Российские нанотехнологии, 2020, T. 15, № 2, стр. 213-218

ВВЕДЕНИЕ

Болезнь Альцгеймера (БА) является наиболее распространенной формой нейродегенеративных заболеваний. Она характеризуется прогрессирующим расстройством памяти и речи, нарушением когнитивных функций, распадом интеллекта [1]. Установлено, что риск развития БА значительно увеличивается с возрастом [2]. Несмотря на значительные усилия, направленные на поиск препаратов, способных остановить или замедлить течение БА, до сих пор не удалось разработать эффективные методы лечения этого заболевания. Успехи современной медицины и повышение качества жизни привели к значительному увеличению средней продолжительности жизни населения в большинстве развитых стран. Это, в свою очередь, повлекло за собой рост числа случаев заболеваний у лиц пожилого возраста, в том числе увеличение заболеваемости БА. Для лечения и ухода за людьми, страдающими БА, требуются большие экономические затраты. Согласно прогнозам в ближайшие несколько десятилетий ожидаются существенное старение населения и рост числа больных БА. Таким образом, БА является не только нерешенной медико-биологической, но и важной социально-экономической проблемой современного общества [3].

Значительная часть исследований показывает, что накопление в мозге токсических интермедиатов амилоидных фибрилл является центральным звеном в патогенезе БА. Согласно современным представлениям наибольшей токсичностью обладают олигомеры амилоидного пептида β (Aβ) [4, 5]. В связи с этим перспективным подходом в терапии БА может служить поиск биологических молекул и химических соединений, взаимодействующих in vivo с Aβ и блокирующих его агрегацию [6].

Одним из факторов риска развития БА является Aβ-индуцированный окислительный стресс. Для предотвращения его негативных последствий в мозге при разработке терапии можно использовать различные антиоксиданты, к которым относятся фуллерены. Благодаря многочисленным исследованиям свойств фуллеренов и их производных в последнее время был обнаружен широкий спектр биологической активности этих веществ, которая обусловлена совокупностью физико-химических свойств этих молекул – липофильностью, электронодефицитностью и способностью генерировать синглетный кислород после облучения. Благодаря этим свойствам фуллерены могут найти применение в биологии и медицине [7]. Основная проблема изучения биологических свойств фуллеренов связана с их нерастворимостью в воде и других полярных растворителях, низкой биосовместимостью и склонностью к образованию агрегатов. Одним из способов преодоления указанных недостатков может служить функционализация молекул фуллеренов за счет присоединения химических групп (–NH2, –OH, –COOH и др.) или других молекул. Наиболее простым и освоенным методом является присоединение гидроксильных групп – гидроксилирование фуллеренов, при этом образуются фуллеренолы [7–9].

В экспериментах in vitro не всегда удается воспроизвести условия целого организма, поэтому нейродегенеративные заболевания изучаются на клеточных культурах и трансгенных животных. Одним из наиболее удобных модельных объектов для исследования механизмов, лежащих в основе развития таких заболеваний, является плодовая мушка Drosophila melanogaster. Это многоклеточный организм, представляющий промежуточную модельную систему между культурами клеток различного происхождения, одноклеточными организмами и млекопитающими. На сегодняшний день Drosophila melanogaster является наиболее изученным во всех биологических аспектах модельным объектом [10–12].

В настоящей работе исследовано влияние фуллеренола С₆₀(ОН)₃₀ на патогенез БА при моделировании его у Drosophila melanogaster.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Синтез фуллеренола С₆₀(ОН)₃₀ провели в лаборатории нейтронных физико-химических исследований НИЦ “Курчатовский институт” – ПИЯФ, новым оригинальным двухстадийным способом [13].

Для приготовления препаратов амилоидный пептид β, состоящий из 42 аминокислот (Aβ42), был разведен в натрий-фосфатном буфере (PBS), pH 7.5, в концентрации 5 мкМ. К готовому раствору добавляли фуллеренол С₆₀(OH)₃₀ в концентрации 10 мг/мл. Препараты инкубировали в течение 24 ч при температуре 37°C.

Для проведения атомно-силовой микроскопии (АСМ) на поверхность свежесколотой слюды наносили по 2 мкл образца. Образцы промывали деионизированной водой и высушивали на воздухе. Изображения получены на атомно-силовом микроскопе Solver Bio (NT-MDT) в режиме прерывистого контакта с использованием зонда NSG03 при частоте сканирования 1 Гц. В трех идентичных образцах было изучено не менее пяти областей на поверхности слюды, чтобы подтвердить однородность их структуры и определить морфологию [14].

Исследование свойств фуллеренола in vivo проводили на трансгенной линии Drosophila melanogaster, которая хорошо воспроизводит основные патологические и клинические черты БА [15]. Линия UAS-APP.Abeta42.В (Ab) содержит в геноме последовательность, кодирующую пептид Aβ42. Экспрессию трансгена проводили в нервных и фоторецепторных клетках мух в системе UAS-GAL4 с помощью активаторов транскрипции elav-GAL4 и GMR-GAL4 соответственно [16]. Далее в тексте потомки от скрещивания особей этих линий и линии Ab обозначены как elav;Ab и GMR;Ab соответственно. Все линии получены из Bloomington Drosophila Stock Center, (США). Мухи содержались при температуре 25°С и 12-часовом световом дне.

Оценку продолжительности жизни осуществляли у одновозрастных имаго. Мух содержали в пробирках с агаром по 30 особей. На агар наносили 80 мкл корма (1 г дрожжей, разведенных в 6 мл воды). В контрольных группах мух кормили дрожжами, инактивированными нагреванием до 65°C, в опытных группах в корм добавляли фуллеренол С₆₀(ОН)₃₀ в различных концентрациях (0.05, 0.5, 2.5 мг/мл). Каждые трое суток живых мух пересаживали на свежую среду с кормом и проводили подсчет умерших особей в контрольных и опытных группах. Наблюдение проводили до обнаружения последней погибшей мухи. По окончании эксперимента подсчитывали всех учтенных особей и принимали сумму за 100%. Далее строили график зависимости количества живых особей от их возраста, фиксировали показатели максимальной продолжительности жизни и 50%-ной выживаемости. В каждом эксперименте было учтено не менее 300 мух. Каждый из вариантов эксперимента повторяли трижды.

Анализ поведения Drosophila заключался в оценке уровня отрицательного геотаксиса (движения организмов, обусловленного силой земного притяжения) на 30-й день жизни мух. На высоком пластиковом флаконе делали отметку на расстоянии 4 см от дна. Мух (примерно 20 особей) помещали во флакон, осторожным постукиванием по флакону опускали мух на дно. Через 5 с фотографировали флакон и подсчитывали количество мух в верхней и нижней части флакона на фотографии. В каждом эксперименте тестировали по 300 мух. Эксперимент проводили в трех и более повторностях.

Уровень нейродегенерации оценивали на 30-й день жизни мух, анализируя парафиновые срезы глазных долей мозга мух. Оценивали дегенерацию фоторецепторных клеток. Для получения препаратов мозга мух фиксировали в 4%-ном параформальдегиде в течение 24 ч при температуре 4°С. Затем проводили обезвоживание в этаноле и метиловом эфире бензойной кислоты и заливали парафином. Полученные парафиновые срезы толщиной 6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Препараты заключали в монтирующую среду и анализировали с помощью светового микроскопа Leica DM 2500. В каждом эксперименте анализировали по шесть препаратов мозга мух. Степень нейродегенарции оценивали по соотношению площади вакуолей ко всей площади глаза в программе ImageJ.

Анализ обучаемости и среднесрочной памяти проводили классическим методом [17].

Для анализа уровня активных форм кислорода в мозге мух использовали флуоресцентный маркер H2DCF-DA (MolecularProbes/Invitrogen, Carlsbad, USA) согласно инструкции производителя.

Достоверность различий между контролем и вариантами эксперимента определяли с помощью t-критерия Стьюдента в программе Kyplot. Полученные данные сначала были проверены на нормальность распределения критерием Шапиро–Уилка. Далее анализ проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Ошибкой обозначен 95%-ный доверительный интервал. Статистические решения принимали на уровне значимости: p < 0.05 (*), p < 0.01 (**), p < 0.001 (***). При анализе обучаемости и памяти статистический анализ данных проводили в программе Statistica10, используя методы: критерий Колмогорова–Смирнова для оценки нормальности распределения; непараметрические критерии Краскела–Уоллиса, Колмогорова–Смирнова и Манна–Уитни для попарных сравнений независимых выборок; непараметрический медианный тест для попарных сравнений независимых выборок.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе работы методом АСМ было проведено исследование морфологических характеристик препарата Aβ42. В инкубированных образцах наблюдался плотный слой агрегатов разного типа (рис. 1а), что отражает разные стадии фибриллогенеза: асимметричные гранулярные частицы диаметром до 50–60 нм, короткие неразветвленные структуры длиной до 100 нм, стабильные высокоупорядоченные неразветвленные нити длиной до 300 нм и диаметром 40–50 нм (амилоидные фибриллы). В образцах также присутствовали пучки линейных фибрилл (около трех-четырех нитей), короткие фибриллярные структуры, возможно, протофибриллы,

Рис. 1.

АСМ-изображения агрегатов, образующихся при инкубации Aβ42 (а) и при совместной инкубации Aβ42 и фуллеренола С₆₀(OH)₃₀ (б).

При инкубации Aβ42 с фуллеренолом агрегация Aβ42 снижалась относительно контроля (рис. 1б). В образцах присутствовали только гранулярные частицы, а фибриллярные образования отсутствовали. По-видимому, наблюдаемые структуры являются комплексами мономеров или олигомеров Aβ42 и фуллеренола, что предотвращает образование зрелых амилоидных фибрилл и останавливает амилоидогенез. Действительно, показано, что фуллерены ингибируют агрегацию Aβ на ранней стадии, специфически связываясь с его центральным гидрофобным мотивом, KLVFF [18].

Исследование нейропротекторных свойств С₆₀(OH)₃₀in vivo проводили на модели БА Drosophila melanogaster. На первом этапе работы оценивали продолжительность жизни животных (рис. 2).

Рис. 2.

Кривые выживаемости Drosophila melanogaster линии elav;Ab при добавлении фуллеренола С₆₀(ОН)₃₀ в корм.

Из графиков на рис. 2 видно, что фуллеренол С₆₀(ОН)₃₀ не оказывает токсического воздействия на мух линии Ab. Напротив, при использовании дозы 2.0 мг/мл наблюдается достоверное увеличение 50%-ной выживаемости мух (32 дня в контроле и 43 дня при добавлении в корм фуллеренола), что говорит об улучшении качества жизни животных.

Был проведен анализ влияния С₆₀(ОН)₃₀ на нарушение поведенческих функций, наблюдаемых у мух elav;Ab. Анализ поведения заключался в оценке доли 30-дневных мух, преодолевающих условную черту в тесте на отрицательный геотаксис (рис. 3). Из представленных данных видно, что при добавлении в корм фуллеренола С₆₀(ОН)₃₀ наблюдается улучшение этого показателя у мух.

Рис. 3.

Уровень отрицательного геотаксиса Drosophila melanogaster линии elav;Ab на 30-й день жизни при добавлении фуллеренола С₆₀(ОН)₃₀ в корм. Статистически значимые результаты отмечены звездочками (*p < 0.05).

В мозге мух с экспрессией последовательности Aβ42 развивается прогрессирующая с возрастом нейродегенерация, которая захватывает также фоторецепторные клетки. Нейродегенерация проявляется в виде полостей, наблюдаемых на парафиновых срезах мозга мух (рис. 4а). В то же время добавление в корм фуллеренола С₆₀(ОН)₃₀ статистически значимо снижало уровень дегенерации фоторецепторных клеток у мух GMR;Ab (рис. 4б, 4в).

Рис. 4.

Парафиновые срезы глазных долей мух линии GMR;Ab на 30-й день жизни: а – контрольный мозг мухи; б – мозг мухи, в корм которой добавляли фуллеренол С₆₀(ОН)₃₀ в концентрации 2 мг/мл. Стрелками показаны вакуоли; в – уровень дегенерации фоторецепторных клеток мух линии GMR;Ab на 30-й день жизни при добавлении фуллеренола С₆₀(ОН)₃₀ в корм (***p < 0.01).

Основным клиническим признаком БА является снижение когнитивных функций, таких как способность к обучению и память. Drosophila имеет хорошо развитую центральную нервную систему и поведенческие реакции, которые делают возможным исследовать нарушение памяти и когнитивных функций на этом модельном объекте. Анализ влияния фуллеренола С₆₀(ОН)₃₀ на показатели обучаемости (измеренные сразу после обучения) и среднесрочной памяти (измеренные через 30–60 мин после обучения) проводили на 30-й день жизни животных (рис. 5).

Рис. 5.

Квартильная диаграмма: коэффициенты обучаемости и среднесрочной памяти особей Drosophila melanogaster на 30-й день жизни при добавлении фуллеренола С₆₀(ОН)₃₀ в корм: а – коэффициенты обучаемости; б – коэффициенты среднесрочной памяти.

У мух, в корм которых добавляли фуллеренол С₆₀(ОН)₃₀, статистически значимых различий коэффициентов обучаемости и среднесрочной памяти не было обнаружено. Для этих мух значение медианы коэффициента обучаемости составило 0.35, а коэффициента памяти – 0.40.

Как было отмечено ранее, окислительный стресс является одним из маркеров БА. Многочисленные работы показывают увеличение уровня свободных радикалов в мозге больных БА [19–21]. В настоящей работе также наблюдали повышение уровня активных форм кислорода в мозге 30-дневных мух с генотипом elav;Ab, который был измерен с помощью флуоресцентного зонда H2DCF-DA. Добавление в корм фуллеренола С₆₀(ОН)₃₀ снижало уровень активных форм кислорода (рис. 6).

Рис. 6.

Уровень активных форм кислорода (АФК) у линии elav;Ab.

В последнее время появился ряд работ, посвященных изучению антиамилоидных свойств фуллеренов и их производных. Так, в [22] методом электронной микроскопии показано, что гидратированный фуллерен С₆₀ связывается с растущими амилоидными фибриллами пептида Аβ_25–35 и препятствует их дальнейшему росту. В [23] методом АСМ обнаружено, что фуллерены С₆₀ и С₁₈₀ ингибируют рост фибрилл, образованных пептидом Аβ_16–22, причем фуллерен С₁₈₀ обладает более сильным антиамилоидным потенциалом. В [9] с помощью методов флуоресцентного анализа, АСМ и компьютерного моделирования показано, что фуллеренол С₆₀(OH)₁₆ является эффективным ингибитором образования амилоидных фибрилл пептида Аβ₄₀.

Наблюдаемые в проведенном исследовании эффекты у мух, воспроизводящих признаки БА, вероятно, связаны как с подавлением агрегации Аβ фуллеренолом С₆₀(ОН)_30, так и снижением интенсивности окислительного стресса. В то же время не обнаружено влияния С₆₀(ОН)₃₀ на основные клинические проявления БА – обучаемость и память животных. В литературе представлены данные о положительных эффектах фуллеренов и их производных на эти показатели. Так, в [24] одновременное введение пептида Аβ_25–35 и фуллерена С₆₀ в мозг крыс предотвращало нейродегенерацию, вызываемую введением одного Аβ_25–35, и улучшало их способность к обучению и память. Наблюдаемые различия могут быть обусловлены методом введения наночастиц в организм. Так, фуллерен С₆₀ вводился непосредственно внутрь гиппокампа. В проведенном эксперименте С₆₀(ОН)₃₀ добавлялся в корм животным.

Таким образом, фуллерены и их производные могут рассматриваться в качестве лекарственных препаратов для терапии БА благодаря их основным свойствам: эти молекулы обладают антиоксидантной активностью и, взаимодействуя с Аβ, препятствуют его агрегации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Методом атомно-силовой микроскопии установлено, что инкубация Aβ42 с фуллеренолом С₆₀ОН₃₀ в течение 24 ч при температуре 37°C снижает агрегацию Aβ42, что указывает на его антиамилоидогенную активность.

Эксперименты in vivo показали, что добавление данного фуллеренола в концентрации 2.0 мг/мл в корм мух, в нервных клетках которых синтезировался Aβ42, приводит к достоверному увеличению 50%-ной выживаемости животных и снижению уровня дегенерации фоторецепторных клеток и активных форм кислорода. В то же время не было обнаружено влияния применения данного вещества на такие параметры, как обучение и память животных. Следовательно, фуллеренол С₆₀(ОН)₃₀ является перспективных агентом для разработки комплексной терапии БА.

Авторы выражают благодарность Алине Борисенковой за предоставленные образцы фуллеренола.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 15-29-01350).