (иммуноглобулины, антитела, коллектины, молекулы адгезии, опсонины) активно формируют иммунные комплексы с внеклеточными DAMP. В свою очередь, эти иммунные комплексы активируют систему комплемента и активно фагоцитируются прежде всего нейтрофилами. Нейтрофилы кооперируются с активированными тромбоцитами и эндотелиальными клетками кровеносных сосудов, активированными DAMP. Это обеспечивает выход нейтрофилов из сосудистого русла в очаг ишемического повреждения для ограничения патологического очага, тромбоза сосудов, фагоцитоза поврежденных молекул, клеточных органелл и их обломков. Важно отметить, что привлеченные в очаг ишемии нейтрофилы играют важную роль в развитии окислительного стресса на стадии реперфузии, благодаря эффекту кислородного взрыва, опосредованного оксидазами.

Как отмечалось ранее, при ишемии наблюдается нарушение работы ЭТЦ митохондрий, что приводит к повышенной утечке электронов на остаточный молекулярный кислород (O₂) и генерации супероксидного анион-радикала ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$, который вызывает перекисное окисление липидов и нарушение мембранного потенциала митохондрий. Известно, что при ишемии образуется относительно небольшое количество АФК, однако на фоне сниженной антиоксидантной защиты организма это приводит к развитию начальной стадии окислительного стресса [13, 14].

Реперфузия

Восстановление кровотока и поступление насыщенной кислородом крови к ишемизированным тканям индуцирует запуск свободнорадикальных реакций и лавинообразному росту уровня АФК, что индуцирует развитие окислительного стресса, который играет ключевую роль в патофизиологии И-Р-поражения. В ходе реперфузии O₂ проникает в ишемизированные ткани, в которых уже активированы различные оксидазы. В частности, XO, образующаяся при ишемии, участвует в катаболизме пуринов до мочевой кислоты и в сопряженной реакции восстанавливает поступивший молекулярный кислород O₂ (вместо NAD⁺ в случае XDH) до ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$, который затем спонтанно (или при действии SOD) дисмутирует в H₂O₂, а также вступает в реакции с H₂O, H₂O₂ и другими молекулами, генерируя различные виды АФК (${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$ + H₂O → → HOO^• + НО⁻; ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$ + Н₂О₂ → НО^• + НО⁻ + + ¹О₂…). Интересно отметить, что еще на заре редокс-биологии, за год до открытия в 1968 году супероксид-дисмутазы, McCord и Fridovich предположили, что главным источником свободных радикалов при реперфузионном поражении служит XO. Кроме ХО, источниками АФК на стадии реперфузии являются: ЭТЦ митохондрий, NADPH-оксидазы (Nox/Duox), NO-синтазы (NOS), цитохром P450, липоксигеназы (LOX), циклооксигеназы (COX) и моноаминоксидазы (MAO) [15, 16].

Следует также отметить, что в образовании АФК в области И-Р-поражения участвуют привлеченные провоспалительными цитокинами клетки иммунной системы. Например, NADPH-оксидазы полиморфноклеточных нейтрофилов вносят существенный вклад в генерацию супероксидного анион-радикала (NADPH + 2О₂ → 2${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$ + + N-ADP⁺ + H⁺) [17]. Вероятно, NOX играют важнейшую роль в образовании ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$ на стадии реперфузии, так как фармакологическое ингибирование этих ферментов или подавление экспрессии их генов снижает тяжесть И-Р-поражений [18, 19]. Миелопероксидаза лейкоцитов (привлеченных цитокинами в область И-Р) окисляет анионы Cl и Br c образованием активных форм: HOCl и HOBr, являющихся мощными окислителями. Индуцибельная NO-синтаза (iNOS) макрофагов при компенсаторной генерации NO (в области адгезии клеток к эндотелию сосудов) способна образовывать ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$, провоцируя таким образом рост АФК (особенно высокотоксичного пероксинитрита ONOO⁻) [20].

На стадии реперфузии источниками АФК могут быть не только оксидазы, но и железосодержащие белки (такие как гемоглобин, миоглобин, цитохром С, трансферрин и др.), высвобождающиеся во внеклеточную среду после повреждения клеток [21, 22]. Ионы железа в простетических группах этих белков могут участвовать в реакции Фентона с пероксидом водорода (Н₂О₂ + Fe²⁺ → → Fe³⁺ + ^•OH + ⁻OH), что приводит к образованию высокореакционного гидроксильного радикала [23, 24]. Однако, по всей видимости, большая часть АФК продуцируется в реакциях, катализируемых указанными оксидазами.

В период реперфузии эффективность NHE-обменника возрастает за счет утилизации внеклеточных ионов H⁺, накопившихся во время ишемии. Это, в свою очередь, способствует избыточному накоплению ионов Ca²⁺ в клетке. В условиях реперфузии нарушается обратный захват Ca²⁺ эндоплазматическим/саркоплазматическим ретикулумом (ЭПР/СР) из цитозоля в связи с нарушением активности SERCA2b (Sarco/Endoplasmic Reticulum Ca²⁺-ATPase 2b), представленной преимущественно в гладкомышечных и немышечных тканях [25]. Это нарушение сопряжено с увеличением высвобождения Ca²⁺ из ЭПР/СР через рианодиновые рецепторы (Ryanodine Receptors, RyRs). Нарушения в обмене Ca²⁺ в ЭПР/СР приводят к увеличению концентрации Ca²⁺ в цитоплазме. Стремительное увеличение концентрации цитозольного Ca²⁺ приводит к активации различных гидролаз: фосфолипаз, протеаз и др., активность которых возрастает в период реперфузии, когда нормализуется уровень pH. Кроме того, рост концентрации ионов Ca²⁺ нарушает процесс сворачивания белков, метаболизма липидов и углеводов в ЭПР [26]. Рост количества неправильно свернутых/развернутых белков в просвете ЭПР приводит к развитию ЭПР-стресса, который может спровоцировать апоптоз клетки [27].

Как отмечалось ранее, уже на стадии ишемии в клетках накапливаются DAMP. Гибель клеток и выход DAMP в межклеточное пространство в ходе реперфузии индуцируют процессы острого воспаления. Воспалительные реакции, тромбозы и окислительный стресс, активируемые в период реперфузии, вызывают интерстициальный отек и развитие синдрома невосстановленного кровотока “no-reflow”, что оказывает дополнительное повреждающее действие [28]. Миграция провоспалительных нейтрофилов в очаг И-Р-повреждения приводит к развитию синдрома системного воспалительного ответа – SIRS (Systemic Inflammatory Response Syndrome) с последующей полиорганной недостаточностью, которая является основной причиной высокой летальности при И-Р-поражениях [29]. Полиорганная недостаточность может возникать при И-Р-повреждении кишечника, легких, печени, почек, скелетных мышц и сердца. Описан синдром компенсаторного противовоспалительного ответа (CARS, Compensatory Anti-inflammatory Response Syndrome) [30], действие которого противоположно ответу на SIRS и приводит к восстановлению гомеостаза. Однако длительное действие CARS вызывает развитие глубокой иммунодепрессии, которая проявляется нарушением процесса репарации, неспособностью противостоять бактериальной инфекции и формированием поздней полиорганной недостаточности.

Таким образом, взрывной рост уровня АФК в ходе реперфузии способствует развитию окислительного стресса, внося существенный вклад в усиление патологических процессов, связанных с нарушением энергетического обмена, дисфункцией митохондрий, электролитным дисбалансом, осмотическим стрессом, ЭПР-стрессом, развитием синдрома “no-reflow” и острой воспалительной реакции (рис. 1). Все эти процессы приводят к быстрой клеточной гибели, нарушению функции тканей и органов, подверженных И-Р-поражению [21, 22]. Несмотря на то, что механизм И-Р-поражения практически везде одинаков, его последствия для различных органов и тканей могут различаться. Наиболее чувствительны к действию И-Р ткани с густой сосудистой сетью и активным потреблением кислорода [31].

Транскрипционный фактор HIF

Основным регулятором экспрессии генов в условиях И-Р является фактор HIF. На сегодняшний день выделяют три изоформы HIF: HIF-1, HIF-2 и HIF-3, из которых основным регулятором клеточного и системного гомеостаза кислорода в клетках при И-Р считается HIF-1, состоящий из α- и β- субъединиц [40].

В качестве фактора транскрипции HIF-1 контролирует экспрессию более 100 генов, в число которых входят регуляторы ангиогенеза (фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и ангиопоэтин-2 (Ang2)), эритропоэза (эритропоэтин, EPO) и тонуса сосудов (гемоксигеназа-1, HO-1, iNOS, эндотелин-1 и др). Регуляция этих генов фактором HIF-1 увеличивает эффективность доставки кислорода к клеткам тканей, испытывающих гипоксию. Помимо этого, HIF-1 способен активировать транскрипцию генов, которые играют важную роль в регуляции пролиферации клеток (IGF-2, p21), в апоптозе (BNIP3 и BNIP3L), клеточной миграции и инвазии (виментин, матриксная металлопротеиназа-2, рецептор хемокина CXCR4), регуляции уровня pH (карбоангидраза-9). Отмечена важная роль HIF-1 в регуляции метаболизма глюкозы в процессе гликолиза путем увеличения экспрессии переносчиков глюкозы (Glut-1, 3) и ферментов гликолиза: гексокиназы 1 и 2 (HK-1, 2), фосфофруктокиназы-1 (PFK-1) и др. Важная роль HIF-1 в условиях И-Р показана на различных животных моделях [38, 39].

Механизм регуляции HIF-1 основан на ингибировании его транскрипционной активности в результате окисления в условиях нормальной концентрации кислорода в клетках. На первом этапе в результате воздействия O₂, Fe²⁺ и/или аскорбатзависимых пролилгидроксилаз-1-3 (PHD1-3) гидроксилированию подвергаются остатки пролина в α-субъединице HIF-1. Гидроксилированные остатки пролина взаимодействуют с белком pVHL (von Hippel-Lindau tumor suppressor protein), который в составе комплекса с элонгинами С и В, куллином (CUL2) и активной убиквитинлигазой Е3 участвует в убиквитинировании α-субъединицы HIF-1, подготавливая ее к деградации 26S протеасомой. Схожий механизм обнаружен и у белка FIH (Factor Inhibiting HIF), катализирующего реакцию гидроксилирования Asn803 в HIF-1α, однако этот белок (в отличие от PHD) в малой степени зависит от концентрации кислорода, но в большей степени зависит от концентрации АФК. В результате указанных реакций подавляется транскрипционная активность HIF-1, который утрачивает способность взаимодействовать с коактиватором p300/CBP [43]. В условиях ишемии (со снижением парциального давления O₂) происходит стабилизация и накопление HIF-1α с последующей его димеризацией с HIF-1β, который постоянно синтезируется в клетке независимо от концентрации кислорода. Образовавшийся гетеродимер HIF-1α/β транслоцируется в ядро клетки, где связывается с консенсусной последовательностью 5̓-(A/G)CGTG-3̓ внутри области HRE (Hypoxia-Response Element), что активирует транскрипцию целевых генов.

Фактор HIF-1 может регулироваться также посредством взаимодействия с различными киназами (MAPK, PI3K/AKT/mTOR) и другими транскрипционными факторами (p53, Myc, AP-1, NRF-2 и NF-κB) [43].

В ряде работ показано, что фактор NF-κB может быть прямым модулятором экспрессии HIF-1 не только в ответ на такие стимулы, как TNF-α и H₂O₂, но и на гипоксию [41, 42].

Взаимная регуляция факторов HIF-1α и p53 в условиях И-Р может осуществляться двумя способами: 1) посредством конкуренции p53 и HIF-1 за общий коактиватор транскрипции CBP/p300, присутствующей в ограниченном количестве (определяющим фактором при этом является тяжесть гипоксии); 2) посредством того, что субъединица HIF-1α может взаимодействовать с E3 убиквитин-лигазой Mdm2 и снижать протеасомную деградацию p53, увеличивая тем самым его транскрипционную активность. Стоит также отметить, что p53 регулирует содержание белка Mdm2 на уровне транскрипции по принципу обратной связи [46].

Взаимодействие между HIF-1 и NRF2 зависит не только от АФК, но и от сложной сети передачи сигналов, точный механизм которой установлен не полностью [47]. Показано также, что ингибитор NRF2 – брусатол, подавляет HIF-1α в клетках рака толстой кишки, способствуя его деградации в протеасомах [48]. Стоит отметить, что эти сигнальные пути не всегда работают согласованно. На культуре эндотелиальных клеток показано, что стабилизация HIF-1α подавляет передачу сигналов NRF2 через транскрипционный фактор Bach1, тогда как индукция NRF2 андрографолидом снижает экспрессию HIF-1α [49].

Взаимодействие между HIF-1α и сигнальным путем PI3K/Akt/mTOR осуществляется главным образом через комплекс mTORC1. mTORC1 регулирует HIF-α преимущественно за счет повышения фосфорилирования белка 4E-BP1, а также трансляцию HIF-1α, действуя через киназу S6K1 [50].

Транскрипционный фактор NRF2

Помимо HIF, особое место в регуляции клеточного гомеостаза в условиях И-Р отводиться транскрипционному фактору NRF2, который регулирует экспрессию более 1000 генов, участвующих в клеточной пролиферации, метаболизме, иммунном ответе и передаче сигналов. NRF2 играет ключевую роль в регуляции экспрессии генов, связанных с окислительно-восстановительным гомеостазом [51], таких как гены, ответственные за восстановление уровня NADPH (G6pd, Pgd, Idh1, Me1), метаболизм железа (Hmox1, Ftl, Fth), нейтрализацию свободнорадикальных и пероксидных АФК (PRDX, SOD, GPX) и т.д. [52].

Важность защитного действия NRF2 показана на модели И-Р сердца [53]. Обнаружено значительное снижение степени повреждения миокарда и сокращение восстановительного периода в группе мышей, получавших сероводород или 4-гидрокси-2-ноненаль для активации NRF2 перед этапом реперфузии [54].

NRF2 контролирует различные клеточные процессы, поэтому в зависимости от конкретных условий регуляция NRF2 может осуществляться на разных этапах сигнальных каскадов с участием множества киназ и других транскрипционных факторов. Например, транскрипционная активность NRF2 может регулироваться такими факторами, как Ahr, PPARγ, Sp-1, p53, MEF2D, c-Jun, c-Myc, BRCA1, HIF-1 и NF-κB [52, 53].

Важнейшую роль в регуляции транскрипционной активности NRF2 играет NF-κB, который конкурентно взаимодействует c их общим коактиватором – CBP/p300. В результате увеличение уровня NF-κB подавляет экспрессию гена NRF2 и наоборот [52]. Помимо этого, в комплексе с белком HDAC (Histone DeACetylase) NF-κB может регулировать транскрипцию генов, контролируемых NRF2, путем деацетилирования гистонов в области ARE (Antioxidant Response Element), препятствуя связыванию NRF2 и запуску экспрессии целевых генов [57]. Обратным примером является ситуация, когда NRF2 при участии белка RAC1 (GTPase Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1) ингибирует NF-κB, снижая тем самым его провоспалительную активность [58].

Регулировать NRF2 может также белок р53, который функционирует в качестве репрессора транскрипции генов, содержащихся в области ARE, что приводит к снижению транскрипционной активности NRF2. Кроме того (как и в случае с NF-κB), взаимная регуляция NRF2 и p53 может происходить в результате конкуренции за общий коактиваторный белок CBP/p300 [56, 57].

NRF2-ARE-зависимые антиоксидантные функции могут регулироваться с помощью сигнального пути PI3K/AKT. На культуре эпителиальных клеток сетчатки (ARPE-19) показано, что ингибирование сигнального пути PI3K/AKT вортманнином и LY294002 приводит к снижению транскрипционной активности NRF2. Кроме того, NRF2 способен регулировать собственную экспрессию через ARE-подобный элемент, расположенный в проксимальной области его промотора, приводя к “затяжной” индукции его целевых генов [61]. Показано также, что в регуляции транскрипции NRF2 участвуют различные эпигенетические механизмы, такие как метилирование промотора NRF2 в островках CpG, метилирование гистонов H3 и ацетилирование гистонов H4 [62].

На посттрансляционном уровне NRF2 регулируется путем протеасомной деградации его главного ингибитора – KEAP1 (Kelch-like ECH-associated protein 1). В нормальных условиях одна молекула NRF2 ассоциирована с двумя молекулами ингибитора KEAP1. Комплекс NRF2–KEAP1 подвергается убиквитинированию, что приводит к его быстрой деградации в протеасомах. В условиях повышенного уровня АФК в клетке остатки цистеина в молекулах KEAP1 окисляются, что приводит к изменению их конформации и диссоциации комплекса KEAP1–NRF2. Освободившаяся молекула NRF2 стабилизируется и транслоцируется в ядро, где связывается с элементами ARE в геномной ДНК и запускает транскрипцию целевых генов. Помимо KEAP1, активность NRF2 может регулироваться такими белками, как βTrCP, CRIF1 (CR6-interacting Factor 1), HRd1 и WDR23. Кроме того, в условиях окислительного стресса активность NRF2 может регулироваться путем посттрансляционной модификации – фосфорилированием Ser40 в домене Neh2 протеинкиназой С (PKC) [52].

Транскрипционный фактор NF-κB

Важную роль в регуляции клеточных процессов в условиях окислительного стресса играют не только факторы HIF-1 и NRF2, но и семейство фактора NF-κB. Этот фактор способен регулировать экспрессию более 100 генов, ответственных за иммунные реакции, пролиферацию и регенерацию. К числу генов, наиболее значимых в условиях И-Р, относятся гены цитокинов (IL-1, IL-6, IL-12, TNF-α/β), хемокинов (IL-8, MIP1, RANTES), проапоптотических белков (Bax, Bim), антиапоптотических белков (Bcl, c-FLIP, TRAF), ферментов антиоксидантной защиты (SOD), регуляторов тонуса сосудов (iNOS, HO-1, адреномодулин, эндотелин-1) и молекул клеточной адгезии (Е-селектин, VCAM-1) [63].

Семейство NF-κB состоит из пяти белков: p50 (и его предшественник p105), p52 (и его предшественник p100), p65 (RelA), c-Rel и RelB, образующих до 15 комбинаций различных димеров. Гомодимеры p50 и p52 подавляют экспрессию генов, тогда как p65, c-Rel и RelB в любых сочетаниях (в том числе и с p50, и с p52) активируют транскрипцию [64]. Белки семейства Rel содержат домен RHD (Rel Homology Domain) – высококонсервативную N-концевую последовательность из ~300 аминокислотных остатков, необходимую для образования белковых димеров, связывания NF-κB с IkB, а также для транслокации в ядро клетки. Кроме RHD, эти белки содержат сигнал ядерной локализации NLS (Nuclear Localizing Signal), необходимые для ядерной транслокации [65].

Основными регуляторами NF-κB в нормальных условиях являются его ингибиторы – белки семейства IkB (IkB-α, IkB-β, IkB-γ, IkB-δ, IkB-ε и Bcl-3), все члены которого содержат от пяти до семи анкириновых повторов (Ankyrin Repeat Domain – ARD), которые опосредуют взаимодействие с областью RHD в NF-κB, обеспечивая тем самым его цитоплазматическую локализацию [66].

В условиях И-Р наблюдается увеличение содержания различных клеточных индукторов, таких как АФК, TNF-α, IL-1, способных (например, посредством сигнального пути TLR (Toll-like receptor)) активировать специфические IkB-киназы (IKK), катализирующие реакцию фосфорилирования остатков серина в области SRR (Signal Responsive Regions) IkB (например, Ser32 и Ser36 в IkBα). После этого фосфорилированные IkB модифицируются убиквитинлигазами семейства SCF или SCRF и направляются, в конечном счете, на деградацию в 26S протеасому. В результате высвобожденный NF-κB транслоцируется в ядро, где связывается с консенсусной последовательностью (5′-GGGRNNYYCC-3′, где R – пурин, Y – пиримидин, а N – любое основание) в области kB, стимулируя тем самым транскрипцию целевых генов [67].

Фактор NF-κB может регулироваться такими транскрипционными факторами, как AP-1, p53, NRF2, HIF-1, PI3K/Akt/mTOR и др. NF-κВ взаимодействует с транскрипционным фактором AP-1 с помощью киназы ASK-1 с последующей активацией нижестоящих сигнальных каскадов (MKK4, MKK3/6, p38, JNK), в результате чего осуществляется регуляция роста, дифференцировки и апоптоза [68]. В свою очередь, ASK-1 активируется при окислении остатков цистеина под действием АФК [69]. Аналогичным образом происходит опосредованная АФК активация АР-1 – посредством окисления остатков цистеина с последующей активацией протеинкиназ (PTK, PKC, MAPK), фосфорилирующих c-Fos и c-Jun. AP-1 модулируется также путем окисления с последующим глутатионилированием остатков цистеина в семи субъединицах c-Fos и c-Jun. В свою очередь, АР-1 оказывает влияние на NF-κB [67, 68].

В регуляции NF-κB по эволюционно-консервативному механизму отрицательной обратной связи могут участвовать также киназы IKK/TAK-1 и HIF-1. В ряде случаев HIF-1 регулирует NF-κB с помощью циклинзависимой киназы-6 (CDK-6) совместно с ингибитором p21, а также посредством активации TNF-α и IL-1β, мощных индукторов NF-κB [72].

Взаимная регуляция факторов NF-κB и p53 в условиях И-Р может осуществляться в результате конкуренции за общий коактиватор p300/CBP, причем эта конкуренция определяется тяжестью гипоксического состояния клетки. Стоит отметить, что способность p53 связываться с ДНК (консенсусная последовательность 5'-PuPuPuC(A/T)(A/T)GPyPyPy-3') и активировать транскрипцию жестко регулируется посттрансляционными модификациями, важная роль среди которых принадлежит редокс-регуляции [73, 74]. NF-κB/RelA и p53 могут ингибировать активность друг друга путем прямого взаимодействия, в ходе которого образуются гетеродимеры/тетрамеры. Показано, что обработка культуры клеток индуктором p53 подавляет экспрессию генов-мишеней NF-κB [75, 76].

Регулировать NF-κB может также киназа AKT – ключевой компонент сигнального пути PI3K/AKT/mTOR: AKT фосфорилирует киназы IKKα и IKKβ, индуцируя тем самым их взаимодействие с IkB, что приводит к активации и ядерной транслокации NF-κB [77].

Сигнальный путь PI3K/AKT/mTOR

Важным регулятором внутриклеточных процессов в условиях И-Р является сигнальный путь PI3K/AKT/mTOR, центральные компоненты которого – фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K), киназы AKT и mTOR, регулируют клеточные процессы настолько взаимосвязанно, что их рассматривают как единый сигнальный путь. Взаимная связанность этих процессов имеет решающее значение для осуществления различных функций клетки, таких как регуляция метаболизма, пролиферация и репарация [78].

PI3K (фосфатидилинозитол-3-киназа) – первый основной элемент сигнального пути PI3K/AKT/mTOR, входит в семейство липидкиназ, способных катализировать перенос γ-фосфатной группы от ATP в положение D3 фосфоинозитидов. Выделяют три класса PI3K, которые различаются строением, субстратной специфичностью и функциям в клетке [79]. Киназы PI3K класса I изучены наиболее полно и представляют наибольший интерес в этом сигнальном пути. Отличительная особенность киназ данного класса состоит в том, что они представляют собой гетеродимеры, содержащие две субъединицы – каталитическую (p110) и регуляторную (p85). В составе PI3K класса I выделяют два подкласса: IА и IB. Киназа подкласса IA состоит из одной регуляторной субъединицы, представленной пятью изоформами (p85α, p55α, p50α, p85β или p55γ), и одной каталитической, имеющей три изоформы (p110α, p110β или p110δ). PI3K подкласса IB – это гетеродимерный белок, состоящий из регуляторного белка p101 (или p84) и связанной с ним каталитической субъединицы p110γ. PI3K активируется в результате взаимодействия с АФК и мембранной рецепторной тирозинкиназой (RTK, Receptor Tyrosine Kinases) или PDGFR (Platelet-Derived Growth Factor Receptor). На внутренней поверхности мембраны клеток происходит активация субъединицы p100, которая катализирует реакцию образования ключевого вторичного посредника фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфата (PtdIns(3,4,5)P₃) из фосфатидилинозитол-4,5-дифосфата (PtdIns(4,5)P₃). Образовавшийся PtdIns(4,5)P₃ взаимодействует с плекстрин-гомологичным (PH) доменом сигнальных киназ, таких как AKT и PDK1 (Phosphoinositide-Dependent Kinase) [79–81].

AKT – это серин/треониновая протеинкиназа, второй ключевой элемент сигнального пути PI3K/AKT/mTOR, активация которой инициируется транслокацией в цитоплазматическую мембрану. Эта транслокация опосредована взаимодействием PH-домена AKT (находящегося в N-концевой области) с PtdIns(4,5)P₃ на мембране клетки. В мембране AKT фосфорилируется по двум аминокислотным остаткам – Thr308 в киназном домене (киназой PDK-1) и Ser473 в гидрофобном мотиве (комплексом mTORC2) [78]. Активированный фосфорилированием AKT перемещается из мембраны в цитоплазму и ядро клетки, приобретает способность взаимодействовать с различными транскрипционными факторами, такими как FoxO (Forkhead box protein O), HIF-1, NRF2, NF-κB, mTOR и др. и регулировать широкий спектр клеточных процессов: синтез белка, репарацию, пролиферацию и др. [82]. Так, показано [83], что путь PI3K/AKT/FoxO3a участвует в регуляции апоптоза нейронов в развивающемся мозге крысы. Активированный AKT фосфолирует FoxO3a, что приводит к локализации FoxO3a в цитоплазме и ингибированию апоптоза [84]. Показано, что активаторы сигнального пути PI3K/AKT/FoxO3a: STS (Sodium Tanshinone IIA Sulfonate) и бромелаин защищают сердце крысы от И-Р-поражения [85]. Уровни белков AKT и HIF-1α увеличиваются в ответ на гипоксию в мезенхимальных стволовых клетках человека, где уровень фосфорилированного AKT достигал пика раньше, чем HIF-1α [86]. Установлено [87, 88], что ингибитор PI3K (LY294002) и двойной ингибитор PI3K/mTOR (NVP-BEZ235) могли подавлять активацию AKT, экспрессию HIF-1α и VEGF при ишемии. В свою очередь, это увеличивает тяжесть заболевания. Подавлять экспрессию HIF-1α может также вортманнин – ингибитор AKT [86].

mTOR – третий ключевой компонент сигнального пути PI3K/AKT/mTOR, играет важную роль в регуляции роста и пролиферации клеток. mTOR участвует в мониторинге доступности питательных веществ, уровней клеточной энергии, кислорода и митогенных сигналов [89]. mTOR принадлежит к группе Ser/Thr-протеинкиназ суперсемейства PI3K класса IV. mTOR входит в состав двух разных комплексов – mTORC1 и mTORC2. Комплекс mTORC1 состоит из каталитической субъединицы mTORC1, Raptor (regulatory associated protein of mTOR), PRAS40 (proline-rich AKT substrate 40 kDa), mLST8 (mammalian lethal with Sec13 protein 8), или GβL и PRAS40 (proline-rich PKB/AKT substrate 40 kDa). Этот комплекс является основным нижестоящим эффектором передачи сигналов от AKT и активируется посредством AKT-опосредованного ингибирования PRAS40 и TSC1-TSC2. В зависимости от условий mTORC1 контролирует широкий перечень клеточных процессов, фосфорилируя белки S6K, 4E‑BP1, IKK, а также усиливая экспрессию фактора HIF-1α [90, 91]. Комплекс mTORC2 состоит из субъединицы mTOR, Rictor (rapamycin insensitive companion of mTOR), mSIN1 (mammalian stress-activated protein kinase (SAPK)-interacting protein 1), Protor (protein observed rictor) и mLST8/GbL. Регуляторная активность mTORC2 не зависит от mTORK1. Считается, что mTORC2 опосредует пролиферацию, выживание, организацию актинового скелета и метаболизм липидов путем фосфорилирования белков-мишеней, которые включают в себя AKT, SGK (serum-/glucocorticoid-induced protein kinase) и некоторые виды PKC [92].

Передача сигналов в пути PI3K/AKT/mTOR негативно регулируется с помощью опухолевых супрессорных фосфатаз, инозитолполифосфат-4-фосфатазы типа 2 (INPP4B) и гомолога тензина (PTEN), способных превращать PtdIns(3,4,5)P₃ в PtdIns(3)P. Известно также, что PTEN может окисляться и ингибироваться H₂O₂, приводя к активации PI3K/AKT/mTOR. Показано, что PTEN может взаимодействовать с пероксиредоксином 1 (Prx1), защищая таким образом свой липидфосфатазный участок, локализованный в N-концевом домене, от инактивирующего действия H₂O₂ [93]_. Установлено также, что активированная S6K (Ribosomal S6 Kinase p70, p70S6K) способна негативно регулировать PI3K/AKT/mTOR путем фосфорилирования mTORC2, что приводит к снижению mTORC2-зависимого фосфорилирования Ser472 в составе AKT [94].

Гипотермия

Понижение температуры органа, подверженного И-Р, является одним из наиболее действенных подходов к снижению поражения тканей. Этот прием используется в трансплантологии еще с середины 20 века. Гипотермия обеспечивает обратимое снижение активности ферментных систем (особенно это важно в случае оксидаз) и скорости клеточного метаболизма в целом, а также минимизирует потребность тканей в кислороде [95]. Например, при снижении температуры до +4°С активность ферментов составляет всего 10% от исходных значений, а потребность тканей в кислороде снижается на 80–90%, что позволяет уменьшить тем самым энергетический дефицит [96]. Снижение активности оксидаз при гипотермии снижает продукцию АФК на стадии ишемии, а также тяжесть реперфузионного периода. Кроме того, гипотермия замедляет процессы деградации клеточных компонентов (активации протеаз и т.д.), стабилизирует мембрану клеток и снижает развитие острых воспалительных процессов на стадии реперфузии [97, 98]. Гипотермия оказалась эффективным нейрозащитным подходом при моделируемом на животных ишемическом инсульте [99]. Клинические исследования показали также лучшие неврологические исходы у пациентов с риском ишемического поражения головного мозга при использовании лечебной гипотермии [100]. Важно отметить, что применение гипотермии недостаточно для эффективного сохранения ишемизированных органов, так как И-Р-поражение развивается также при восстановлении кровотока по мере согревания тканей. Кроме того, при гипотермии нарушается работа ионных каналов. Например, нарушение функции Ca²⁺-каналов вызывает перегрузку внутриклеточного кальция, что приводит к нарушению многих внутриклеточных процессов и развитию серьезных клеточных повреждений. Подавление активности ATP-зависимых Na⁺/K⁺-каналов приводит к перетоку ионов Na⁺ и Cl^– вместе с водой из внеклеточного пространства во внутриклеточное, что может вызывать клеточный отек. Проблему отека изолированных органов при гипотермии отчасти решают добавлением в перфузирующий раствор сахаров (глюкоза, трегалоза, раффиноза) или маннитола, которые не проникают пассивно в клетки и удерживают внеклеточную воду, предотвращая тем самым отек клеток [101]. В качестве примера можно привести кардиоплегический раствор Кустадиол (Custodiol, или HTK – Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate), который нашел широкое применение при холодовой консервации донорских органов (сердце, почки, печень). Кустадиол, благодаря высокой концентрации калия (9 мМ), вызывает остановку сердца за счет деполяризации мембраны кардиомиоцитов, что снижает расход ATP и потребность клеток в кислороде. Высокое содержание гистидина (198 мМ) снижает ацидоз, вызванный накоплением анаэробных метаболитов во время длительного ишемического периода; кетоглутарат (1 мМ) способствует синтезу ATP на стадии реперфузии; триптофан (2 мМ) стабилизирует клеточную мембрану, а маннитол (30 мМ) уменьшает клеточный отек и нейтрализует свободные радикалы [102].

Интересно отметить, что гибернирующие млекопитающие (такие, как суслики) испытывают экстремальное понижение температуры тела (от 2 до 10°С) и проявляют высокую устойчивость к И‑Р-поражению печени, сердца и тонкого кишечника во время зимней спячки. Потребление кислорода в тканях таких животных снижается до 2–3% от нормальных значений, при этом происходит переключение с углеводного обмена на липидный для обеспечения клеток энергией [103–105]. Такое метаболическое переключение снижает активность гликолиза и образование лактата, препятствуя тем самым развитию ацидоза (см. выше). Кроме того, увеличение метаболизма липидов приводит к образованию кетоновых тел и активации рецепторов PPAR (Peroxisome Proliferator-Activated Receptors), которые защищают от И-Р-повреждения, модулируя экспрессию многих генов [106].

В настоящее время ведется поиск веществ, способных вызвать гипотермию, для клинического применения. Например, гипотермию могут вызывать гормон желудка грелин, 5'-AMP, 3-йодтиронамин (T1AM) и газ H₂S. Механизмы действия таких соединений до конца не изучены, однако нет сомнений, что глубокое понимание этих механизмов позволит разработать новые медицинские стратегии [105].

Ишемическое пре- и посткондиционирование

Кроме гипотермии, одним из эффективных методов защиты тканей от И-Р-поражений является впервые испытанное в 1986 г. ишемическое прекондиционирование (ИПК), которое позволяет активировать эндогенную систему антиоксидантной защиты (в первую очередь, ферменты-антиоксиданты), способствуя увеличению устойчивости клеток к АФК на стадии реперфузии [107]. Методологически ИПК представляет собой серию (3–4 цикла) коротких этапов ишемии (3–5 мин) с последующей реперфузией (5 мин). На различных животных моделях И-Р-поражения сердца, почек, печени, легких, кишечника, мозга убедительно показано, что такая “подготовка” к более длительной ишемии способствует существенному сохранению тканей. Например, четыре коротких эпизода окклюзии коронарной артерии, чередующиеся с пятиминутными периодами реперфузии перед длительной (40 мин) ишемией сердца, уменьшали зону инфаркта на 70–80% [108]. ИПК может осуществляться с применением как физиологических приемов (кратковременная окклюзия сосудов), так и с помощью фармакологических препаратов. Среди препаратов, вызывающих эффект прекондиционирования, можно отметить аденозин, агонисты рецепторов аденозина, препараты, открывающие K⁺ATP-каналы (никорандил), доноры оксида азота (нитриты), агонисты PKC (кальфостин C), соединения лития (ингибиторы киназы гликогенсинтазы-3β (GSK-3β)), ингаляционные анестетики (изофлюран) и др. [103, 105, 106].

Однако применение ИПК не всегда возможно, так как этот подход работает только непосредственно перед ишемией, при развитии окислительного стресса после реперфузии он неэффективен. Отчасти эта проблема решается с помощью ишемического посткондиционирования (ИПостК) – метода, успешно примененного на миокарде крыс в 2003 г. [111]. ИПостК представляет собой серию коротких ишемических стимулов (например, три цикла: 30 с ишемия, 30 с реперфузия), выполненных в раннем реперфузионном периоде, что, как и в случае ИПК, запускает, вероятно, эндогенные защитные механизмы [108, 109]. ИПостК более привлекателен для клинического применения, поскольку его можно быстро вызвать в начале реперфузии с помощью серии коротких циклов И-Р после серьезного ишемического события. На сегодняшний день изучены различные способы фармакологического ИПостК, а также проведены доклинические испытания некоторых препаратов на животных моделях. К таким препаратам относятся агенты, воздействующие на различные рецепторы (аденозиновые, α-адренергические, опиоидные, брадикининовые, эстрогеновые) или активирующие различные сигнальные пути клетки PI3K/AKT (GYY4137, генистеин), HIF-1α (севофлуран), GSK3b (cфингозин-1-фосфат – S1P), JNK (морфин, налоксон) [113].

Ингибиторы оксидаз

Одним из наиболее эффективных подходов к предотвращению И-Р-поражений принято считать ингибирование некоторых ключевых оксидаз, таких как XO, NADPH-оксидазы (NOX/DUOX) и моноаминоксидазы (MAO). Эти оксидазы провоцируют стремительный рост уровня АФК в ишемизированных тканях на стадии реперфузии, причем не только в месте развития ишемии. Например, XO может попадать в плазму крови и связываться с поверхностью эндотелия сосудов органов, не подверженных ишемии, вызывая тем самым системное повреждение. Показано, что иммуноблокада с помощью антител к циркулирующей в плазме XO защищает легочное сосудистое русло от пагубного воздействия И-Р-поражения кишечника [114]. Как отмечено ранее, XO – патологический вариант XDH, образующийся либо в результате окисления остатков цистеина, либо частичного протеолиза кальпаинами. XO – гомодимерная молибден-содержащая оксидоредуктаза, содержащая дополнительные кофакторы: железосерный кластер ферредоксина (2Fe-2S) и FAD. ХО окисляет пурины (гипоксантин и ксантин) до мочевой кислоты, используя при этом в сопряженной реакции вместо NAD⁺ (как и XDH) молекулярный кислород O₂, который окисляет до ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$. Показано, что применение ингибиторов XO позволяет существенно снизить индуцированную И-Р проницаемость сосудов и снизить тяжесть И-Р-повреждений [115]. При этом эффективность таких ингибиторов зависит как от их природы, так и от патологии, при которой их применяют. Например, пуриновые ингибиторы (неокисляемые аналоги гипоксантина – аллопуринол и оксипуринол) более эффективно предотвращают развитие сердечно-сосудистых патологий, чем непуриновые (фебуксостат и топироксостат) [116].

Ингибиторы NADPH-оксидаз относятся к наиболее перспективным терапевтическим средствам при заболеваниях, связанных с окислительным стрессом. В норме NADPH-оксидазы (преимущественно NOX2) участвуют в иммунной защите организма в случае так называемого кислородного взрыва в фагоцитах, при котором в 10–20 раз увеличивается потребление O₂ и его окисление до супероксидного анион-радикала (NADPH + 2О₂ → 2${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$ + NADP⁺ + H⁺). NA DPH-оксидаза (NOX) состоит из цитозольных (p47phox, p67phox, p40phox и Rac) и мембранных субъединиц (gp91phox и p22phox). Во время активации NOX (в том числе при ишемии) цитозольные субъединицы фосфорилируются киназами, мигрируют к плазматической мембране для “стыковки” с мембранными субъединицами и образуют многокомпонентный фермент, генерирующий ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$ [117]. Следует также отметить, что в области ишемии развиваются провоспалительные процессы, которые способствуют активации NOX в полиморфноядерных нейтрофилах. Таким образом, NOX играют ключевую роль в генерации ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$ на стадии реперфузии [118, 119]. Первые ингибиторы NADPH-оксидаз (апоцинин и дифенилениодоний) не проявляли достаточной селективности к различным изоформам NOX. Новые селективные ингибиторы NOX, такие как GKT137831, ML171 и VAS2870, более специфичны и селективны в отношении различных изоформ NADPH-оксидаз. С помощью рационального дизайна разработан селективный ингибитор NOX2 – 18-членный пептид NOX2ds-tat, содержащий последовательность из 9 аминокислотных остатков внутриклеточной B-петли NOX2, которая связывает белок-организатор p47phox, тем самым предотвращая сборку активного комплекса NOX2 [120]. Вторая часть пептида (TAT-фрагмент трансактиватора транскрипции ВИЧ) обеспечивает проникновение всего пептида в клетку. NOX2ds-tat показал свою эффективность в условиях in vivo на животных моделях [119]. Таким образом, разработка изоформ-специфичных ингибиторов NOX позволит избирательно подавлять изоформы NOX, активация которых выявлена при определенных патологиях. На сегодняший день препарат GKT137831 (специфический ингибитор NOX1/4) является первым ингибитором NOX, проходящим клинические испытания в качестве средства для лечения идиопатического легочного фиброза [115, 117].

Еще один важный источник АФК при И-Р-поражениях – флавоферменты МАО, расположенные на внешней мембране митохондрий, которые катализируют окислительное дезаминирование катехоламинов, серотонина и биогенных аминов. В ходе дезаминирования, катализируемого MAO, образуется соответствующий альдегид, а также H₂O₂ и аммиак или замещенный амин, в зависимости от субстрата. Гиперактивация MAO и рост количества продуктов их катализа негативно влияют на функцию митохондрий и жизнеспособность клетки в целом. Избыточную активность MAO связывают с различными патологическими состояниями [122, 123]. Важная роль МАО в метаболизме нейротрансмиттеров сделала их терапевтическими мишенями при глубокой депрессии и болезни Паркинсона, а также при других нейродегенеративных заболеваниях. Уже в конце 1950-х годов было одобрено применение первых ингибиторов MAO при глубокой депрессии. Обнаружение двух изоферментов МАО (МАО-А и МАО-В) с различной субстратной избирательностью и тканевой экспрессией привело к новым терапевтическим подходам и разработке новых классов ингибиторов (обратимых/необратимых). В настоящее время различные ингибиторы MAO проходят испытания в качестве средств для лечения болезни Альцгеймера, бокового амиотрофического склероза и сердечно-сосудистых заболеваний [124].

Доноры сероводорода

Долгое время сероводород (H₂S) считали токсичным газом, который обратимо ингибирует цитохром-c-оксидазу (COX) ЭТЦ митохондрий, тем самым подавляя окислительное фосфорилирование и снижая уровень ATP. В настоящее время H₂S рассматривается как третий сигнальный газотрансмиттер (после NO и CO), выполняющий широкий спектр физиологических и патофизиологических функций в организме. Сегодня убедительно показано, что применение H₂S и его предшественников может оказывать защитный эффект при реперфузионном повреждении.

В норме H₂S вырабатывается различными типами клеток и может легко диффундировать (как и в случае с NO и CO) во внутриклеточном и межклеточном пространстве, не нуждаясь в транспортерах. Снижение уровня H₂S в организме связывают с развитием целого ряда патологических состояний, таких как гипертония, сахарный диабет, атеросклероз, сердечная недостаточность, сепсис, воспаление, катаракта, астма и нейродегенеративные заболевания [125]. Напротив, при избыточной продукции H₂S (например, при трисомии хромосомы 21) прогрессирование таких свободнорадикальных патологий, как атеросклероз, происходит медленнее [126]. H₂S снижает образование окисленных липопротеинов низкой плотности (oxLDL), подавляет экспрессию скавенджер-рецепторов (ответственных за накопление oxLDL), препятствуя тем самым образованию пенистых клеток из макрофагов и прогрессированию атеросклероза [125].

В низких концентрациях H₂S стимулирует деятельность митохондрий, выступая в качестве донора электронов с эффектом, сравнимым с работой NADH или FADH₂. На стадии ишемии H₂S может способствовать поддержанию энергетического гомеостаза, снижая негативное влияние гипоксии [127], участвуя в регуляции активности нейронов, вазодилатации сосудов, регуляции уровня глюкозы [128]. Кроме того, благодаря беспрепятственной диффузии, H₂S влияет и на другие регуляторные молекулы [129]. В частности, взаимодействуя с остатками цистеина, H₂S влияет на активность важнейшего регулятора антиоксидантного ответа NRF2 [130], ATP-чувствительные калиевые каналы митохондрий (KATP) [131], рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) [132] и рецептор фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR) [133]. Показано, что H₂S увеличивает экспрессию VEGF, действуя через сигнальный путь PI3K/AKT и активацию HIF-1α, стимулируя тем самым ангиогенез [134]. H₂S способствует повышению уровня глутатиона (GSH) и антиоксидантных белков (гемоксигеназа-1, глутатион-S-трансферазы и тиоредоксин-1) в клетке. Кроме того, через опосредованные AKT сигнальные пути H₂S подавляет открытие митохондриальной поры (mPTP), высвобождение цитохрома с и активацию каспаз, тем самым препятствуя развитию апоптоза [135].

Появляется все больше доказательств того, что H₂S может защищать от И-Р-повреждения различные органы и ткани (сердце, печень, почки, мозг, легкие, кишечник и др.) [136]. Газ H₂S достаточно сложно дозировать из-за его летучести, высокой растворимости и скорости диффузии, что может привести к токсическому действию. В этой связи разработаны соединения, которые постепенно высвобождают H₂S. На сегодняшний день известно более 60 таких веществ, которые можно разделить на два основных типа: 1) истинные доноры H₂S и 2) гибридные препараты, содержащие другое действующее вещество [128]. В качестве доноров H₂S широко используются неорганические соли: сульфиды (Na₂S, CaS), гидросульфиды (NaHS) и тиосульфаты (Na₂S₂O₃). При этом максимальная концентрация H₂S, высвобождаемого из таких солей, достигается за несколько секунд–минут, следовательно, эффективное время пребывания H₂S в пораженных тканях очень короткое. Идеальные доноры H₂S для терапевтических целей должны генерировать H₂S с относительно медленным высвобождением и более длительным временем пребывания в организме. За последнее время разработаны и синтезированы различные гибридные препараты, медленно высвобождающие H₂S и при этом оказывающие антиапоптотическое, противовоспалительное и антиоксидантное действие [128, 136].

Возможность использования H₂S и его предшественников при И-Р-повреждениях нуждается в дальнейшем изучении, так как до сих пор известны не все молекулярные мишени H₂S, а долгосрочные последствия применения доноров H₂S не исследованы. Вероятно, создание новых эффективных доноров H₂S, подбор оптимальных способов их применения (способы введения, временной диапазон применения, эффективные концентрации и т.д.) позволит внедрить их в клиническую практику.

Препараты, направленные на митохондрии

Как отмечалось ранее, митохондрии – основной источник АФК в клетке. При И-Р роль митохондрий как источника энергии, АФК и важнейшего регулятора программируемой клеточной гибели (митофагии, аутофагии и апоптоза) многократно возрастает. Хорошо известно, что в гибели клеток с участием митохондрий ведущую роль играет mPTP [8]. Избыток Ca²⁺ в матриксе митохондрий, возникающий при дисфункции ионных каналов, инициирует открытие mPTP и гибель клеток. При этом открытие mPTP является мощным стимулом образования митохондриальных АФК, которые, в свою очередь, усиливают открытие mPTP и провоцируют взрывной рост АФК [137]. Таким образом, открытие mPTP приводит к митохондриальной дисфункции и, в конечном счете, к гибели клетки. Поэтому mPTP, как объект фармакологического воздействия, представляет значительный интерес [138]. Следует отметить, что точная структура mPTP до сих пор не определена. Не вызывает сомнений, что mPTP – это комплекс белков внешней и внутренней мембраны митохондрий. При этом единственным точно установленным компонентом, входящим в mPTP, является циклофилин D (CypD), который в присутствии ионов Са²⁺ стимулирует перестройку комплекса белков, ответственных за формирование канала mPTP [139], поэтому большинство известных ингибиторов mPTP нацелены на CypD. Современные ингибиторы mPTP можно разделить на две большие категории: 1) ингибирующие CypD и 2) ингибирующие mPTP через CypD-независимые механизмы [140].

Одним из первых обнаруженных ингибиторов CypD был циклоспорин А (CsA). Первые клинические испытания CsA показали, что его введение в ходе чрескожного коронарного вмешательства приводит к 40%-ному уменьшению размера инфаркта у пациентов с реперфузионным повреждением [141]. Однако более масштабные и детальные клинические исследования не позволили выявить статистически значимой разницы между контрольной (плацебо) и экспериментальной группами с применением CsA, что может быть связано с узким терапевтическим окном и побочным имуносупрессивным действием CsA. Создание полусинтетических модифицированных форм CsA (NIM-811, Debio025/alisporivir), не обладающих иммуносупрессивными свойствами, отчасти решает эту проблему и позволяет надеяться на появление новых эффективных ингибиторов mPTP.

Первым CypD-независимым ингибитором, который связывается с белком-транслокатором TSPO (известным также как периферический бензодиазепиновый рецептор – PBR), находящимся на внешней мембране митохондрий, стал TRO-40303. Однако в дальнейшем установили, что TSPO не участвует в образовании mPTP, а клинические испытания предсказуемо показали его неэффективность. В настоящее время активно изучают другие CypD-независимые ингибиторы mPTP (ER-000444793, GNX-4975, GNX-4728 и др.), которые, возможно, будут более эффективно подавлять открытие mPTP [140, 142].

Сегодня развиваются также альтернативные подходы к ингибированию открытия mPTP, направленные на процессы (сигнальные пути), предшествующие открытию mPTP. К таким подходам относятся модуляция окислительно-восстановительного состояния митохондрий, коррекция/защита функции ЭТЦ митохондрий, а также регуляция концентрации внутриклеточного и митохондриального Ca²⁺ [140].

Антиоксиданты

Как отмечено ранее, в основе патогенеза И-Р-поражения лежит гиперпродукция АФК на стадии реперфузии и развитие окислительного стресса. С помощью электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) показано, что образование свободнорадикальных форм АФК (в первую очередь ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$) в ишемизированных тканях миокарда начинается уже в первые секунды реперфузии [143]. На более поздних стадиях реперфузии в тканях, подверженных И-Р-поражению, детектируются характерные продукты свободнорадикального окисления липидов (МДА, 4-гидроксиноненаль, акролеин), белков (карбонильные модификации) и нуклеиновых кислот (8-оксо-dG) [31]. Такие окислительные модификации приводят к дисфункции биологических макромолекул, накоплению мутаций и, в конечном счете, к гибели клетки.

В многочисленных экспериментах показано, что животные, имеющие дефицит антиоксидантов (как низкомолекулярных, так и ферментов), более чувствительны к действию И-Р. Напротив, животные с суперэкспрессией ферментов-антиоксидантов (SOD, GPx, Prx) проявляют устойчивость к И-Р [144].

Низкомолекулярные антиоксиданты. Одними из первых соединений, изученных в начале 50-х годов 20 века в качестве антиоксидантов и радиопротекторов, в частности, были цистеин, глутатион, цистамин и их аналоги. Самыми эффективными оказались соединения, содержащие сульфгидрильную и аминогруппу, из которых наиболее известны N-ацилцистеин, цистамин, меркаптопропионилглицин, производные тиомочевины, бигуаниды, диэтилдитиокарбамат и 2-меркаптоэтансульфонат натрия [145]. Приведем несколько примеров применения низкомолекулярных антиоксидантов при И-Р-поражениях.

Внутривенное введение N-ацетилцистеина при аортокоронарном шунтировании приводило к почти двукратному снижению уровня супероксидного анион-радикала (${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$), H₂O₂ и гипохлорита (HClO⁻) в пробах крови пациентов [146]. Кроме того, применение N-ацетилцистеина в период реперфузии статистически значимо снижало уровень МДА в крови, тогда как уровень активности антиоксидантных ферментов (SOD и GPx) при этом значимо повышался [147].

Метформин, изначально применяемый при сахарном диабете типа 2, проявляет плейотропный эффект [148]. В частности, в серии исследований показано, что метформин может предотвращать реперфузионное повреждение сердца. Оказалось, что метформин ингибирует комплекс I в ЭТЦ митохондрий, подавляя тем самым производство АФК и оказывая антиоксидантный эффект, способствуя снижению повреждений в реперфузионный период [149]. Кроме того, кардиозащитный эффект метформина при ишемии опосредован активацией протеинкиназы AMPK (5'-АМР-активируемая киназа) [150].

На сегодняшний день одобрено клиническое применение мощного антиоксиданта – эдаравона, который подавляет образование АФК, открытие mPTP и запуск ферроптоза [151]. Эдаравон проявил высокую эффективность в различных моделях И-Р-поражения: мозга, сердца, печени, почек и легких [140, 152–154].

Особое место среди низкомолекулярных антиоксидантных препаратов занимают митохондрильно-направленные соединения. К таким препаратам относятся хиноны: MitoQ10 (на основе убихинона), SkQ и его производные (на основе пластохинона), подавляющие генерацию ${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$ в ЭТЦ митохондрий [151, 152]. Защитный эффект этих веществ показан на различных клеточных и животных моделях патологических состояний, связанных с окислительным стрессом (И-Р-поражения, сахарный диабет, нейродегенеративные заболевания, старение и т.д.). Например, обнаружен защитный эффект SkQR1 при И-Р-поражении почек и мозга лабораторных животных [155–159].

Cелен-содержащие соединения. Изучение селен-содержащих соединений выявило перспективность их применения при И-Р-повреждениях. Использование селен-содержащих продуктов позволяет повысить активность ферментов (в первую очередь, селен-содержащих глутатионпероксидаз), содержащих селеноцистеин, что особенно важно в условиях хронического окислительного стресса (например, при воспалительных процессах). Однако важно отметить достаточно узкий диапазон допустимой концентрации селена, который, с одной стороны, покрывает дефицит селена, а с другой – не оказывает токсического действия. В этой связи для терапевтического применения селена очень важно подобрать оптимальную дозу препарата [160]. По-видимому, наибольший интерес представляет селен в форме наночастиц, учитывая их большую биодоступность и безопасность. Высокая эффективность наночастиц селена показана на моделях И-Р-поражения мозга [161].

Миметики антиоксидантных ферментов. Миметики ферментов, представляют собой низкомолекулярные соединения, имитирующие активность ферментов. В настоящее время известны миметики SOD, CAT и GPx. Одними из первых были синтезированы миметики SOD – комплексы органических соединений с ионами железа, меди, цинка, никеля и марганца. Комплексы марганца более предпочтительны, поскольку марганец лучше переносится клетками и не катализирует реакции Фентона и Габера–Вейса, генерирующие образование высокореакционого и токсичного гидроксильного радикала HО^•. Известные миметики MnSOD включают комплексы марганца с такими соединениями, как порфирины, салены, циклические полиамины, фталоцианины или пептидные лиганды [162]. Некоторые миметики SOD обладают несколькими антиоксидантными активностями. Например, EUK-134, комплекс ароматического соединения с марганцем, проявляет не только супероксид-дисмутазную активность, но и пероксидазную, оказывая тем самым мощный антиоксидантный эффект [163, 164]. В настоящее время ведутся активные работы по синтезу новых миметиков SOD [165].

На сегодняшний день известно более 70 селен-содержащих органических соединений, которые обладают антиоксидантными свойствами. Эбселен, имитирующий активность GPх, показал многообещающие результаты в ряде исследований [166]. Показано, что эбселен эффективно восстанавливает пероксид водорода и пероксинитрит, благодаря чему защищает почки от окислительного повреждения после ишемии. Кроме того, применение эбселена улучшает состояние головного мозга пациентов, перенесших окклюзионную ишемию [167]. Ведутся работы по получению аналогов эбселена с новыми фармакологическими свойствами [168].

Некоторые наночастицы оксидов металлов, таких как CeO₃, TiO₂ и Fe₃O₄, проявляют антиоксидантные свойства, имитируя ферменты-антиоксиданты. Простой способ получения таких соединений, относительно низкая токсичность, гибкость в их модификации возможность делает их привлекательными для применения в различных областях, в том числе в биомедицине [169].

Миметики представляют значительный интерес для применения в лечении патологий, связанных с окислительным стрессом, так как, обладая схожими каталитическими свойствами с имитируемыми ферментами-антиоксидантами, они имеют относительно малые размеры и благодаря этому легче проникают в клетки. Однако, несмотря на ряд преимуществ миметиков по сравнению с исходными ферментами, в условиях in vivo они оказываются малостабильными. Кроме этого, миметики все же уступают исходным ферментам по активности, а в ряде случаев могут проявлять токсичность [170].

Экзогенные ферменты-антиоксиданты. Несомненно, наиболее эффективным способом элиминации АФК является ферментативный катализ. Среди ферментов-антиоксидантов наиболее известны SOD, CAT, (GPx), глутатион-S-трансферазы (GST), тиоредоксины (Trx), пероксиредоксины (Prdx) и др. Несмотря на широкий спектр известных ферментов антиоксидантного действия, лишь немногие из них нашли практическое применение.

SOD относятся к важнейшим антиоксидантным ферментам, осуществлящим дисмутацию супероксид анион-радикала в менее опасный пероксид водорода: 2${\text{O}}_{2}^{{\centerdot - }}$ + 2Н⁺ → Н₂О₂ + О₂ (SOD). Уже спустя 5 лет после открытия SOD (1969 г.) и понимания их важнейшей функции в клетке, были предприняты попытки их применения для коррекции лучевой болезни. Применение экзогенных SOD для коррекции И-Р-поражений началось значительно позже (1987 г.). Эксперименты на животных моделях И-Р показали, что применение экзогенной Cu/Zn-содержащей SOD уменьшает реперфузионное повреждение тканей: желудка [171], сердца [172], почек [173] и головного мозга [174]. В связи с тем, что время полужизни экзогенной Cu/Zn-SOD в крови животных составляет всего около 6 мин, первые результаты хоть и обнадеживали исследователей, но зачастую были противоречивыми. Модификация SOD с помощью ковалентной сшивки с полиэтиленгликолем (PEG) увеличивала период полураспада до 25–36 ч [175]. PEG-модифицированные Cu/Zn-SOD были успешно испытаны в экспериментальных моделях И-Р мышц [176], сердца [177], мозга [178, 179], печени [180] и почек [173]. Применение PEG-Cu/Zn-SOD существенно снижало уровень перекисного окисления липидов, способствовало сохранению нормальной морфологии тканей и функции ишемизированных органов. Аналогичные эксперименты проведены с Mn-содержащей SOD. На животной модели острого почечного поражения показана нефропротекторная активность рекомбинантной Mn-SOD человека [181]. Разработка новых подходов и способов применения SOD остается перспективным направлением для профилактики/лечения И-Р-поражений [182].

Уже в ранних работах по применению SOD в качестве антиоксидантов при И-Р-поражениях было предложено одновременно применять каталазу [183], которая нейтрализует образующийся пероксид водорода: 2Н₂О₂ → 2Н₂О + О₂ (CAT). Позднее были проведены испытания как исходных форм SOD и CAT, так и их конъюгированных и модифицированных форм, которые показали высокую эффективность химерных ферментов (SOD и CAT) [184].

Пероксиредоксины (Prdx) – сравнительно недавно открытые ферменты, относятся к эволюционно древней группе тиоредоксин-подобных пероксидаз. Для катализа Prdx используют консервативный остаток Cys в активном центре. Эффективность катализа Prdx ниже, чем у CAT или селен-содержащих GPx, однако Prdx проявляют максимальную активность при физиологически допустимых микромолярных (до 200 мкМ) концентрациях гидропероксидов, в отличие от CAT и GPx (проявляют активность в миллимолярных концентрациях, которые практически не встречаются в живой клетке) [144]. При этом Prdx обладают наиболее широкой среди всех известных пероксидаз субстратной специфичностью. Prdx способны восстанавливать различные неорганические (H₂O₂, пероксинитрит) и органические (алкилгидропероксиды, пероксиды фосфолипидов и т.д.) гидропероксиды, тем самым играя важную роль в регуляции редокс-гомеостаза клетки. Кроме пероксидазной функции, Prdx проявляют шаперонную, фосфолипазную, сигнально-регуляторную и иммуномодулирующую активность [144, 185, 186]. Учитывая вышесказанное, применение Prdx для нейтрализации окислительного стресса представляется перспективным подходом. Действительно, на животных моделях И-Р-поражения было показано, что введение пероксиредоксинов и их модифицированных форм (в том числе химерный белок, содержащий MnSOD и Prdx6) [187–189] до реперфузионного периода существенно снижает ишемическое поражение сердца [184, 185], кишечника [186, 187] и почек [190–192]. Экзогенные Prdx подавляют окислительные процессы и способствуют сохранению морфофункционального состояния ишемизированных тканей, увеличивая выживаемость экспериментальных животных. Помимо нейтрализации гидропероксидов, экзогенные Prdx вызывают индукцию экспрессии NO-синтаз в ишемизированных тканях и последующий рост уровня NO в крови, что приводит к вазодилатации сосудов, подавлению тромбообразования и быстрой нормализации микроциркуляции кровотока при И-Р [193, 194].

Активному внедрению ферментов-антиоксидантов препятствует их ограниченная биодоступность и недостаточная стабильность. Однако генно-инженерные и биохимические методы модификации белков позволяют успешно решить эти проблемы. Генно-инженерные подходы позволяют получать ферменты с PTD-пептидами (PTD – Protein Transduction Domain), которые обеспечивают их проникновение в клетки и тем самым расширяют биодоступность [195]. Конъюгирование ферментов с полиэтиленгликолем или сахарами (галактозой или маннозой) позволяет существенно повысить устойчивость к действию протеаз и в несколько раз увеличить время их действия в организме [171, 192]. Инкапсуляция ферментов в наночастицы, гидрогели или липосомы позволяет защитить их от действия протеаз и увеличить время полужизни белков [196, 197]. Помимо инкапсуляции, эффективным способом доставки ферментов-антиоксидантов является их сорбция на поверхности наночастиц, которые сами могут обладать антиоксидантным потенциалом (наночастицы оксида/фторида церия, селена и т.д.), что может оказывать синергичный эффект [198]. Иммобилизация ферментов-антиоксидантов на суперпарамагнитных наночастицах оксида железа (SPION) позволяет значительно повысить эффективность их терапевтического действия при последующем их введении в организм и удержании с помощью внешнего магнитного поля в зоне ишемического поражения, [199].