Российские нанотехнологии, 2020, T. 15, № 2, стр. 231-237

ВВЕДЕНИЕ

Целый ряд растительных алкалоидов обладает высоким терапевтическим потенциалом и широкими перспективами применения в медицине. К таким соединениям относится бензофенантридиновый алкалоид сангвинарин, который наряду с другими бензофенантридиновыми алкалоидами (хелеритрином, сангвилютином, хелилютином, сангвирубином, хелирубином) и двумя протопиновыми алкалоидами (протопин и аллокриптопин) содержится в растениях семейства Papaveraceae (маковых) – Sanguinaria canadensis, Macleya cordata, Macleaya macrocarpa и Chelidonium majus [1]. Сангвинарин относится к хорошо изученным алкалоидам и отличается довольно высоким содержанием (30.4%) в сангвинарии канадской (Sanguinaria canadensis) по сравнению с другими алкалоидами – хелеритрином (18.8%), сангвилютином (12%), хелилютином (11.3%), хелирубином (9.5%), а также протопином (9.5%), аллокриптопином (8.4%) и сангвирубином (до 1.2%) [2]. У растений Macleaya macrocarpa 12-летнего возраста содержание бензофенантрединовых алкалоидов до 14 раз выше по сравнению с молодыми растениями возраста 2 года [3].

Несмотря на высокий терапевтический потенциал, сангвинарин отличается довольно низкой растворимостью в биологических жидкостях и способностью вызывать некоторые побочные эффекты в результате интеркаляции между парами оснований ДНК [4] с последующим ее разрушением [5]. Повысить эффективность терапевтического действия сангвинарина и снизить побочные эффекты можно путем его включения в состав липосомных наночастиц. Липосомы представляют собой липидные везикулы с бислойной мембраной, состоящей из фосфолипидов [6, 7]. Впервые потенциал липосом в качестве транспортного средства для доставки ферментов, противоопухолевых и антимикробных агентов был продемонстрирован в [8–10]. В последующие годы технологии получения и применения наноносителей для транспорта терапевтических агентов активно развивались [11].

Одним из наиболее перспективных путей повышения эффективности терапевтического действия противоопухолевых лекарственных препаратов является применение рН-чувствительных липосом. Известно, что pH опухолевой стромы отличается от нормальных тканей более кислым значением [12]. В связи с этим рН-чувствительные липосомы конструируют из рН-чувствительных компонентов таким образом, что когда липосомы оказываются в кислом окружении опухолевых клеток или эндосомном компартменте, их содержимое высвобождается и оказывает терапевтический эффект. К преимуществам применения липосомного препарата также относится его избирательное проникновение через опухолевые сосуды и капилляры, имеющие обширные разрывы базальной мембраны и участки, лишенные эндотелиальной выстилки [13].

В настоящее время в научной литературе представлены довольно обширные сведения, касающиеся антимикробной и противоопухолевой активности свободного сангвинарина [14–17], в то время как биологическая активность липосомного сангвинарина изучена недостаточно. В связи с этим в данной работе получены рН-чувствительные липосомы с сангвинарином и исследованы их антипролиферативная активность и апоптотическое действие на опухолевые клетки предстательной железы. Клетки рака предстательной железы образуются в результате трансформации нормальных андрогензависимых клеток предстательной железы, однако в процессе злокачественного перерождения часть из этих клеток выходит из-под контроля гормональной системы организма. К моменту диагностики у пациента с раком предстательной железы опухоль чаще всего является метастазирующей и гетерогенной по клеточной популяции [18]. Она включает в себя андрогензависимые клетки, требующие для развития андрогенной стимуляции и погибающие в ее отсутствие, андрогенчувствительные клетки, не погибающие при отсутствии андрогенов, а также андрогеннезависимые клетки, не требующие для роста присутствия андрогенов [19]. При удалении андрогенов из среды или проведении антиандрогенной терапии андрогенчувствительные клетки погибают в результате индукции апоптоза, тогда как андрогеннезависимые клетки обходят механизмы апоптоза и не реагируют на отсутствие андрогенов, продолжая активно пролиферировать, обеспечивая прогрессию опухоли. Поиск путей элиминирования этой клеточной популяции является одной из важнейших задач противоопухолевой терапии. Опухолевые клетки нечувствительной к действию гормонов популяции являются наиболее опасными, именно их пролиферативная и инвазивная активность чаще всего приводит к смерти пациентов, страдающих раком предстательной железы [20]. Ранее было показано, что свободный сангвинарин вызывает арест клеточного цикла и апоптоз клеток карциномы предстательной железы человека путем воздействия на циклинзависимые протеинкиназы [19]. Применение сангвинарина в липосомной форме позволит расширить спектр терапевтических средств, действующих как на гормончувствительные, так и на гормонрезистентные опухоли.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали сангвинарин, холестерин, HEPES, дигидроортофосфат аммония NH₄H₂PO₄, фосфатно-солевой буфер, сефарозу CL-4B (Merck), лецитин (AppliChem). Остальные реагенты имели квалификацию ч.д.а.

Липосомы получали модифицированным методом дистанционной загрузки с использованием дигидрофосфата аммония [21]. Пустые липосомы получали методом гидратации тонкослойной пленки буфером с последующей обработкой дисперсии ультразвуком. Для получения тонкослойной липидной пленки смесь лецитина и холестерина (массовое соотношение 5:1) в этаноле упаривали на роторном испарителе при 30°С. Липосомную дисперсию получали путем добавления к липидной пленке 0.4 М раствора NH₄H₂PO₄ (гидратирующий, или внутренний буфер, рН 4.4) и обработки ультразвуком в течение 5 мин с помощью ультразвукового дезинтегратора “Misonix sonicator S-4000” при амплитуде 60%. После фильтрации на фильтре с размером пор 0.45 мкм липосомный препарат подвергали 15-кратной экструзии через поликарбонатную мембрану с размером пор 100 нм с помощью экструдера Avanti Mini-Extruder (Avanti Polar Lipids, Inc., США).

Для установления трансмембранного градиента рН липосомную дисперсию пропускали через колонку с сефарозой CL-4B, уравновешенную буферным раствором (наружный буфер), содержащим 20 мM HEPES (pH 7.4) и 150 мМ NaCl. К препарату пустых липосом добавляли необходимое количество 10 мМ раствора сангвинарина в диметилсульфоксиде. Загрузку липосом сангвинарином продолжали в течение 1 ч при при 40°С.

Очистку липосомной дисперсии от невключившегося сангвинарина проводили на колонке с сефарозой CL-4B, уравновешенной буферным раствором, содержащим 20 мM HEPES (pH 7.4) и 150 мМ NaCl. Элюирование препарата липосом проводили при скорости потока 1 мл/мин под контролем УФ-детектора при λ = 275 нм. Фракции, содержащие липосомный препарат, объединяли и использовали в дальнейших экспериментах.

Для определения эффективности включения сангвинарина в липосомы к 100 мкл препарата липосом после диализа добавляли 200 мкл метанола, перемешивали и подвергали обработке ультразвуком в течение 5 мин. Затем образец центрифугировали и отбирали 100 мкл супернатанта для анализа с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), проводимого с использованием хроматографа Agilent Technologies 1260 Infinity (США) на обращеннофазовой колонке С18. В работе использовали линейный градиент подвижной фазы, создаваемый элюентом А (0.1% раствор трифторуксусной кислоты (ТФУ) в воде) и элюентом В (0.1% раствор ТФУ в ацетонитриле). Детектирование сангвинарина осуществляли при длине волны 275 нм. Хроматографию образцов проводили в линейном градиенте концентрации элюента В от 0 до 100% при скорости потока 1.0 мл/мин; время анализа составляло 20 мин для каждой пробы. С помощью стандартного образца сангвинарина строили калибровочный график, по которому определяли концентрацию сангвинарина в пробах. Эффективность включения сангвинарина в липосомы (E) рассчитывали по формуле

Форму и размеры липосомных частиц оценивали с помощью сканирующего электронного микроскопа JEOL JSM–6490LV (Япония). Исследуемые пробы покрывали 20 нм (40 с при 40 мА) слоем платины в автоматическом коутере JEOL JFC–1600.

Размеры и дзета-потенциал частиц определяли методом динамического рассеяния света, или фотонной корреляционной спектроскопии на анализаторе Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd, Великобритания).

Изучение динамики высвобождения сангвинарина из липосом проводили с помощью модифицированного метода [22]. Препарат липосом (40 мл) в диализном мешке помещали в термостатируемый шейкер и диализировали при 37°С в течение 24 ч при постоянном перемешивании (50 об./мин) против буферного раствора, содержащего 20 мМ HEPES (высвобождение оценивали параллельно при трех значениях pH – 7.4, 6.5 и 5.5), 150 мМ NaCl, 2% метанол. Образцы отбирали для анализа через определенные промежутки времени, добавляя к исходному диализному раствору тот же объем свежего буфера. Содержание сангвинарина в диализате определяли с помощью обращеннофазовой ВЭЖХ. Все данные приведены как средние значения трех экспериментов.

Цитотоксическую активность (ЦТА) липосомного сангвинарина in vitro исследовали в отношении опухолевых клеток трех линий карцином предстательной железы человека – LNCaP (ATCC® CRL-1740™), DU 145 (ATCC® HTB-81™) и PC-3 (ATCC® CRL-1435™). Клетки исследуемых линий выращивали в пластиковых флаконах (Costar) в среде RPMI-1640 (Sigma) с добавлением 10%-ной фетальной бычьей сыворотки и 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma) в атмосфере 5%-ного CO₂ при 37°C. За 1 сут до эксперимента клетки рассевали в 96-луночные планшеты для микротитрования в среде для культивирования в плотности 5000–7000 клеток в лунке. Инкубировали клетки с растворами исследуемых препаратов в различных концентрациях в стандартных условиях 72 ч, после чего определяли выживаемость клеток с помощью МТТ-теста [23]. Цитотоксическую активность препарата выражали в единицах IC₅₀ (молярная концентрация препарата, вызывающая гибель 50% клеток).

Для количественной оценки уровня апоптоза опухолевых клеток клетки наращивали в 100 мм чашках Петри до плотности 1 · 10⁶ на чашку и инкубировали с липосомным сангвинарином в различных концентрациях в течение 24 ч. Затем клетки обрабатывали трипсином, отмывали фосфатно-солевым буфером и обрабатывали флуоресцентно меченным нуклеотидом dUTP и пропидиум иодидом с использованием набора “Apo-direct apoptosis kit” (Thermo Fisher Scientific) согласно протоколу производителя. Флуоресцентно меченные клетки анализировали с помощью проточной цитометрии (цитометр EPICS-XL, Beckman Coulter).

Статистическую обработку результатов осуществляли в программе Microcal Origin 8.0 (OriginLab Corporation). Все данные в таблицах и рисунках представлены как средние арифметические значения (M) и стандартные отклонения (±SD). Для выявления статистической значимости различий применяли однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA); различия считали достоверными при значениях р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние внутрилипосомной концентрации дигидроортофосфата аммония на эффективность загрузки сангвинарином. Одним из важных факторов, влияющих на эффективность включения сангвинарина в рН-чувствительные липосомы, является внутрилипосомная концентрация NH₄H₂PO₄. Для дистанционной загрузки использовали пустые липосомы с внутренними концентрациями NH₄H₂PO₄ от 0.1 до 0.5 М с шагом 0.1 М. В качестве контроля использовали липосомы с внутренним буфером 20 мМ HEPES, рН 7.4.

Как видно из табл. 1, эффективность инкапсулирования сангвинарина и размер липосом прогрессивно возрастали при увеличении внутрилипосомной концентрации NH₄H₂PO₄ от 100 до 200 мМ. При дальнейшем увеличении внутрилипосомной концентрации дигидроортофосфата аммония эффективность загрузки липосом повышалась и достигала максимального значения (89.54 ± 2.18%) при концентрации NH₄H₂PO₄ 400 мМ. Размер липосом при их максимальной загрузке сангвинарином оставался относительно небольшим и составлял 112.6 ± 1.8 нм по данным метода динамического рассеяния света; дзета-потенциал был равен –13.9 ± 1.7 мВ. Данный препарат использовали в дальнейших экспериментах. Микрофотография липосомных частиц с сангвинарином, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ), приведена на рис. 1.

Рис. 1.

СЭМ-изображение липосомных частиц с сангвинарином.

Поскольку опухолевые кровеносные сосуды имеют аномальное строение и часто бывают лишены целых участков эндотелиальной выстилки и фрагментов базальной мембраны, они имеют крупные размеры пор (от 100 до 780 нм) [13]. В связи с этим липосомы размером 100–200 нм считаются оптимальными транспортными системами, способными эффективно доставлять терапевтические агенты и накапливаться в околоопухолевом пространстве путем так называемого “пассивного нацеливания”. Противоопухолевую активность полученных липосом с сангвинарином исследовали in vitro c целью определить их противоопухолевый потенциал.

Динамика высвобождения сангвинарина из липосом. Высвобождение сангвинарина из липосом изучали при значениях pH – 7.4, 6.5 и 5.5, моделирующих условия, в которых липосомы могут оказаться при их терапевтическом применении. Так, pH ~7.4 характерен для плазмы крови, лимфы и межклеточной жидкости; pH ~6.5 – для опухолевых тканей; pH ~5.5 – для внутренней среды эндосомного компартмента, где липосомы могут оказаться после их поглощения клеткой [24, 25].

Высвобождение сангвинарина из липосомного препарата носило выраженный рН-зависимый характер (рис. 2). При этом с наиболее высокой скоростью во все среды сангвинарин высвобождался в первые 10 мин; в последующий период процесс высвобождения постепенно замедлялся. После 3 ч эксперимента в наиболее кислую среду (рН 5.5) высвобождалось больше всего сангвинарина (~28%); в среду с рН 6.5 высвобождалось ~12% и наиболее низкий уровень высвобождения наблюдался в среде со слабощелочной реакцией (рН 7.4). В целом высвобождение сангвинарина из липосом в кислую среду носит пролонгированный характер. В условиях слабощелочной среды сангвинарин оказывается практически полностью “запертым” в липосомах – через 3 ч инкубации из липосомной дисперсии высвобождается лишь 2.5% сангвинарина. Такой характер высвобождения может оказаться полезным при внутривенном введении липосомного сангвинарина в качестве противоопухолевого препарата. В крови при транспортировке к опухоли-мишени значение pH слабощелочное (рН 7.4) и практически весь сангвинарин будет оставаться в составе липосом. При достижении опухоли в кислой среде, характерной для опухолевой ткани, высвобождение сангвинарина будет увеличиваться и, наконец, в кислом содержимом эндосомного компартмента (рН 5.5) захваченные опухолевыми клетками путем эндоцитоза липосомы будут наиболее активно высвобождать действующее вещество. Таким образом, разница в кислотности биологических жидкостей и внутриклеточных компартментов может служить основой для разработки эффективных стратегий применения pH-чувствительных липосом.

Рис. 2.

Высвобождение сангвинарина из липосом при различных значениях pH наружного буфера (20 мМ HEPES (pH 7.4, 6.5, 5.5), 150 мМ NaCl).

Цитотоксический и апоптотический потенциал липосомного сангвинарина. Исследование цитотоксического и апоптотического действия липосомного сангвинарина проводили на опухолевых клетках предстательной железы, чувствительных к андрогенам и обладающих умеренным метастатическим потенциалом (аденокарцинома предстательной железы человека линии LNCaP), в сравнении с гормоннезависимыми клетками с умеренным (карцинома предстательной железы человека линии DU145) и высоким (карцинома предстательной железы человека линии PC-3).

Результаты исследования ЦТА липосомного сангвинарина в отношении опухолевых клеток линий LNCaP, DU145 и PC-3 представлены на рис. 3. Липосомный сангвинарин проявлял дозозависимую ЦТА в отношении опухолевых клеток всех исследуемых линий в микромолярном диапазоне концентраций. Наиболее высокая ЦТА липосомного сангвинарина проявлялась в отношении гормончувствительных клеток линии LNCaP (IC₅₀ 2.86 мкМ). В отношении гормоннезависимых клеток линий DU145 и PC-3 цитотоксическая активность липосомного сангвинарина была несколько ниже и составляла 3.37 и 3.63 мкМ соответственно.

Рис. 3.

Цитотоксическая активность липосомного сангвинарина в отношении опухолевых клеток человека линий LNCaP, DU145 и PC-3.

Ранее было показано, что свободный сангвинарин вызывает апоптоз у опухолевых клеток [26, 27]. В настоящей работе для исследования апоптотического действия на опухолевые клетки использовали липосомную форму сангвинарина как альтернативу свободному веществу. Клетки инкубировали 24 ч в присутствии различных концентраций сангвинарина и метили нуклеотидом 2'-дезоксиуридин-5'-трифосфатом (dUTP) с помощью терминальной дезоксирибонуклеотидилтрансферазы (TDT) (осуществляет последовательное присоединение дезоксирибонуклеозидмонофосфатов из пула дезоксирибонуклеозидтрифосфатов к 3'-OH-группам молекул ДНК) и пропидиум иодида. Клетки, уровень dUTP-флуоресценции которых превышал уровень флуоресценции контрольных клеток, рассматривали как апоптотические, в табл. 2 представлено процентное содержание таких клеток от контроля.

Как видно из табл. 2, инкубация клеток с различными концентрациями липосомного сангвинарина приводит к дозозависимому увеличению опосредуемого TDT уровня включения метки dUTP в 3'-концевые разрывы цепи ДНК, что свидетельствует о дозозависимом приросте числа апоптотических клеток. При этом липосомный сангвинарин с высокой эффективностью индуцировал апоптоз как гормончувствительных, так и гормоннезависимых клеток. При концентрации в культуральной среде 8 мкМ липосомный сангвинарин индуцировал апоптоз у 93.14% клеток линии LNCaP, 90.65% клеток линии DU145 и 98.12% клеток линии PC-3.

Таким образом, липосомный сангвинарин индуцирует гибель подавляющего числа опухолевых клеток всех исследуемых линий путем индукции апоптоза. Очевидно, что липосомный сангвинарин может рассматриваться в качестве перспективного противоопухолевого агента для терапии гормонзависимых опухолей, находящихся на разных стадиях прогрессии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные с помощью метода дистанционной загрузки рН-чувствительные липосомы с сангвинарином проявляют цитотоксическую активность в отношении как чувствительных к андрогенам, так и гормоннезависимых опухолевых клеток предстательной железы. Представляет интерес исследование активности полученного препарата в отношении опухолевых клеток других типов, а также опухолей, резистентных к действию антибиотиков. Для более полного раскрытия терапевтического потенциала и рассмотрения возможности создания на основе липосомного сангвинарина противоопухолевого препарата необходимы дополнительные исследования.

Работа выполнена при поддержке проекта повышения конкурентоспособности ведущих российских университетов среди ведущих мировых научно-образовательных центров.