Молекулярная биология, 2023, T. 57, № 6, стр. 1006-1016

ВВЕДЕНИЕ

Воспаление – это реакция иммунной системы на такие факторы, как патогены, поврежденные клетки, токсические соединения или ионизирующее излучение [1]. Реакция организма при этом направлена на удаление повреждающих раздражителей и инициирование процесса заживления [2]. Таким образом, воспаление является защитным механизмом, жизненно важным для млекопитающих [3]. Последние 15 лет мы изучали противовоспалительную эффективность гормонов тимуса (тимулина и тимопентина) в условиях in vitro и in vivo [4–15]. Выбор этого направления исследований вызван пониманием особой роли тимуса в функционировании иммунной системы. Известно, что тимус подвергается возрастной инволюции [16], которая может ускоряться при воздействии на организм повреждающих факторов. При этом ускоренная инволюция тимуса проявляется как побочный эффект, вызываемый применением ряда лекарственных средств при таких тяжелых заболеваниях, как туберкулез, онкологические заболевания и др. [17]. Инволюция тимуса может снизить способность организма восстанавливать репертуар периферических Т-клеток и реагировать на новые антигены. В настоящее время отсутствуют доступные методы лечения острой атрофии тимуса, которая приводит к нарушению работы иммунной системы во время острых стрессовых событий [18]. Известно, что множество факторов, включая инфекции, яды, ионизирующую радиацию и др., приводят к острой атрофии ткани тимуса. Важно отметить, что, согласно существующим представлениям, к острой инволюции тимуса приводят все физиологические стрессовые факторы, включая недостаточное питание [19].

Для предупреждения перехода острого воспаления в хроническое воспалительные реакции должны быть подавлены, чтобы предотвратить дополнительное повреждение тканей. Снижение уровня воспаления – это хорошо управляемый процесс, включающий контролируемую продукцию медиаторов в пространстве и во времени, при котором градиенты хемокинов, цитокинов и активных форм кислорода (АФК) “разбавляются” с течением времени [20]. Циркулирующие лейкоциты постепенно перестают ощущать эти изменения и не рекрутируются к местам повреждения. Дисрегуляция этого процесса может привести к неконтролируемому хроническому воспалению [21]. Процессы разрешения воспаления, которые восстанавливают гомеостаз тканей, включают уменьшение или прекращение инфильтрации тканей нейтрофилами и апоптоз отработанных нейтрофилов, контррегуляцию хемокинов и цитокинов, трансформацию макрофагов из классических в альтернативно активированные и инициацию исцеления [22, 23].

Ранее мы доказали противовоспалительное действие тимусных гормонов тимулина и тимопентина не только на модели сепсиса у мышей [4–6], но и при состоянии, моделирующем рассеянный склероз [7, 8]. Опубликованы данные, указывающие на вероятную противовоспалительную эффективность другого гормона тимуса, тимозина 1α (Tα1) [26, 27]. Установлено, что Tα1 является мощным модулятором иммунитета и воспаления. В совокупности результаты этих исследований подтверждают внутритимусную роль гормона лептина в поддержании здорового эпителия тимуса и стимуляцию тимопоэза, которая проявляется при нарушении гомеостаза тимуса эндотоксемией [1]. Кроме того, установлена определенная связь между продолжительностью жизни долгожителей, состоянием системы иммуносенесценции и уровнем Tα1 [19, 28, 29]. Tα1 – 28-аминокислотный белок, обладающий иммуномодулирующими функциями, оказывает благоприятное воздействие при инфекционных и онкологических заболеваниях, иммунодефицитных состояниях, а также обладает нейропротекторным действием [30].

С учетом этих сведений цель настоящей работы состояла в изучении эффектов Тα1 на провоспалительную активацию альвеолярных макрофагов RAW264.7, культивируемых в присутствии липополисахарида (ЛПС) из стенок грамотрицательных бактерий. Оценена продукция провоспалительных цитокинов, а также изучено состояние сигнальных путей NF-κB и SAPK/JNK. Кроме того, определен уровень экспрессии ряда генов, регулирующих уровни апоптоза клеток, а также активность рецептора TLR4, принимающего участие в провоспалительном ответе.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Культивирование клеток RAW 264.7. Клетки макрофагальной линии RAW264.7 культивировали в присутствии индуктора воспаления и Tα1. Клетки RAW 264.7 росли в культуральных флаконах в среде, состоящей из смеси RPMI: DMEM (“ПанЭко”, Россия) в соотношении 1 : 1 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и смеси антибиотиков (пенициллин – 100 мкг/мл, стрептомицин – 100 мкг/мл, гентамицин – 50 мкг/мл), при 37°C и 5% СО₂. Пересев (пассаж) клеток производили после достижения плотности монослоя ~80%. В экспериментах использовали клетки после 4–8 пассажей. После каждого пассажа жизнеспособность RAW 264.7 оценивали визуально с использованием инвертированного микроскопа LEICA DMIL HC (“Leica”, Германия), а также путем подсчета живых клеток в камере Горяева при окрашивании суспензии RAW 264.7 0.01%-ным раствором трипанового синего (“AppliChem”, Германия) в физиологическом растворе (NaCl 0.9%). Количество выживших макрофагальных клеток составляло 93–97%. Провоспалительные ответы индуцировали ЛПС, выделенным из стенок Escherichia coli штамм 0128: B12 (“Sigma”, США), в концентрации 1 мкг/мл. Экзогенный Tα1 (“Sigma”) добавляли в концентрации 10 нг/мл одновременно с индукцией провоспалительных ответов. Для определения продукции цитокинов клетки снимали с поверхности культурального флакона с помощью скребков (“Corning”, США), отмывали от старой среды, разводили в свежей среде и рассевали с плотностью 10⁶ клеток в 1 мл в 24-луночные планшеты. Через 24 ч в каждую лунку добавляли исследуемые вещества в заданной концентрации. По окончании 72-часовой инкубации клетки лизировали 3 раза замораживанием–оттаиванием, при этом лизаты использовали немедленно либо хранили при –20°С. Для определения продукции сигнальных и стрессовых белков клетки рассевали в культуральные флаконы с плотностью 100 × 10⁶ клеток на флакон. После прикрепления клеток (24 ч) добавляли исследуемые вещества по приведенной выше схеме и инкубировали в течение 6 ч. Далее клетки снимали с поверхности флакона, отмывали от старой среды и разводили в 1 мл физиологического раствора для дальнейшего выделения белков. В пределах каждого независимого эксперимента характеристики образцов измеряли параллельно в 6–9 повторах и определяли среднее значение. Усредненные по четырем экспериментам значения использовали для определения статистической значимости различий между группами (n = 4). В качестве контроля использовали клетки, не подвергавшиеся обработке ЛПС.

Тест на жизнеспособность. Клетки RAW 264.7 культивировали в 96-луночных планшетах (“TPP”, Швейцария) по 100 мкл (2 × 10⁴ клеток) на лунку в среде RPMI 1640 (“ПанЭко”), содержащей 10% ЭТС, 2.04 мМ L-глутамина (“ПанЭко”), 100 мкг/мл стрептомицина, при 37°С в атмосфере 5% CO₂. После культивирования в течение 24 ч к монослою клеток RAW 264.7 добавляли либо ЛПС (1 мкг/мл), либо Tα1 (10 нг/мл), либо ЛПС + Tα1 в указанных концентрациях, культивировали в течение еще 24 ч, промывали 3 раза PBS и окрашивали в течение 10 мин 0.05%-ным фиолетовым кристаллом (“Sigma”). Лунки тщательно промывали проточной дистиллированной водой, в каждую лунку добавляли по 100 мкл 1%‑ного додецилсульфата натрия. Через 10 мин после этого измеряли оптическую плотность при 546 нм на спектрофотометре для планшетов Titertek Multiscan MCC/340 (“Flow Laboratories”, Финляндия).

Определение уровня окислительного стресса в клетках. Уровень окислительного стресса в клетках измеряли с помощью диацетилового производного 5.6-карбокси-2',7'-дихлордигидрофлуоресцеина (карбокси-H2DCFDA) (“Invitrogen”, США). Карбокси-H2DCFDA представляет собой химически восстановленный аналог флуоресцеина, используемый в качестве общего индикатора окислительного стресса в клетках. Эта нефлуоресцентная молекула легко превращается в зеленую флуоресцентную форму (карбокси-DCF), так как при окислении внутри клетки ацетатные группы удаляются внутриклеточными эстеразами. Следует отметить, что DCFH (и карбокси-H2DCFDA) не реагируют с супероксидом, пероксидом водорода или оксидом азота. Соотношение DCFH/карбокси-H2DCFDA в значительной степени отражает катализируемое пероксидазой окисление. Клетки RAW 264.7 предварительно культивировали в течение 24 ч в 96-луночном планшете (2.5 × 10⁴ клеток на лунку) в 100 мкл среды DMEM, промывали PBS и обрабатывали свежеприготовленным раствором карбокси-H2DCFDA (“Invitrogen”) в стерильном ДМСО в конечной концентрации 2.5 мкМ в среде с 2% ЭТС. Клетки инкубировали с карбокси-H2DCFDA в темноте в течение 1 ч. Одновременно с добавлением карбокси-H2DCFDA добавляли ЛПС (1 мкг/мл), Tα1 (10 нг/мл). Сигнал флуоресценции от необработанных клеток RAW 264.7 использовали в качестве контроля. Фоновый сигнал культуральной среды DMEM вычитали из соответствующих сигналов экспериментальных образцов. Флуоресценцию измеряли с помощью флуоресцентного планшетного ридера Infinite 200 (“Tecan”, Австрия) при длине волны возбуждения 480 нм и длине волны поглощения 530 нм (Ex/Em = = 485/535 нм). Выполняли три независимых эксперимента (по три повтора на каждую экспериментальную группу (n = 9)).

Определение продукции цитокинов. TNF, IL-10 и IL-1β, IL-6 мыши определяли с использованием набора для ИФА (“PeproTech”, США). Связывание визуализировали с использованием 100 мкл зеленого красителя ABTS (“Sigma”), растворенного в 0.05 М цитратного буфера (pH 5.0) с добавлением 0.01% пероксида водорода, и измеряли оптическую плотность при 405 нм с помощью спектрофотометра для микропланшетов (Мультискан EX; “Thermo Electron Corp.”, США).

Гель-электрофорез в денатурирующих условиях и иммуноблотинг. Для приготовления белковых образцов суспензию клеток RAW 264.7, предварительно отмытую от среды культивирования с помощью 0.9%-ного NaCl, трехкратно замораживали–оттаивали. После этого добавляли ингибиторы протеаз и фосфатаз (Protease and phosphatase inhibitor cocktail 100 xl; “Thermo Scientific”). К приготовленным таким способом пробам добавляли солюбилизирующий буфер для электрофореза, β-меркаптоэтанол (2–5%) и кипятили в течение 5 мин. Концентрацию белка измеряли с помощью NanoDrop2000c (“NanoDrop”, США), по 10 мкл образца вносили в каждую лунку 10%-ного денатурирующего полиакриламидного геля (Ds-Na-ПААГ). Наличие белков в образцах определяли с помощью Вестерн-блот-анализа с использованием наборов антител: антител кролика к ph-NF-κB (Ser536), p53, ph-SAPK/JNK, NRF-2, TLR4, α-β-тубулину (“Cell Signaling”, США). Белки выявляли с использованием системы ECL (“GE Healthcare”, Швеция). Фотографии полос получены с помощью трансиллюминатора TFX 35.WL (“Vilber Lourmat”, Франция). Количественное содержание белков определяли после денситометрирования с использованием программы Qapa (Ver. 3.7). Проведено по три независимых эксперимента (использовали клетки разных пассажей) для каждого белка. Полученные цифровые данные нормировали по значениям в соответствующем контроле (полосы α-β-тубулина) и выражали в относительных единицах.

Оценка изменений экспрессии генов. Экспрессию генов анализировали в клетках RAW 264.7 методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ). В среду культивирования клеток добавляли Tα1 (10 нг/мл) или ЛПС (1 мкг/мл) по отдельности или совместно, инкубировали в течение 6 ч и определяли экспрессию генов, связанных с апоптозом (P53), кодирующих факторы транскрипции (NF-κB, Ap-1, NRF-2), рецептор TLR4, цитокины TNF, IL-6, а также iNos.

Процедура выделения суммарной РНК, синтез кДНК и проведение ПЦР-РВ подробно описаны нами ранее [31]. РНК из клеток RAW 264.7 выделяли с использованием реагента RNAextract согласно инструкции производителя (“Евроген”, Россия). Суммарную РНК обрабатывали ДНКазой I (“New England Biolabs”, США) для удаления возможных примесей геномной ДНК. Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически (NanoDrop1000с, США) по поглощению при 260 нм. Целостность РНК оценивали с помощью электрофореза в 2%-ном агарозном геле в присутствии бромида этидия (1 мкг/мл) по наличию полос рРНК (18S и 28S). Полученную РНК (2 мкг на реакцию) использовали в реакции обратной транскрипции с использованием набора MMLV RT kit (“Евроген”). Синтезированную кДНК использовали в ПЦР-РВ c ген-специфическими олигонуклеотидами (табл. 1) и набором 5× qPCRmix-HS (“Евроген”) в амплификаторе DTpr-ime (“ДНК-технология”, Россия), Режим ПЦР-РВ: (1) “горячий старт” – 95°С, 3 мин; (2) денатурация – 95°С, 15 с; (3) отжиг праймеров и синтез цепи – 60°С, 20 с + регистрация флуоресценции. Этапы 2 и 3 повторяли 40 раз. Изменения уровней экспрессии генов представлены в относительных единицах от значений в контроле для интактных клеток [31].

Уровень экспрессии генов нормировали по уровню гена цитоскелетного β-актина (ген Actb домашнего хозяйства). Значение ΔCt рассчитывали по формуле ΔCt = Ct (исследуемый ген) – Ct (Actb); ΔΔCt рассчитывали по формуле ΔCt (контроль) × × ΔCt(эксперимент). Различия в экспрессии генов рассчитывали с использованием метода 2^ – ΔΔCt.

Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения Statistica 6.0 (StatSoft, США). Статистическую значимость различий определяли с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с апостериорным критерием Тьюки. Значимыми считали различия при p <0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Продукция цитокинов и активных форм кислорода в альвеолярных макрофагах RAW 264.7, культивируемых в присутствии липополисахарида и тимозина-1α

Продукция нескольких провоспалительных цитокинов (TNF, IL-6, IL-1β) и противовоспалительного цитокина IL-10 была измерена методом иммуноферментного анализа (ИФА). Важно, что внесение в среду культивирования клеток RAW 264.7 ЛПС стимулировало продукцию всех исследованных цитокинов, при этом добавление Тα1 в разной степени нормализовало продукцию цитокинов. Особенно заметный эффект отмечен в случае IL-1β и IL-6 (рис. 1а). Однако добавление Тα1 не снижало продукцию TNF в макрофагах, активированных ЛПС.

Рис. 1.

Влияние тимозина-1альфа на продукцию цитокинов (а), продукцию АФК, оцениваемую по флуоресценции зонда (б), и количество живых клеток RAW 264.7 (в). Статистически значимые отличия от группы ЛПС: *p <0.05, **p < 0.01. n = 3–4.

Известно, что при воздействии ЛПС в клетке может возрастать продукция АФК. Действительно, с использованием флуоресцентного карбокси-H2DCFDA-зонда нами показано, что добавление ЛПС приводит к повышению в несколько раз количества АФК, продуцируемого в клетках RAW 264.7, причем добавление Тα1 полностью снимает этот эффект (рис. 1б). При этом добавление к клеткам только Тα1 не влияло на уровень АФК.

Интересно, что определение количества жизнеспособных макрофагов RAW 264.7 показало, что и ЛПС, и Тα1 стимулируют жизнеспособность клеток, причем эти эффекты были аддитивными (рис. 1в). Это важное наблюдение свидетельствует о том, что концентрация Тα1, равная 10 нг/мл и заметно превышающая концентрацию в контрольных клетках, не является токсичной.

Продукция белков, регулирующих активность сигнальных каскадов и TLR4, апоптоз клеток RAW 264.7

Известно, что сигнальный каскад NF-κB является основным регулятором активности клеток в присутствии повреждающих агентов. Определение уровня белка р65 NF-κB показало, что добавление ЛПС заметно увеличивает количество этого белка, тогда как добавление в среду культивирования клеток Тα1 полностью снимает эффект ЛПС. Таким образом, нами доказано, что Тα1 защищает клетки от действия эндотоксина. Рассмотрение активности другого каскада сигнальной трансдукции, SAPK/JNK, показало, что под влиянием ЛПС в клетках усиливается накопление фосфорилированных форм р46 и р54, а добавление Тα1 устраняет вызванную ЛПС функциональную активацию этих белков в клетке (рис. 2). Это свидетельствует о защитном потенциале Тα1, который отменял повреждающий эффект ЛПС, вызывающий активацию каскада SAPK/JNK.

Рис. 2.

Вестерн-блот-анализ белков (TLR4, NF-κB и SAPK/JNK, NRF-2, p53) в клетках RAW 264.7, культивируемых в разных условиях. Представлены результаты типичного эксперимента. Под иммуноблотами указано содержание белков (в относительных единицах), рассчитанное по усредненным результатам денситометрического определения в трех независимых экспериментах. Статистически значимые отличия от величин в клетках, инкубированных с добавлением ЛПС: **р < 0.01, *p < 0.05. Содержание phNF-κB (Ser276) определяли с использованием антител к субъединице p65.

Тоll-подобные рецепторы (TLR) участвуют в передаче сигналов, активирующих каскад сигнальной трансдукции NF-κB. Самым изученным рецептором этого класса является трансмембранный рецептор TLR4. Нами показано, что культивирование клеток RAW 264.7 в присутствии ЛПС приводит к статистически значимому увеличению количества TLR4, тогда как добавление Тα1 полностью отменяет действие ЛПС (рис. 2).

На рис. 2 показаны также результаты определения количества белка NRF-2, который регулирует антиоксидантный ответ клеток. В присутствии ЛПС наблюдалось снижение уровня белка NRF-2, тогда как добавление Тα1 к среде культивирования клеток RAW 264.7 повышало уровень белка NRF-2 до значений, превышающих контрольный уровень.

Наконец, методом Вестерн-блотинга проанализировано изменение содержания белка р53, который участвует в регуляции уровня апоптоза в клетках. Установлено, что добавление ЛПС приводит к увеличению содержания р53, что указывает на индукцию апоптоза в клетках RAW 264.7 в присутствии эндотоксина. Если же к клеткам добавляли Тα1, то наблюдали снижение уровня белка р53, что указывает на возможность изменения уровня апоптоза (рис. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Эффективность Tα1 в качестве противовоспалительного агента изучена нами на альвеолярных макрофагах RAW 264.7, которые подвергали воздействию эндотоксина (ЛПС), наиболее часто используемого для моделирования воспаления. Анализировали такие функции клеток, как продукция про- и противовоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-10), образование АФК, активность сигнальных каскадов NF-κB и SAPK/JNK, продукция NRF-2, TLR4, р53, а также активность ряда генов, регулирующих синтез этих ключевых агентов.

Ранее, используя макрофаги RAW 264.7, мы показали, что и другие пептиды тимуса (тимулин и тимопентин) проявляют противовоспалительный эффект в клетках, обработанных ЛПС [6]. Оба пептида снижали секрецию провоспалительных цитокинов в макрофагах RAW 264.7, культивированных с ЛПС, и эти эффекты блокировались ингибиторами каскадов NF-κB и стресс-активируемой протеинкиназы SAPK/JNK, а также, в меньшей степени, ингибитором TLR4.

В макрофагах RAW 264.7, стимулированных бактериальным ЛПС, сами пептиды не влияли на секрецию цитокинов, но значительно усиливали эффекты каждого из ингибиторов. Тимопентин повышал активацию каскадов NF-κB и SAPK/JNK в нестимулированных макрофагах, в то время как тимулин значительно снижал активацию каскада SAPK/JNK, но не NF-κB, в макрофагах, стимулированных ЛПС. Тимулин и тимопентин увеличивали продукцию белка теплового шока HSP72 и в стимулированных, и в нестимулированных ЛПС клетках [6].

Возможность применения гормонов тимуса (тимулина и тимопентина) в качестве противовоспалительных агентов была подтверждена нами ранее [4–6]. В настоящей работе мы анализировали противовоспалительную эффективность Tα1. Можно было предположить, что Tα1 способен компенсировать состояние хронического воспаления, вызванного эндотоксином. В реальности для понимания механизма действия гормонов тимуса полезно учитывать роль возрастной инволюции тимуса и недостаток секреции гормонов тимуса для процессов старения и, особенно, “воспалительного старения”.

Еще два века назад средняя продолжительность жизни человека даже в самых развитых странах не превышала 40–45 лет, хотя и тогда были долгожители. Однако улучшение условий жизни и достижения медицины привели к росту продолжительности жизни, а, следовательно, к старению значительной части населения [32].

Иммунная система человека вынуждена справляться с эволюционно непредсказуемым воздействием различных антигенов, что лежит в основе глубоких возрастных изменений, обозначаемых как иммуносенесценция, или иммуностарение. Основные изменения, происходящие при иммуностарении, обусловлены накоплением клеточных, молекулярных дефектов и инволюционных событий (например, инволюцией тимуса), происходящих одновременно с гиперстимуляцией как врожденного, так и адаптивного иммунитета (накопление размножившихся клонов клеток памяти и эффекторных Т-клеток, сокращение репертуара Т-клеточных рецепторов, прогрессивная активация макрофагов), что приводит к вялотекущему хроническому воспалению [19].

Корреляции между хроническим воспалением и старением объясняются в рамках “сетевой теории старения”, которая рассматривает глобальное снижение способности справляться с различными стрессорами и сопутствующее прогрессирующее увеличение провоспалительного статуса в качестве основных характеристик процесса старения [3]. Эти характеристики, определяемые как “воспалительное старение”, возникают в результате антигенной нагрузки и стресса, причем согласно данным эволюционных исследований, иммунная реакция и реакция на стресс эквивалентны. Можно сослаться на особую роль макрофагов в качестве действующего агента не только в воспалительной реакции и иммунитете, но и в реакции на стресс [33]. При этом утверждается, что сохранение воспалительных стимулов с течением времени можно рассматривать как биологический фон, благоприятствующий восприимчивости к возрастным заболеваниям [33]. Наконец, дефицит устойчивых вариантов генов или наличие слабых вариантов генов необходимы, вероятно, для развития явных органоспецифических возрастных заболеваний, имеющих воспалительный патогенез, таких как атеросклероз, болезнь Альцгеймера, остеопороз и сахарный диабет. В согласии с этим феноменом объясняются несколько парадоксов здоровых долгожителей (повышение уровня воспалительных цитокинов в плазме, белков острой фазы и факторов свертывания крови). Однако согласно антагонистической плейотропной теории старения, положительные эффекты воспаления, направленные на нейтрализацию вредных агентов в раннем и во взрослом возрасте, становятся пагубными в конце жизни, в период, в значительной степени не предвиденный эволюцией [33].

Более того, изучение молекулярных механизмов, связанных со старением тимуса, показало необходимость учета биологических переменных, таких как пол и особенности питания, при изучении роли генов, участвующих в молекулярных процессах, ответственных за инволюцию тимуса [34]. Использование модельных организмов облегчает проверку различных гипотез о роли генетики в иммунных реакциях. Используя несколько полученных из природной популяции линий Drosophila melanogaster с хромосомными заменами [35], обнаружили значительную генетическую изменчивость иммунного ответа мух разных линий на E. coli, демонстрирующую улучшение, отсутствие изменений или их снижение с возрастом. В целом, эти данные предполагают, что разные локусы вносят вклад в вариации иммунных ответов в каждом возрасте, что согласуется с моделью накопления мутаций при старении. Ранее было установлено, что в зрелых макрофагах Tα1 осуществляет интернализацию и уничтожение патогенов посредством стимуляции фагоцитоза, опосредованного рецептором комплемента [36]. Эти наблюдения подтверждают, что Tα1 является ранним и мощным активатором врожденного иммунитета, а также свидетельствуют в пользу концепции его плейотропности.

Важная роль при старении принадлежит не только цитокинам, но также окислительному стрессу, при этом транскрипционный фактор NRF-2 является одной из основных антиоксидантных систем [30, 37, 38]. В нашей работе показано, что добавление ЛПС к клеткам приводит к значительному снижению содержания белка NRF-2, при этом добавление Tα1 к культивированным макрофагам полностью снимает этот эффект. Более того, Tα1 стимулирует экспрессию гена Nrf-2.

Семейство димерных транскрипционных комплексов AP-1 участвует практически во всех клеточных и физиологических функциях. До недавнего времени оставалось неясным, каким образом AP-1 контролирует транскрипцию генов. Однако появление новых технологий, позволяющих изучать факторы транскрипции в масштабах всего генома, изменило взгляд на механистическое действие АР-1. Есть основание полагать, что AP-1 может действовать как локальный переключатель транскрипции, действующий вблизи сайтов начала транскрипции [39]. Все указывает на то, что AP-1 в основном действует как дистанционная команда, определяя динамику архитектуры хроматина [40]. В нашей работе доказано, что увеличение экспрессии гена Aр-1 под влиянием ЛПС в значительной мере редуцировалось при использовании Tα1.

При подборе подходящей дозы Tα1, добавляемой к клеткам, мы опирались на данные, согласно которым концентрация Tα1 в крови человека составляет 0.1–1 нг/мл [41]. Мы испробовали две терапевтические дозы Tα1 in situ: 10 и 50 нг/мл. Анализ предварительных данных показал, что эффект Tα1 почти не зависит от используемой дозы, поэтому была выбрана доза 10 нг/мл, чтобы исключить возможный токсический эффект Tα1.

Известно, что стрессовые агенты повышают активность сигнальных каскадов NF-κB и SAPK/JNK. Действительно, нами показано, что добавление ЛПС к клеткам RAW 264.7 приводит к увеличению количества регуляторных белков, однако эта активация снималась в присутствии Tα1.

Таким образом, изучение эффектов Tα1 на стрессированные макрофаги RAW 264.7 в присутствии ЛПС показало, что Tα1защищает клетки от воздействия эндотоксина, почти во всех случаях нормализуя уровни изучаемых белков и экспрессию генов. Такое свойство тимусного пептида Tα1 делает его возможным претендентом на роль иммунотерапевтического средства, которое может использоваться для снижения патологических признаков, связанных не только с развитием вирусных и онкологических заболеваний, но и со старением.

Работа поддержана грантом Российского научного фонда (проект 23-24-00041).

Настоящая работа выполнена без привлечения людей и животных в качестве объектов исследования

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.